習(xí) 攀,王 蒨,郭俊俊,李 量,李 雅

(1.陜西省腫瘤醫(yī)院放療科,陜西 西安 710061;2.陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科,陜西 西安 710061)

胰腺癌是具有侵襲性的、惡性程度較高的癌癥之一[1]。雖然男女發(fā)病率基本一致,但相對于白種人,非裔的發(fā)病率較高[2-3]。近10年來,胰腺癌全球發(fā)病率有所增加,這可能與肥胖、人口老齡化等因素相關(guān)[3-5]。但其病死率基本保持不變,胰腺癌的發(fā)病集中在70～80歲人群[6-9]。近20年來,中國胰腺癌發(fā)病率提高了近6倍[10]。目前,約80%胰腺癌患者在確診時已是晚期,其中1/3是局部晚期,而局部晚期胰腺癌患者的中位生存時間約6～10個月。

胰腺癌手術(shù)切除率低,術(shù)后復(fù)發(fā)率較高,故化療在胰腺癌綜合治療中發(fā)揮著重要作用。但目前胰腺癌的治療效果仍欠佳,其中吉西他濱(Gemcitabine,GEM)單藥的反應(yīng)率僅28%左右[11-12]。分子靶向治療、免疫治療效果也遠(yuǎn)低于預(yù)期,故需尋找更有效的治療方法。熱療是近些年出現(xiàn)的一種嶄新的癌癥治療技術(shù),基本原理是將物理熱量投射到細(xì)胞內(nèi),從而形成熱效應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞。熱療不僅對癌癥細(xì)胞有直接殺傷效果,而且還能強化化療的敏感性,最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn),特異性蛋白1(Specific protein 1,Sp1)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)等相關(guān)基因在癌癥細(xì)胞凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。而熱化療在調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及誘導(dǎo)凋亡方面是否與Sp1、Cyclin D1、COX-2、Bcl-2等相關(guān)還有待驗證。因此,本研究探討GEM聯(lián)合熱療對胰腺癌ASPC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞與主要試劑 人胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1購自上海細(xì)胞庫;RPMI-1640培養(yǎng)基(批號:A1049105)、0.25%胰蛋白酶(批號:25200057)、磷酸鹽緩沖液(PBS,批號:1419020)、杜氏磷酸緩沖鹽溶液(DPBS,批號:1419014)購自美國Gibco公司;GEM (批號:G552001) 購自法國禮來公司;Sp1抗體(批號:PA5-29165)、Cyclin D1 抗體(批號:MA5-35331)、COX-2抗體 (批號:MA5-27783)、Bcl-2抗體 (批號:PA5-106039)購自Cell Signaling Technology (CST)公司;Transwell小室(批號:C2950)購自BD公司;MTT檢測試劑盒(批號:12-6696-42)購自美國Sigma公司;碘化吡啶(PI,批號:PA5-16661)、熒光染料DCFH-DA(批號:C2939)、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(批號:C2940)購于自Takara公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,將ASPC-1細(xì)胞懸浮并放置在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理:將ASPC-1細(xì)胞隨機分為對照組、GEM組、熱化療組。對照組無任何處理。GEM組將濃度為30 μmol/L GEM溶解在RPMI-1640培養(yǎng)基中處理ASPC-1細(xì)胞24 h。熱化療組將ASPC-1細(xì)胞置于5%加濕CO2、43 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后給予30 μmol/L GEM處理24 h。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖及活力情況:將ASPC-1細(xì)胞懸液接種于96孔板中,各組給予不同處理后在每孔中加入MTT,37 ℃孵育4 h。使用酶標(biāo)儀在562 nm處檢測OD值,并計算細(xì)胞活力。

1.2.4 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力:將ASPC-1細(xì)胞以(0.5～1)×106個/孔的密度接種于6孔板中,在無血清培養(yǎng)基中過夜。次日,用槍頭在平板中間做劃痕后培養(yǎng)48 h,顯微鏡下每24 h觀察遷移的細(xì)胞并記錄遷移距離。

1.2.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力:將ASPC-1細(xì)胞接種于Transwell上室(1×105個/孔)中,在Transwell下室中添加500 μl含20%胎牛血清的DMEM。常規(guī)條件孵育48 h后,將遷移的細(xì)胞固定并用結(jié)晶紫染色,顯微鏡下統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況:將ASPC-1細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中,收集細(xì)胞前24 h給予GEM,熱化療組給予GEM聯(lián)合熱療。取上清,清洗保留的細(xì)胞,離心后在200 μl結(jié)合緩沖液中重懸,然后與10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI在4 ℃下反應(yīng)30 min。加入300 μl緩沖液,在流式細(xì)胞儀上檢測凋亡細(xì)胞。

1.2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá):在培養(yǎng)皿中接種ASPC-1細(xì)胞后給予相應(yīng)處理。將處理后的細(xì)胞用PBS洗滌2次,使用RIPA裂解液提取蛋白。用BCA試劑盒定量測定后,在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h后與抗Sp1、CyclinD1、Bcl-2、COX-2的一抗在4 ℃下反應(yīng)過夜。用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG二抗在室溫下孵育1 h后檢測、顯影,采用Image-Pro Plus圖像分析軟件檢測條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計算相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.2.8 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá):采用1 ml TRIzol裂解緩沖液在三組處理過的胰腺癌細(xì)胞中提取總RNA。以2.5 μg總RNA為模板,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,并進(jìn)行定量PCR擴增。以GAPDH為內(nèi)參,引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算靶基因mRNA表達(dá)。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況及不同熱化療方式細(xì)胞活力比較 見圖1。MTT結(jié)果顯示,30 μmol/L GEM對ASPC-1細(xì)胞增殖有抑制作用,熱化療組抑制作用更明顯(均P<0.05);30 μmol/L GEM聯(lián)合不同的熱療方式(化療前24 h給予43 ℃熱療1 h、化療同時熱療、化療后24 h給予43 ℃熱療1 h)的細(xì)胞活力分別為(50.45±3.77)%、(61.0±2.34)%、(71.74±2.14)%,GEM前熱療對細(xì)胞抑制作用更明顯(均P<0.05)。

注:與GEM前熱療比較,*P<0.05

2.2 各組細(xì)胞遷移及侵襲能力比較 見圖2、3。劃痕實驗結(jié)果顯示,與對照組比較,GEM組、熱化療組細(xì)胞遷移能力降低,且熱化療組細(xì)胞遷移能力降低更加明顯(均P<0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示,GEM組和熱化療組細(xì)胞侵襲能力較對照組降低,且熱化療組更明顯(均P<0.05)。

注:左圖為各組細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果(×100)。右圖中,與對照組比較,*P<0.05;與GEM組比較,#P<0.05

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較 見圖4。對照組、GEM組及熱化療組ASPC-1細(xì)胞凋亡率分別為(2.15±0.11)%、(4.12±0.20)%、(11.48±1.62)%。與對照組比較,GEM組和熱化療組細(xì)胞凋亡率升高,且熱化療組高于GEM組(均P<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞Sp1、Cyclin D1、COX-2和Bcl-2蛋白表達(dá)比較 見圖5。與對照組比較,GEM組細(xì)胞Sp1、COX-2、Bcl-2蛋白水平降低(均P<0.05)。與GEM組比較,熱化療組Sp1、COX-2蛋白水平降低(均P<0.05)。

注:左圖為各蛋白電泳圖。右圖中,與對照組比較,*P<0.05;與GEM組比較,#P<0.05

2.5 各組細(xì)胞Sp1、Cyclin D1、COX-2和Bcl-2 mRNA表達(dá)比較 見圖6。與對照組比較,GEM組細(xì)胞Sp1、COX-2 mRNA表達(dá)降低(均P<0.05)。與GEM組比較,熱化療組Sp1、COX-2 mRNA表達(dá)降低(均P<0.05)。

3 討 論

熱療已在臨床實踐中用于各種腫瘤的治療,其抗腫瘤的有效性已在早期研究中得到了驗證[13-17]。隨機Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗證實了熱療治療乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、肺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤以及胃腸道癌癥和肉瘤的效果[18-22]。此外,熱化療聯(lián)合治療已成為許多Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗的主題。例如,在臨床試驗中采用的熱療聯(lián)合順鉑、紫杉醇治療晚期卵巢癌的方案取得了較好的效果[23]。熱療通過降低細(xì)胞內(nèi)pH值增加細(xì)胞膜的滲透性,從而提高了化療藥物的穿透與吸收能力。熱療對于化療也有增敏效果,主要源于熱療可以促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。化療耐藥的部分原因是由熱休克蛋白誘發(fā)的,而熱療則通過抑制部分熱休克蛋白的產(chǎn)生,從而防止化療耐藥的形成,這些在絲裂霉素、博來霉素、順鉑等藥物中得以證明[24-26]。但關(guān)于熱化療誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡的機制目前仍不清楚。

有研究[27]證實,熱療可以抑制癌癥細(xì)胞的遷徙、轉(zhuǎn)移,胃癌細(xì)胞經(jīng)42.5 ℃處理1 h后,細(xì)胞表面的分子發(fā)生變化,E-鈣黏素、B-整合素、黏附分子表達(dá)增多。研究[28-31]發(fā)現(xiàn),經(jīng)高溫(40～45 ℃,1～2 h)處理后的腫瘤細(xì)胞可表現(xiàn)為對化療藥物的敏感性顯著增加。通過局部熱療(42 ℃,30 min)聯(lián)合化療治療的胰腺癌患者,平均生存期超過單純化療的患者[32]。研究[33]發(fā)現(xiàn),熱療通過降低膀胱癌細(xì)胞P糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白1等蛋白的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)耐藥,從而實現(xiàn)對化療的增敏。Sp1在肉瘤、結(jié)腸癌和胰腺癌中均有表達(dá),研究表明Sp1在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)且可作為胰腺癌患者生存預(yù)后的負(fù)性指標(biāo)。在ⅡB期-Ⅳ期胰腺癌患者中,Sp1過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的癌癥分期有關(guān),Sp1陽性患者的總生存期大幅縮短。作為轉(zhuǎn)錄因子,Sp1與多種蛋白(Cyclin D1、Bcl-2、COX-2)表達(dá)相關(guān),這些蛋白同腫瘤增殖、侵襲、凋亡相關(guān)[34]。腫瘤細(xì)胞中Bcl-2過表達(dá)往往通過Sp1轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。在胰腺癌細(xì)胞中,Sp1表達(dá)與COX-2表達(dá)呈正相關(guān),抑制或過表達(dá)Sp1可導(dǎo)致COX-2的表達(dá)降低或升高[35]。

本研究發(fā)現(xiàn),GEM聯(lián)合熱療對胰腺癌ASPC-1細(xì)胞增殖抑制作用較為明顯。GEM聯(lián)合熱療能顯著抑制ASPC-1細(xì)胞的遷移、侵襲并進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡。為進(jìn)一步研究熱化療對ASPC-1胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲抑制并誘導(dǎo)凋亡可能的機制,本研究測定了細(xì)胞內(nèi)Sp1、Cyclin D1、Bcl-2和COX-2蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示與對照組比較,GEM組細(xì)胞Sp1、COX-2、Bcl-2蛋白水平降低;與GEM組比較,熱化療組Sp1、COX-2蛋白水平降低,并在mRNA層面上進(jìn)行了驗證。

綜上所述,GEM聯(lián)合熱療可抑制胰腺癌ASPC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)凋亡,其機制可能與抑制Sp1及其下游基因COX-2有關(guān)。