朱帥旗 張帆 詹思建 段海瀟 王迪 胡翰 汪洋 劉濱磊

［收稿日期］20211129

［第一作者］朱帥旗（1996-），男，河南商丘人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向為生物工程

［通信作者］劉濱磊（1962-），男，湖北武漢人，湖北工業(yè)大學(xué)教授，研究方向為生物制藥

［文章編號］1003-4684（2023）02-0052-05

［摘要］細胞系表達的CD19可被靶向CD19的嵌合抗原受體（CAR）特異性識別。為探究靶向CD19 CAR-T抗腫瘤療效及機制提供可靠穩(wěn)定的靶細胞系，運用Lipofectamine 3000TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pPBDP-CD19和pSPBT質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細胞。嘌呤霉素（Puro）篩選，穩(wěn)定細胞株A549-CD19單克隆細胞由有限稀釋法得到；RT-qPCR鑒定A549-CD19細胞系中CD19 mRNA的表達；流式細胞術(shù)檢測A549-CD19中CD19的表達；MTS法比較改造前后細胞系的生長活性變化。經(jīng)Puro抗性篩選和挑取單克隆，得到4個A549-CD19單克隆細胞；RT-qPCR鑒定A549-CD19細胞系均有CD19 mRNA高表達；流式檢測單克隆細胞系陽性率均達到99%；MTS法檢測發(fā)現(xiàn)A549-CD19細胞系與親本細胞A549細胞具有一致的生長活性。運用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達CD19的A549-CD19細胞系成功，為評估靶向CD19實體瘤CAR-T療效提供靶細胞，奠定CAR-T細胞抗實體瘤療效機制研究基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］A549細胞; PiggyBac; CD19; 綠色熒光蛋白

［中圖分類號］R153? ［文獻標識碼］A

人CD19是由胞外N末端、跨膜結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)C末端組成的跨膜糖蛋白，其大小為95kd，在多數(shù)B細胞中極其保守，但在多數(shù)慢性和急性B淋巴細胞白血病及B細胞淋巴瘤中過表達[1]。CD19作為關(guān)鍵標記物已被用于白血病、淋巴瘤及免疫疾病的診斷預(yù)后評判指標，也為治療這些疾病提供了靶點[2]。多個靶向CD19的雙特異性抗體與CAR-T細胞免疫療法已在臨床試驗中取得進展[3，臨床實驗也證實其良好的療效，但其在實體瘤組織中的療效研究較少。據(jù)Schmidts A等報道，CAR-T抗實體瘤具有可行性[4]。此外，Chaurasiya S等人發(fā)現(xiàn)J2R CAR-T在肺癌模型中具有優(yōu)異的抗腫瘤活性[5]。新英格蘭雜志報道了CAR-T細胞療法治療惡性膠質(zhì)瘤晚期患者案例，經(jīng)多次輸注CAR-T細胞后，患者病癥得到完全緩解，這啟示了CAR-T療法在實體瘤具有可行性[6]。

限于CD19大多表達在血液淋巴瘤，而淋巴瘤細胞多存在于病人血液內(nèi)，為研究CAR-T的抗腫瘤機制帶來了不便。而實體瘤細胞具有體外易培養(yǎng)與體內(nèi)易成瘤的特點，便于評估CAR-T抗實體瘤療效機制。人非小細胞肺癌A549細胞系作為常用腫瘤研究細胞模型，在肺癌研究中最具代表性[7- 8]，因此本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定表達CD19的NSCLC細胞系以便于后續(xù)CAR-T抗實體瘤療效機制研究。

此外，用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的常見載體有慢病毒載體和轉(zhuǎn)座子載體，本研究采用的是實驗室前期開發(fā)的PiggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒系統(tǒng)。本研究使用帶有CD19基因的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒和表達轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒，將帶有CD19基因的轉(zhuǎn)座序列轉(zhuǎn)座至A549細胞染色體上，實現(xiàn)細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)。此外，綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）具有探針的特性，作為報告基因標記特定分子或細胞為科學(xué)研究提供極大便利[10]。在本研究中，GFP作為熒光標記，在細胞系篩選、單克隆挑選等步驟起重要作用。

本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達CD19的A549細胞系，旨在為評估靶向CD19實體瘤CAR-T療效機制提供理想靶細胞模型。

1??? 實驗材料

從北京協(xié)和醫(yī)院細胞中心獲得A549細胞；用DME/F-12（HyClone， USA）培養(yǎng)A549細胞；于浙江天杭生物購買FBS。從Thermo Fisher Scientific購買Lipofectamine3000TM轉(zhuǎn)染試劑盒；PiggyBac Dual Promoter-CD19重組質(zhì)粒和Super PiggyBac Transposase（pSPBT）轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒由本實驗室改造并保存。無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購于TIANGEN公司。嘌呤霉素（Puro）與MTS分別購于碧云天生物和Promega公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)由本團隊自主制備。RNA抽提和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒于TIANGEN和Vazyme購買，SYBR Green熒光染料于TOYOBO公司購買。PE Anti-CD19抗體于Abcam公司購買。流式細胞檢測儀（BD）；體視熒光顯微鏡（Nikon公司）；熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific），多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific）；北京東聯(lián)哈爾二級生物安全柜。

2??? 實驗方法

2.1??? 質(zhì)粒提取

于-80℃超低溫冰箱中取出甘油保存的PiggyBac Dual Promoter-CD19（即pPBDP-CD19質(zhì)粒菌，由實驗室成功構(gòu)建），將解凍菌液以1∶1000的比例接種至LB液體培養(yǎng)基中，加入Amp使其終濃度為100 μg/mL，37℃，200 r/min搖菌14 h。使用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒并測濃度和純度。

2.2??? 細胞對嘌呤霉素的敏感性實驗

收集A549細胞并離心（500×g， 5 min），離心后重懸細胞并計數(shù)。細胞鋪24孔板（1.5×105個/孔），于37℃，5% CO2，濕潤的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。次日于細胞孔中加入梯度濃度的Puro，之后每天觀察細胞貼壁百分比并做記錄，共計6 d。期間每2d換含Puro的新鮮培養(yǎng)基，在第4天確定A549細胞的最低致死濃度[11]。

2.3??? 細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，用EDTA-胰酶消化A549細胞，終止消化后收集細胞懸液至離心管，于500×g下離心5 min后棄上清重懸計數(shù)。之后調(diào)整細胞密度，接種至24孔板，1.5×105個/孔，將細胞放入細胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第2天當(dāng)細胞匯合度達到70%～80%時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染： 按Lipofectamine3000TM轉(zhuǎn)染試劑說明書以m（pPBDP-CD19-GFP） ∶m（pSPBT）=5∶1的質(zhì)粒質(zhì)量比轉(zhuǎn)染A549細胞[12]。用體視熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染48 h后細胞的GFP表達率。

2.4??? 抗性篩選與A549-CD19單克隆細胞系挑選

A549細胞轉(zhuǎn)染48 h后，按確定的最低致死濃度篩選轉(zhuǎn)染細胞。其間，每2天換一次含Puro的新鮮培養(yǎng)基，待所剩細胞均表達GFP時進行單克隆挑選。將孔板內(nèi)細胞消化后計數(shù)，根據(jù)計數(shù)的細胞密度進行梯度稀釋，稀釋密度為500個/mL。96孔板預(yù)加100 μL培養(yǎng)基，接種細胞，每孔2 μL細胞懸液。96孔板放入細胞培養(yǎng)箱，24 h后記錄單個細胞孔。待細胞克隆形成后于體視熒光顯微鏡下判斷表達GFP情況，篩選出表達GFP細胞克隆并將其擴大培養(yǎng)，依次擴培到24孔板、12孔板、6孔板、T25培養(yǎng)瓶中。

2.5??? RT-qPCR檢測A549-CD19單克隆細胞系CD19 mRNA的表達

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取GAPDH和CD19基因轉(zhuǎn)錄mRNA序列并設(shè)計SYBR熒光染料定量PCR引物，送基因公司合成備用。分別取A549-CD19、A549細胞鋪6孔板，6×105個/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第二天RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA，并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進行相對RT-qPCR，GAPDH作為內(nèi)參，檢測CD19轉(zhuǎn)錄水平的相對表達，使用2-ΔΔCt法[ΔΔCt=（Ct樣品-Ct GAPDH）-（Ct 對照-Ct GAPDH）]進行數(shù)據(jù)處理分析[13]。其中CD19的定量引物為：F：ACT-GACCATCATCAAGGA，R：ACCACCGTAGTAATAATGTT；GAPDH的定量引物為：F： CTCTGGTAAAGTGGATATTGT，R： GGTGGAATCATATTGGAACA。

2.6??? 流式細胞術(shù)檢測A549-CD19單克隆細胞系CD19的表達

準備約106個的A549-CD19和A549細胞上機進行流式細胞檢測，其中A549作為對照細胞。胰酶消化并用完全培養(yǎng)基終止消化，將細胞懸液收集到1.5 mL EP管中，于500×g下離心5 min，棄上清并用PBS重懸細胞。使用PBS清洗細胞1次，最后用500 μL PBS重懸，此時細胞密度約2×106 個/mL。之后加入偶聯(lián)PE的CD19抗體與細胞避光孵育30 min，孵育完成后使用PBS清洗細胞3次，重懸細胞[14]。細胞懸液經(jīng)細胞濾網(wǎng)過濾，同時設(shè)置流式細胞儀檢測通道為GFP和PE雙通道、設(shè)置細胞上樣的上限數(shù)為5×105個。最后將細胞懸液上機檢測，收集數(shù)據(jù)。PE的相對熒光強度作為CD19表達的量化指標。

2.7??? MTS法檢測A549-CD19細胞系增殖活性

選取表達較高的A549-CD19-3細胞系進行增殖活性測定。取一定量的A549與A549-CD19-3細胞，計數(shù)后鋪96孔板，每個孔板接種對應(yīng)細胞懸液100 μL（2×104個），每種細胞三個復(fù)孔，鋪5塊96孔板。培養(yǎng)過夜按0? h計，分別于0，24，48，72，96 h后測定細胞活性。MTS檢測步驟如下：于空白培養(yǎng)基和細胞所在孔中分別加入MTS溶液20 μL，包裹錫紙于細胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。4 h后多功能酶標儀待測樣品孔490 nm波長下的吸光度。

3??? 實驗結(jié)果

3.1??? A549-CD19細胞系構(gòu)建

pPBDP-CD19-GFP質(zhì)粒構(gòu)建如圖1所示。其中CD19 cDNA全長1671 bp，并且受上游CMV啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控?？剐曰騊uroR和標記基因GFP之間通過T2A序列連接并受EF1α啟動子調(diào)控。

3.2??? A549細胞對嘌呤霉素敏感性分析

圖2展示的是A549細胞在Puro（1～10 μg/mL）作用下的致死曲線。結(jié)果表明，經(jīng)Puro處理4 d后，4 μg/mL的劑量即可觀察到細胞完全死亡，因此后續(xù)篩選轉(zhuǎn)染細胞的濃度確定為4 μg/mL。

3.3??? pPBDP-CD19與pSPBT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)A549細胞

pPBDP-CD19轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒與pSPBT輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞48 h后，于體視熒光顯微鏡藍色激發(fā)光下可以觀察到GFP的表達，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達且效率在30%左右（圖3）。

3.4??? A549-CD19細胞單克隆挑選

經(jīng)過Puro抗性篩和單克隆細胞挑選并將細胞培養(yǎng)4 d后，得到4個表達GFP的A549-CD19單克隆細胞團。圖4是于熒光顯微鏡明場和暗場下拍攝的結(jié)果。

3.5??? CD19 mRNA在A549-CD19細胞系中高表達

收集單克隆細胞系并對其CD19 mRNA的轉(zhuǎn)錄進行熒光相對定量。如圖5所示，4個A549-CD19單克隆細胞系相較于A549細胞有2000多倍的表達，表明CD19 mRNA在A549-CD19單克隆細胞系中高表達。

3.6??? CD19在A549-CD19細胞系中具有高表達

以A549細胞作為對照，流式細胞術(shù)檢測A549-CD19單克隆細胞系的純度及CD19在細胞膜上的表達。如圖6a所示，4個單克隆細胞系的GFP與PE-CD19的雙陽率均高于99%，表明A549-CD19細胞系的純度很高。另外，通過PE-CD19單通道的平均熒光強度即MFI判斷CD19的表達情況（圖6b），CD19-PE的MFI均達到99.9%，表明CD19在A549-CD19細胞系中的表達豐度很高。綜上，A549-CD19細胞系構(gòu)建成功。

3.7??? A549-CD19細胞系具有與親本A549細胞一致的生長活性

從A549-CD19-2和A549-CD19-3兩個細胞系中隨機選取A549-CD19-3單克隆細胞系進行增殖活性比較。如圖7所示，根據(jù)MTS溶液加入細胞4 h后的490nm處吸光度值顯示，A549-CD19-3細胞系在0、24、48、72、96 h時間點的吸光度值與親本細胞的吸光度值差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5），CD19的表達對細胞增殖活性基本無影響。

4??? 結(jié)論與討論

運用LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)pPBDP-CD19質(zhì)粒與pSPBT質(zhì)粒至A549細胞中，構(gòu)建了表達CD19的人非小細胞肺癌單克隆細胞系即A549-CD19，而后運用RT-qPCR和流式細胞術(shù)成功檢測到CD19的轉(zhuǎn)錄表達。

B細胞抗原受體CD19作為膜上免疫球蛋白共受體的重要一員，在B細胞的各生長階段基本都表達，在大多急性/慢性B淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤上可以鑒定。這些特性決定了CD19是抗B淋巴惡性腫瘤CAR-T治療的最佳靶點。根據(jù)已有報道，CD19 CAR-T細胞具有靶向CD19+腫瘤細胞的特異、有效且持久的殺傷效果[15]。因此，通過建立穩(wěn)定表達CD19的人肺癌A549細胞系（即A549-CD19）為后續(xù)評估CAR-T抗實體瘤療效及機制研究提供理想的靶細胞系。PiggyBac作為高效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)之一，長期被用于體細胞誘導(dǎo)多能干細胞工程，而且不改變原基因的結(jié)構(gòu)和功能，可以為人T淋巴細胞提供持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達[16]。因此，使用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)作為穩(wěn)定遺傳修飾的技術(shù)平臺，將pPBDP-CD19質(zhì)粒與pSPBT質(zhì)粒導(dǎo)入A549細胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染后成功表達CD19的細胞對嘌呤霉素的抗性篩選陽性細胞。選擇表達CD19的單克隆細胞建立A549-CD19細胞系；轉(zhuǎn)錄水平的RT-qPCR反應(yīng)和蛋白水平的流式細胞術(shù)檢測證實CD19整合到A549基因組中并成功轉(zhuǎn)錄表達。根據(jù)MTS生長活性差異性比較，A549-CD19細胞系表現(xiàn)出與親本細胞一致的生長增殖活性。

總之，在此構(gòu)建的單克隆A549-CD19細胞系不僅為體外評估CD19-CAR改造T細胞抗實體瘤療效機制研究提供了靶細胞，同時也為后續(xù)CAR-T在動物模型體內(nèi)浸潤對抗實體瘤療效研究奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of A549 Cell Line Stably Expressing CD19 Using PiggyBac System

ZHU Shuaiqi， ZHANG Fan， ZHAN Sijian， DUAN Haixiao， WANG Di， HU Han， WANG Yang， LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food Science， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China）

Abstract：Objective： Non-small cell lung cancer （NSCLC） A549-CD19 cell line stably expressing CD19 was constructed by? PiggyBac transposon system. The CD19 expressed by the cell line can be specifically recognized and bound by the chimeric antigen receptor （CAR） targeting CD19，providing a reliable and stable target cell line for exploring the anti-tumor efficacy and mechanism of the targeting CD19 CAR-T. Methods： pPBDP-CD19 and pSPBT plasmids were transferred into A549 cells by Lipofectamine 3000TM liposome transfection， stable cell lines were screened by puromycin （Puro）， A549 CD19 monoclonal cells were obtained by limited dilution method， the expression of CD19 mRNA in A549 CD19 cell line was identified by RT qPCR， the expression of CD19 in A549 CD19 was detected by flow cytometry， and the growth activity of cell line before and after modification was compared by MTS method. Results： After Puro resistance screening and selection of clones， four A549 CD19 monoclonal cells were obtained; all A549 CD19 cell lines were identified by RT qPCR to have high expression of CD19 mRNA; flow detection showed that the positive rate of monoclonal cell lines reached 99% MTS method. It was found that the growth and viability of A549 CD19 cell line was consistent with that of parent cell A549.Conclusion： The A549 CD19 cell line stably expressing CD19 is successfully constructed， which provides target cells for evaluating the efficacy of CAR T targeting CD19 solid tumor， and lays the foundation for the study of the mechanism of CD19 CAR T cell anti-solid tumor effect.

Keywords： A549 cell;? PiggyBac; CD19; Green fluorescent protein

［責(zé)任編校： 張眾］