徐 艷,柯 珂,姜發(fā)軍,賴俊翔,3,鄒 杰,曾夢清,張秀國,陳瑞芳,3**

(1.廣西科學(xué)院,廣西北部灣海洋研究中心,廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室,廣西南寧 530007;2.廣西海洋研究所有限責(zé)任公司,廣西北海 536000;3.北部灣海洋產(chǎn)業(yè)研究院,廣西防城港 538000;4.北海萬博生物科技有限公司,廣西北海 536000)

織錦巴非蛤(Paphiatextile)隸屬軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)簾蛤目(Veneroida)簾蛤科(Veneridae)巴非蛤?qū)?Paphia),主要分布在中國廣東、廣西、福建、臺灣和馬來西亞,該貝適應(yīng)性強、養(yǎng)殖周期短、產(chǎn)量高、肉質(zhì)鮮美,深受消費者的喜愛,在民間有“花甲王”之美稱,非常適合人工養(yǎng)殖[1-3]。

織錦巴非蛤的自然資源量正逐年銳減,開展織錦巴非蛤苗種人工規(guī)?；庇驮鲳B(yǎng)殖,是決定其能否實現(xiàn)大規(guī)模人工養(yǎng)殖的關(guān)鍵[4],對補充其自然種群資源及豐富人民日益增長的海產(chǎn)品需求具有重要意義[5,6]。單胞藻作為雙殼貝類幼蟲培育的重要餌料,是影響其生長速率和存活率的主要因素之一,已有研究表明,優(yōu)化單胞藻投喂種類、分析單胞藻營養(yǎng)價值等方式均有利于提高貝類幼蟲培育生長速率及其存活率[1]。

由于不同種類的微藻具有不同的營養(yǎng)組成[7-10],所以貝類體內(nèi)的營養(yǎng)組分會隨著餌料的變化而改變[11-14]。餌料微藻中含有大多數(shù)水產(chǎn)動物幼體不能自行合成的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids,PUFAs),其中二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)可以促進(jìn)幼體的生長發(fā)育并提高存活率[15-17],其含量是評價餌料營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。餌料微藻的營養(yǎng)價值在一定程度上取決于脂類尤其是脂肪酸的組成,適宜的脂肪含量和平衡的脂肪酸組成對貝類幼蟲的健康生長至關(guān)重要[18,19]。

近年來,許多學(xué)者對織錦巴非蛤開展了廣泛研究,主要集中在生理生態(tài)[2,20]、食品應(yīng)用[21-23]和基因表達(dá)[24,25]等方面。廣西海洋研究所有限責(zé)任公司已成功突破織錦巴非蛤的規(guī)模化人工繁育技術(shù),在室內(nèi)可控條件下,常規(guī)投喂3種優(yōu)良的單細(xì)胞餌料微藻球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和青島大扁藻(Tetrasemishelgolandica),可以批量獲得大量織錦巴非蛤稚貝。本研究旨在系統(tǒng)地檢測和鑒定織錦巴非蛤稚貝和3種常規(guī)餌料微藻的脂質(zhì)組成,并分析其脂肪酸(Fatty Acids,FAs)的含量和組成特點,獲得參考價值較高的FAs參數(shù),再結(jié)合描述性統(tǒng)計方法評價其整體差異和自然聚類特征,比較不同餌料微藻與織錦巴非蛤脂肪酸組成的相關(guān)性,為織錦巴非蛤人工育苗生產(chǎn)中餌料的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

離心機(KR 25i,法國Thermo Fisher Scientific公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(NE-1101,日本Rikakikai公司);37種脂肪酸甲酯混標(biāo)(AU28-W,美國Nu-Chek公司);氣相色譜儀(GC-2010 Plus,日本Shimadzu公司);質(zhì)譜儀(GC MS-TQ 8040,日本Shimadzu公司);14% BF3-CH3OH溶液(美國Alltech公司);正己烷(色譜純,美國Tedia公司);二氯甲烷、甲醇均為分析純,購自成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 織錦巴非蛤稚貝

織錦巴非蛤稚貝取自廣西海洋研究所有限責(zé)任公司海水增養(yǎng)殖試驗基地。獲得織錦巴菲蛤初孵幼蟲(D形幼蟲)后,在1-8 d投喂球等鞭金藻和牟氏角毛藻,以球等鞭金藻為主,投喂密度為5 000-10 000個/mL;孵化8 d后增加投喂青島大扁藻,投喂密度為2 000-10 000 個/mL;孵化10 d后在幼蟲伸足時投放附著基,隨機投喂3種單胞藻類,日投喂2-3次,以2 h內(nèi)濾清為準(zhǔn),28 d后附著苗全部脫板,即為織錦巴非蛤稚貝?？楀\巴非蛤稚貝不投餌饑餓12 h后,取出洗凈,控水后分裝為兩部分,一部分直接浸泡提取脂溶性成分,為織錦巴非蛤(濕)樣品,另一部分曬干后再提取,為織錦巴非蛤(干)樣品。

1.1.3 餌料微藻

餌料微藻指的是通過引種、保種后人工擴大培養(yǎng)采收的一種含球等鞭金藻、牟氏角毛藻和青島大扁藻的液體。取3種海水微藻200 mL加到1 000 mL三角燒瓶中,培養(yǎng)液采用F/2營養(yǎng)液,以硅酸鈉作為硅源,沙濾海水經(jīng)煮沸、冷卻后使用,在自然光照和溫度(25-29 ℃)條件下,培養(yǎng)至對數(shù)期后,取1.5 L用離心機去除培養(yǎng)液,收集沉淀的藻泥,然后提取脂質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 脂質(zhì)的提取

參照Folch等[26]的方法,置樣品于250 mL具塞錐形瓶中搗碎,并加入氯仿-甲醇溶液(2∶1,V/V)混合均勻,然后用分液漏斗萃取混合液,待混合液靜止分層后,收集分液漏斗底層溶液。經(jīng)反復(fù)萃取直至底層溶液無色后,在提取液中加入5 g無水硫酸鈉脫水,在45 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,得浸膏。用少量溶液轉(zhuǎn)移浸膏至小樣品瓶中,揮干,得黃色油狀脂質(zhì),保存在-20 ℃下,待分析脂質(zhì)組成。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析

樣品甲酯化:取5種脂質(zhì)提取物5 mg,加入2 mL濃度為10%的三氟化硼-甲醇(V/V)溶液,于70 ℃水浴中甲酯化處理20 min,冷卻后加入正己烷2 mL和蒸餾水,振蕩靜置10 min,分層后取上層有機相(正己烷)適當(dāng)稀釋,加入少量無水硫酸鈉,用針筒式0.22 μm微孔濾膜過濾器過濾后,用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣分析。

色譜條件:色譜柱為HP-88石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.20 μm),載氣為He,采用恒壓模式,壓力為76 kPa,不分流,進(jìn)樣量為1 μL。進(jìn)樣口和檢測器溫度為250 ℃,初始溫度為80 ℃,保持1 min,程序升溫至130 ℃,速度10 ℃/min,再以3 ℃/min 升至150 ℃,最后以5 ℃/min 升至250 ℃,并保持6 min,直至所有脂肪酸全部出峰。

質(zhì)譜條件:GC-MS接口溫度280 ℃,電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,掃描周期500次/s,質(zhì)量掃描范圍m/z30-450。操作系統(tǒng)Xcalibur,譜庫NIST 02。

1.2.3 分離與鑒定

脂肪酸甲酯經(jīng)氣相色譜石英毛細(xì)管柱分析,記錄質(zhì)譜圖,得到GC-MS總離子流色譜圖。根據(jù)質(zhì)譜圖及標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時間確定各種脂肪酸成分,且僅當(dāng)相似度大于85%的鑒定結(jié)果才予以報道,并用面積歸一化法測定其相對含量。

參照脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品,樣品的脂質(zhì)組成通過數(shù)據(jù)庫檢索,根據(jù)脂肪酸的色譜保留時間規(guī)律,同時結(jié)合基峰離子(基峰離子m/z74為直鏈飽和脂肪酸,m/z55為單烯脂肪酸,m/z67為二烯脂肪酸,m/z79為三烯及以上不飽和脂肪酸)和分子離子等特征離子進(jìn)行定性分析,并按峰面積歸一法進(jìn)行定量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 13.0對稚貝和餌料微藻的長鏈脂肪酸進(jìn)行聚類分析和主成分分析,分析5個樣品的長鏈脂肪酸組成和特征。聚類分析方法為歐式距離的系統(tǒng)聚類法;主成分分析以特征值大于1抽取因子,用Promax法進(jìn)行因子載荷矩陣的旋轉(zhuǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總脂的組成

5個樣品的GC-MS總離子流色譜圖見圖1。根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖確定各成分,并用面積歸一法測定其相對含量。從5個樣品中共鑒定出7類化合物(表1),鑒定出的化合物占總峰面積的97%以上,主要為烷烴類化合物和脂肪酸,烷烴類化合物為織錦巴非蛤稚貝脂溶性成分中的主要成分。共鑒定出51種脂肪酸,其中包括4種短鏈脂肪酸(Short-Chain Fatty Acids,SCFAs)、1種中鏈脂肪酸(Medium-Chain Fatty Acid,MCFA)、4種支鏈脂肪酸(Branched-Chain Fatty Acids,BCFAs)和42種長鏈脂肪酸(Long-Chain Fatty Acids,LCFAs)。奇鏈和支鏈脂肪酸是由織錦巴非蛤共生菌或內(nèi)生菌類產(chǎn)生[27],本研究的主要脂質(zhì)成分是長鏈脂肪酸。檢出的含硅組分可能是萃取頭涂層或色譜柱材料的污染物,不是本研究的關(guān)鍵化合物,故此處不詳細(xì)分析。

圖1 5個樣品的GC-MS總離子流色譜圖

從5個樣品中共檢測出5種短鏈脂肪酸和4種支鏈脂肪酸,短鏈脂肪酸占織錦巴非蛤(干)、球等鞭金藻、青島大扁藻和牟氏角毛藻總脂的相對百分比含量分別為38.1%、37.8%、5.87%和0.02%,未在織錦巴非蛤(濕)中檢測到短鏈脂肪酸;織錦巴非蛤(濕)、青島大扁藻和織錦巴非蛤(干)的支鏈脂肪酸占總脂的相對百分比含量分別為1.11%、0.67%、0.66%,未在球等鞭金藻和牟氏角毛藻中檢測到支鏈脂肪酸。

5個樣品中長鏈脂肪酸的組成都比較齊全(表2),包括飽和脂肪酸(Saturated Fatty Acids,SFAs)、單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acids,MUFAs)和多不飽和脂肪酸(PUFAs)。SFAs主要由C16:0和C18:0組成,MUFAs主要由C18:1組成,PUFAs主要由C18:2和C18:3組成,n3/n6 PUFAs比值基本大于2,與元冬娟等[28]的研究結(jié)果類似,牟氏角毛藻的比值最高為9.1。

表1 織錦巴非蛤和餌料微藻中的脂質(zhì)種類及相對含量

表2 織錦巴非蛤和餌料微藻的長鏈脂肪酸組成

續(xù)表

2.2 長鏈脂肪酸的組成

2.2.1 3種餌料微藻的長鏈脂肪酸組成

球等鞭金藻、牟氏角毛藻和青島大扁藻中分別鑒定出11、23和15種長鏈脂肪酸,相對百分比含量分別為4.7%、4.8%、76.7%,青島大扁藻的長鏈脂肪酸含量在3種微藻中最高(表2)。EPA+DHA含量最高的也是青島大扁藻(2.09%),牟氏角毛藻和球等鞭金藻中的EPA+DHA含量較低。

球等鞭金藻的主要脂肪酸為C14:0(0.65%)、C16:0(0.59%)、C18:4n3(1.15%)和C22:6n3(0.32%),未檢測到C20:4和EPA,n3PUFAs的含量高于牟氏角毛藻,尤其是對人體和動物體有益的DHA含量較高。

牟氏角毛藻的主要脂肪酸為C14:0(1.18%)、C16:0(0.32%)、C16:1n7(1.06%)和EPA(0.64%),主要特點是C16:1n7的含量高于C16:0,并有較高含量的C20:5n3即EPA,并且C18和C22不飽和脂肪酸的含量是3種餌料微藻中最低的。

青島大扁藻的主要脂肪酸為C16:0(19.56%)、C16:4n3(9.29%)、C18:2n6(9.56%)和C18:3n3(14.37%),C16多不飽和脂肪酸(C16PUFAs)和C18多不飽和脂肪酸(C18PUFAs)的含量都很高,分別為14.0%和25.02%,而C20多不飽和脂肪酸(C20PUFAs)的含量較低(1.5%)。

2.2.2 織錦巴非蛤的長鏈脂肪酸組成

從織錦巴非蛤中共鑒定出32種長鏈脂肪酸(表2),其中從曬干樣品中鑒定出31種,從浸泡提取的樣品中僅鑒定出24種,這兩種不同提取方式的樣品中有相同的長鏈脂肪酸23種,9種互不相同的長鏈脂肪酸中除了一種為飽和脂肪酸外,其他8種全部是多不飽和脂肪酸?？楀\巴非蛤曬干后萃取的方式與浸泡提取相比,能鑒定出更多的長鏈不飽和脂肪酸種類。

雖然織錦巴非蛤浸泡提取樣品中鑒定出的長鏈脂肪酸種類比曬干提取樣品的少,但是長鏈脂肪酸的百分比含量都比曬干提取樣品的高,特別是n3 PUFAs、n6 PUFAs和EPA+DHA的相對含量都比較高(表2)。長鏈脂肪酸占總峰面積的比例跟提取方法有關(guān),浸泡提取為24.41%,曬干后提取為17.45%,而兩者的長鏈脂肪酸含量組成均以棕櫚酸(C16:0)為最高,其次為反油酸(C18:1n9t)、亞麻酸(C18:3n3),另外還有硬脂酸(C18:0)、EPA(C20:5n3)、亞油酸(C18:2n6)和二十二碳二烯酸(C22:2n3)等(表2)。

2.3 長鏈脂肪酸的聚類分析

對比各樣品間的歐式距離值,發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻和牟氏角毛藻之間的距離值最小(3.623),青島大扁藻和牟氏角毛藻之間的距離值最大(844.996)。基于歐式距離值,采用最小鄰接法構(gòu)建樣品間的聚類圖。如圖2所示,5個樣品聚類成2個不同的組,第一組包括織錦巴非蛤(濕、干)、球等鞭金藻和牟氏角毛藻,第二組為青島大扁藻,提示織錦巴非蛤和球等鞭金藻、牟氏角毛藻的長鏈脂肪酸組成較相似。

圖2 不同樣品長鏈脂肪酸的聚類分析

2.4 長鏈脂肪酸的主成分分析及相關(guān)性分析

織錦巴非蛤和餌料微藻中長鏈脂肪酸的主成分分析結(jié)果見圖3,主要分為主成分1(60.8%)和主成分2(23.0%),2個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為83.8%,說明提取的信息能反映原始數(shù)據(jù)大部分信息?？楀\巴非蛤、球等鞭金藻、青島大扁藻與主成分1顯著相關(guān),而球等鞭金藻、牟氏角毛藻與主成分2顯著相關(guān)。一些主要的脂肪酸成分的載荷圖顯示,棕櫚酸(C16:0)、亞麻酸(C18:3n3)、反油酸(C18:1n9t)、亞油酸(C18:2n6)、硬脂酸(C18:0)與主成分1顯著正相關(guān),這些成分可作為織錦巴非蛤和青島大扁藻的特征脂肪酸成分,而十八碳四烯酸(C18:4n3)與主成分2顯著相關(guān),可作為球等鞭金藻和牟氏角毛藻的特征脂肪酸組分。

圖3 織錦巴非蛤和餌料微藻長鏈脂肪酸、主要長鏈脂肪酸主成分分析載荷圖

3 討論

脂類是由脂肪和類脂化合物組成的一種復(fù)雜的混合物,因此想要完全將樣品中的脂類提取出來是非常困難的,僅能通過采用適宜的方法將盡可能多的脂類提取出來。本研究表明,織錦巴非蛤曬干后提取的方式與浸泡提取相比,能鑒定出更多的不飽和脂肪酸種類,但是脂肪酸的百分比含量不如浸泡提取的高(曬干后提取為17.45%,浸泡提取為24.41%),特別是n3 PUFA、n6 PUFA和EPA+DHA的相對含量。

海洋微藻的脂質(zhì)含量和脂肪酸組成因藻種不同而異[29],均有其特定的脂肪酸,是許多PUFAs的重要來源[30]。本研究的3種餌料微藻中,青島大扁藻的PUFAs相對含量最高,為42.19%,球等鞭金藻和牟氏角毛藻的PUFAs相對含量差別不大,分別為2.29%和1.88%。球等鞭金藻的長鏈脂肪酸組成與蔣漢明等[31]和楊秀霞等[32]的研究結(jié)論類似;對牟氏角毛藻等硅藻特征脂肪酸的研究較多[32-34],其結(jié)果與本研究結(jié)果接近;青島大扁藻的長鏈脂肪酸組成結(jié)果與大多數(shù)已報道的綠藻綱海藻(包括大型藻)的研究資料吻合。一般認(rèn)為綠藻綱海藻脂肪酸組成的最大特點是具有高水平的C16:4n3和C18:3n3,這在其他類型微藻中較為少見,可以作為綠藻綱海藻微藻的標(biāo)記脂肪酸[7];C18:3n3被認(rèn)為是生物合成C20:5n3等C20 PUFAs的前體,它的積累是綠藻綱海洋微藻細(xì)胞中脂肪酸合成的一個特變,即從C18到C20的延伸過程受抑制[35]。

眾所周知,食物對海洋生物的脂質(zhì)組成有重要影響[36,37]。本研究中織錦巴菲蛤總脂的組成與郝曉敏等[38]的研究結(jié)果一致,雖然織錦巴非蛤和球等鞭金藻、牟氏角毛藻的長鏈脂肪酸組成較相似,但是織錦巴非蛤、青島大扁藻與主成分1顯著相關(guān),棕櫚酸(C16:0)、亞麻酸(C18:3n3)、反油酸(C18:1n9t)、亞油酸(C18:2n6)和硬脂酸(C18:0)可作為其特征脂肪酸成分。結(jié)果表明,青島大扁藻更能滿足織錦巴非蛤稚貝期的脂質(zhì)營養(yǎng)需求,是培育織錦巴非蛤稚貝的優(yōu)良餌料。

對于大多數(shù)貝苗的繁育而言,牟氏角毛藻是一種優(yōu)良的餌料微藻[39-41]。絕大多數(shù)貝類在育苗的浮游階段,球等鞭金藻都是其他微藻不可替代的優(yōu)質(zhì)餌料[13,14,42],但是隨著稚貝的成長,投喂球等鞭金藻的餌料效果慢慢低于投喂牟氏角毛藻或者青島大扁藻的餌料效果,因此時的球等鞭金藻營養(yǎng)已經(jīng)不能滿足較大稚貝的生長需求,對于織錦巴非蛤稚貝的培養(yǎng),建議以投喂青島大扁藻為主的同時混合投喂牟氏角毛藻和球等鞭金藻。本研究結(jié)果為織錦巴非蛤人工育苗過程中稚貝期的餌料選擇提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。