林碧倩,劉東成,秦 波,

0 引言

微流控是集生物、材料、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、流體等學(xué)科于一體的創(chuàng)新型探索熱點(diǎn)。它不但能夠通過微通道來討論流體力學(xué),而且能夠通過微型設(shè)備控制微流體。微流控技術(shù)具有時(shí)間和空間優(yōu)勢,以及檢測速度快、分辨率高、高通量檢測、樣品消耗少、成本低等特點(diǎn),具有集成化、小型化和便攜性。借助一系列獨(dú)特的流體狀態(tài),例如層流和液滴,微流控的性能在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、診斷學(xué)、工業(yè)和其他學(xué)術(shù)領(lǐng)域都是強(qiáng)大的,是具有創(chuàng)造性功能的新技術(shù)。微流控芯片是集成的智能微系統(tǒng),便攜且易于使用[1],具有較高的靈敏度和特異性,為病原體檢測提供了通用平臺[2],并可用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、航空航天和材料加工等許多領(lǐng)域,在解決臨床問題中具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展空間。

視網(wǎng)膜變性(retinal degeneration,RD)被認(rèn)為是視力損害的常見原因,包括遺傳性和退行性眼病[3]。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是累及中央視網(wǎng)膜的進(jìn)展性退行性眼病,可分為“干性”(萎縮性)和“濕性”(滲出性或新生血管性)[4]。ARMD被視為老年人失明的首要原因,70歲以上者面臨高風(fēng)險(xiǎn);這種疾病影響著世界近9%人口的視力,隨著未來的全球人口老齡化,這一數(shù)字預(yù)計(jì)將進(jìn)一步增加[5]。為了梳理微流控芯片在ARMD領(lǐng)域的應(yīng)用和存在的問題,并思考如何進(jìn)一步促進(jìn)該技術(shù)在眼科疾病中的發(fā)展,本文總結(jié)了微流控芯片在ARMD中的研究進(jìn)展,以期為ARMD的治療和研究提供新思路。

1 微流控芯片的介紹

1.1微流控芯片的定義微流控是一門前沿綜合學(xué)科,是使用微通道來管理或控制微流體系統(tǒng)的科學(xué)和技術(shù)。微流控芯片(microfluidic chips)是微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)的主要平臺和技術(shù)裝置,由于集成化和微型化的優(yōu)勢,成為微流控探究的主要領(lǐng)域。利用特殊的微流體特性,微流控可以幫助實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)方法難以完成的精確流體控制和快速響應(yīng)。微流控芯片的最新進(jìn)展使得傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室小型化成為可能,微通道系統(tǒng)已成為高效的工具[6]。

1.2微流控芯片的構(gòu)成與材料制造微流控芯片的常用材料包括單晶硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯、玻璃、紙基等。PDMS是使用最廣泛的材料,不僅易于加工,而且具備良好的光學(xué)透明度和彈性,能夠生產(chǎn)功能部件。聚四氟乙烯具有化學(xué)惰性表面和抗黏附性,已開始用于制作微流控芯片,以解決非特異性吸附的問題。紙基具有成本低、親水毛細(xì)作用力大和比表面積大的特點(diǎn),因此特別適合用于制造便捷式微流控芯片,以滿足對廉價(jià)便攜醫(yī)療系統(tǒng)的需求。通過將疏水圖案化、縱向堆砌和其他工藝相結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)多通道研究。

1.3.1臨床診斷微流控檢測芯片系統(tǒng)通常具備樣品消耗少、檢測速度快、操作簡單、多功能集成、體積小等優(yōu)點(diǎn),因此在簡化診斷步驟、提高醫(yī)療效率、擴(kuò)大臨床診斷使用空間等方面具有巨大潛力,非常適合應(yīng)用于門急診、基層醫(yī)療機(jī)構(gòu),甚至即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-care testing,POCT)。集成微流控芯片可以縮短檢測時(shí)間,也可以最大限度地減少樣品和試劑的消耗[7-8]。由于小型化設(shè)備具有許多潛在優(yōu)勢,微流控芯片已成為新一代POCT的主流技術(shù),微型化臨床測定也已成為重要的研究領(lǐng)域[9]。

1.3.2體外模型器官芯片(organ-on-a-chip,OOAC)是十大新興技術(shù)之一,指建立在微流控芯片上的生理器官仿生系統(tǒng)[10]。作為一種微型芯片,器官芯片被用于概括活體器官的微架構(gòu)與功能[11]。2010年,Huh等[12]成功開發(fā)了第一個(gè)器官芯片——肺芯片,標(biāo)志著器官芯片初級功能化的實(shí)現(xiàn),具有里程碑意義。研究中重建了人肺中具有關(guān)鍵功能的肺泡毛細(xì)血管界面,以體外模擬肺水腫。目前,對微流控芯片的探索發(fā)展迅速,許多模型已經(jīng)開始應(yīng)用器官芯片和類器官,包括腸胃、肝臟、大腦、腎臟、心臟、血管等[13]。器官芯片越來越多地應(yīng)用于長期體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),更具生理性和預(yù)測性[14]。作為顛覆性技術(shù),器官芯片對于實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療具有重要意義[15]。

類器官芯片的研究和應(yīng)用與器官芯片類似,基于微流控技術(shù)和仿生系統(tǒng)模擬人體器官的生理?xiàng)l件[16]。這些芯片可以模擬灌注、機(jī)械和其他至關(guān)重要的參數(shù),因此能夠比傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)模型更好地模擬生理?xiàng)l件[17]。它們有望成為即時(shí)設(shè)備,減少現(xiàn)場多余儀器的使用,提供快速、準(zhǔn)確和易于使用的功能[18]。目前的微流控器官芯片技術(shù)可以模擬器官的重要功能,具有巨大的潛力[19]。眼睛是觀察大千世界的窗口,微流控芯片在眼科方向主要用于角膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、晶狀體等結(jié)構(gòu)。已有研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)3D視網(wǎng)膜類器官作為新興且快速發(fā)展的技術(shù),在視網(wǎng)膜退行性疾病的治療中前景廣闊[20]。

2 微流控芯片在ARMD中的應(yīng)用

2.1機(jī)制研究模型血視網(wǎng)膜外屏障(outer blood-retina barrier,oBRB)是重要的眼部結(jié)構(gòu)之一。在ARMD等視覺障礙的發(fā)展過程中,脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是主要病理特征之一,可能導(dǎo)致失明。我們需要oBRB的仿真三維細(xì)胞培養(yǎng)模型來更好地了解ARMD的病理生理學(xué),并研究其機(jī)制和潛在治療方法。近年來,微流控芯片被認(rèn)為可能打破體外模型開發(fā)的僵局,并有望成為疾病模型,用于研究視覺障礙的復(fù)雜機(jī)制和治療方法[21]。

Chen等[22]建立了眼底組織的簡化微流控共培養(yǎng)模型,以此闡明ARMD病理。視網(wǎng)膜細(xì)胞、Bruch膜和脈絡(luò)膜分別由人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)、多孔膜和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)代替。與靜態(tài)培養(yǎng)插入板相比,微流控系統(tǒng)既能觀測細(xì)胞間的相互影響,又提供了更符合生理要求的環(huán)境。他們邁出了第一步,在微流控設(shè)備中闡明血管生成分子機(jī)制,觀察到視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)脫離和HUVEC侵入,這與在濕性ARMD中的病理性黃斑新生血管(macular neovascularization,MNV)一致。

Chung等[23]描述了獨(dú)特的眼器官芯片模型,用于體外模擬RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體。該模型由單層RPE和相鄰可灌注血管網(wǎng)絡(luò)組成,支持oBRB屏障功能,可成功模擬CNV的發(fā)病機(jī)制并重建其形態(tài)發(fā)生:CNV穿透脈絡(luò)膜血管產(chǎn)生芽,導(dǎo)致單層RPE破裂。雖然研究中可以看到眼器官芯片在研究病理過程中的實(shí)用性,但由于模擬程度有限,模型中oBRB的滲透性和轉(zhuǎn)運(yùn)性并未達(dá)到最佳。盡管如此,該研究也再現(xiàn)了濕性ARMD的發(fā)病機(jī)制,對ARMD的防治具有重要意義。

研究表明,RPE中的外泌體可能在ARMD的病理生理學(xué)中起著重要作用[25]。Hsu等[26]使用微流控芯片技術(shù)從房水中分離出外泌體,并通過房水分析發(fā)現(xiàn)外泌體在ARMD、青光眼和角膜營養(yǎng)不良等主要致盲疾病中的新作用。盡管這種基于微流控芯片的診斷方法簡單方便,可以對房水進(jìn)行更多分析和研究,但目前的技術(shù)需要反復(fù)超速離心,增加了對時(shí)間和液體體積的要求,因此尚存在一些問題需要克服。

開業(yè)第一件事，我們就給公司樹立了一個(gè)貌似很有檔次的定位——做一家有溫度、有情懷、有歸屬感、有幸福感的新型創(chuàng)業(yè)公司。

2.2藥物作用評價(jià)

2.2.1藥效測試ARMD是眼科領(lǐng)域公認(rèn)的難治疾病之一,治療手段非常有限。濕性ARMD患者眼部血管增生異常,如果發(fā)生破裂會(huì)加重病情。幸運(yùn)的是,濕性ARMD的治療取得了重大進(jìn)展。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是新生血管形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素,抗VEGF藥物抑制新生血管、使血管正?；⒏纳苹颊咭曈X效果,目前被定為一線治療方案。微流控技術(shù)通過模擬細(xì)胞相互作用和生物學(xué)功能,為藥物篩選提供了新機(jī)會(huì)[27],可用于測試藥物效果,為ARMD的防治提供科學(xué)依據(jù)。

Chung等[23]提出使用3D微流控技術(shù)培養(yǎng)仿生模型。該模型通過模仿RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體,可以在體外直接模擬CNV。研究中使用治療CNV的臨床藥物貝伐單抗來模擬病理性血管的緩解,驗(yàn)證了治療性抗血管生成藥物對CNV的抑制作用,并證明了微流控系統(tǒng)作為體外藥物評價(jià)平臺的實(shí)用性。同時(shí)表明,血-視網(wǎng)膜屏障微流控芯片不僅可以研究發(fā)病機(jī)制,還可以再現(xiàn)治療過程。

2.2.2藥物輸送許多眼病如ARMD、糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)、青光眼等,需要通過滴眼液或玻璃體腔給藥進(jìn)行終身治療以維持視力,并且需要頻繁給藥以維持藥物濃度[28]。植入式藥物輸送裝置將減少并發(fā)癥,提供可控輸送和有效藥物使用,并避免頻繁注射引起相關(guān)副作用。由于能夠制造尺寸低至數(shù)十微米的復(fù)雜設(shè)備,微流控在藥物輸送應(yīng)用領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展,從而提高了藥物的有效性和安全性。

Goudie等[29]調(diào)查了三種用于眼內(nèi)藥物輸送的可再填充微流控裝置,使用兩種模型藥物在體外測試,并與理論遞送速率進(jìn)行比較。結(jié)果表明,裝置的表面化學(xué)性質(zhì)對模型藥物遞送速率無顯著影響,所有裝置都成功提供了恒定藥物日劑量?；谶@些結(jié)果,目前正在研究將這些設(shè)備縮放為可植入模型,為ARMD患者提供更精確的藥物釋放。

2.3臨床轉(zhuǎn)化探索

2.3.1移植替代治療ARMD是oBRB關(guān)鍵組織功能障礙的結(jié)果,通過OCT可以觀察到異常的RPE細(xì)胞。視網(wǎng)膜變性不可逆,退化的視網(wǎng)膜細(xì)胞不能在人體內(nèi)自發(fā)再生,目前仍未建立有效的治療方案。作為挽救視覺功能的策略,移植替代治療有望解決視網(wǎng)膜細(xì)胞損害的難題,如ARMD、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)等,是一種前景廣闊的治療方法。

Lu等[30]報(bào)告了聚對二氯甲苯(parylene-C)微機(jī)械裝置作為人工Bruch膜在ARMD治療中的應(yīng)用。為了便于手術(shù)植入,parylene-C/SU-8混合微流控裝置被設(shè)計(jì)為插入器。蘇木精-伊紅染色和免疫熒光染色表明,植入的RPE細(xì)胞很好地黏附在人工Bruch膜上,并能在體內(nèi)保持高活力和正常形態(tài)。該研究通過驗(yàn)證亞微米厚的parylene-C膜具有與健康Bruch膜相似的滲透性,證實(shí)了用其作為人工Bruch膜替代基質(zhì)的可行性。

Meurs等[31]提取患者的脈絡(luò)膜新生血管膜后,在黃斑下移植自體外周RPE細(xì)胞并增強(qiáng)其黏附性,驗(yàn)證了替代療法的理論。該研究證明了無菌移植自體外周RPE細(xì)胞在技術(shù)上的可行性,表明替代療法具有治療ARMD的潛力,但由于部分患者發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥,移植替代效果并不理想,這種嘗試已經(jīng)停止。促進(jìn)黃斑下移植RPE細(xì)胞的存活還需要不斷地探索和優(yōu)化。

視網(wǎng)膜細(xì)胞來源于多能干細(xì)胞,如視網(wǎng)膜類器官(retinal organoids,ROs)、RPE細(xì)胞、感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs),它們?yōu)樘娲委熖峁┝藷o限的細(xì)胞來源[32]。McLelland等[33]將視網(wǎng)膜類器官薄片移植到嚴(yán)重RD的免疫缺陷大鼠,結(jié)果表明,移植的薄片分化、整合并產(chǎn)生功能性感光器和其他視網(wǎng)膜細(xì)胞,表明移植人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)衍生的視網(wǎng)膜類器官是恢復(fù)RD晚期患者視力的潛在治療方法。

然而,由于ARMD病程進(jìn)展緩慢,并伴隨衰老過程,需要長期觀察和參考各種藥物及干預(yù)措施的有效性,移植替代療法也存在倫理和安全限制,這使得有效且安全的療法很難制定[34]。在進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療前,還需要更多的研究和驗(yàn)證。

2.3.2化學(xué)神經(jīng)調(diào)節(jié)ARMD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚不明確。通常認(rèn)為ARMD是多因素感光系統(tǒng)眼病,患者視力喪失的根本原因是光感受器的進(jìn)行性損傷,這可能是RPE功能障礙和萎縮引起的[35]。在感光細(xì)胞退化的情況下,人工視網(wǎng)膜可以通過電刺激恢復(fù)基本視力,但由于電流是固有的非自然刺激,難以實(shí)現(xiàn)高空間分辨率。理論上,基于微流控的化學(xué)神經(jīng)調(diào)節(jié)策略可以模擬光感受器功能來調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜,為ARMD的治療提供新啟示。

Rountree等[36]研究了使用谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì) (一種視網(wǎng)膜自然突觸通訊的主要媒介)作為電流仿生化學(xué)替代品的可行性,對感光器退化的視網(wǎng)膜進(jìn)行神經(jīng)調(diào)節(jié)。他們使用微流控設(shè)備將少量谷氨酸注入20個(gè)大鼠的視網(wǎng)膜下,以在體外完成單部位和多部位刺激。盡管結(jié)果表明用神經(jīng)遞質(zhì)對退化的視網(wǎng)膜進(jìn)行化學(xué)刺激是有效的治療策略,但化學(xué)神經(jīng)調(diào)節(jié)概念在動(dòng)物體內(nèi)模型中的適用性目前還未得到進(jìn)一步證實(shí)。

以上研究結(jié)果表明,通過將ARMD模型與微流控芯片結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)多功能模型,更好地模擬ARMD的體內(nèi)情況,并有潛力去研究機(jī)制和指導(dǎo)治療。Wu等[37]認(rèn)為3D模型需要整合RPE、血管和光感受器,并相信具有血管生成能力的視網(wǎng)膜類器官、視網(wǎng)膜芯片和器官培養(yǎng)模型將完全改變我們對ARMD等復(fù)雜視網(wǎng)膜疾病的理解。模擬人眼結(jié)構(gòu)的3D培養(yǎng)物將支持對照實(shí)驗(yàn),以研究ARMD中玻璃膜疣的形成、沉積以及黃斑萎縮或新生血管的發(fā)展,這將促進(jìn)ARMD領(lǐng)域的研究繼續(xù)推進(jìn)。

3 微流控芯片的優(yōu)勢與局限

目前,微流控芯片因樣品要求小、流體控制準(zhǔn)確、響應(yīng)速度快和大規(guī)模集成等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為在臨床診斷和疾病篩查中具有發(fā)展?jié)摿?。?bào)告系統(tǒng)靈敏度、多通道檢測等是影響芯片進(jìn)入臨床的關(guān)鍵因素。在組織分析及疾病建模中,微流控器官芯片已成為一個(gè)強(qiáng)有力的工具[38]。

盡管微流控裝置與傳統(tǒng)裝置相比顯示出實(shí)踐上的優(yōu)勢,其進(jìn)一步應(yīng)用仍有一定局限性。在大規(guī)模推廣之前,還有一些實(shí)際問題需要解決。(1)通過預(yù)定方法設(shè)計(jì)并建立的微流控芯片模型,在模擬人體病理過程時(shí),結(jié)構(gòu)、條件和功能的實(shí)時(shí)變化程度是有限的[39]。(2)微流控裝置的主要材料PDMS已被證明具有吸附疏水性小分子的能力,這可能會(huì)顯著改變?nèi)芤簼舛炔⒂绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果[40]。此外,由于每個(gè)芯片的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到困難[41]。因此,還有待制定標(biāo)準(zhǔn)化使用策略和讀數(shù),這對于準(zhǔn)確評估藥物效果和治療結(jié)果至關(guān)重要。微流控芯片屬于新興技術(shù),盡管如此,仍需要進(jìn)一步探索來開發(fā)更強(qiáng)大的設(shè)備,以更好地促進(jìn)ARMD的研究。

4 展望

目前,微流控芯片在醫(yī)療領(lǐng)域的研究取得了一些進(jìn)展,引起了醫(yī)學(xué)界和工業(yè)界的高度關(guān)注。微流控芯片在ARMD乃至眼科領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景,未來勢必將改變我們體外研究眼病的方式,并提出全新的解決方案,以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的局限性。此外,這項(xiàng)技術(shù)還為我們研究患者異質(zhì)性引起的疾病表現(xiàn)個(gè)體差異提供了可能性[42]。綜上所述,微流控芯片技術(shù)為ARMD的研究提供了光明前景,其潛在應(yīng)用價(jià)值仍有待進(jìn)一步挖掘。我們相信微流控芯片是新環(huán)境下應(yīng)對各種挑戰(zhàn)的有力手段,未來其臨床價(jià)值將愈發(fā)突出,對解決臨床問題起到巨大推動(dòng)作用。