孫曉霞, 劉成虎, 朱藝馨, 屈秋錦, 阮文婷

(山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院, 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 濟(jì)南 250101)

隨著生物醫(yī)藥、工程材料等新技術(shù)的飛速發(fā)展,動(dòng)物源性醫(yī)療器械被越來(lái)越多地用于疾病治療,以實(shí)現(xiàn)修復(fù)、替代、維持或改善組織和器官功能的目的。這是因?yàn)?相較于金屬、合成高分子等人工合成材料,動(dòng)物源性醫(yī)療器械不僅具有良好的生物相容性,其廣泛的組織來(lái)源還能提供類似于人體的三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)以利于組織再生修復(fù)[1-2]。為了降低針對(duì)動(dòng)物源性成分的免疫風(fēng)險(xiǎn),在醫(yī)療器械的生產(chǎn)過(guò)程中常采用脫細(xì)胞等工藝,去除細(xì)胞等相關(guān)免疫原性成分[3-4],但由于DNA具有穩(wěn)定性,其終產(chǎn)品上仍有可能殘留宿主細(xì)胞DNA[5-6],因此早在1987年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)就將殘留DNA含量作為動(dòng)物源性醫(yī)療器械質(zhì)量控制的一項(xiàng)關(guān)鍵性能指標(biāo)[7]。

許多研究顯示動(dòng)物源性材料中殘留的DNA具有生物活性,尤其當(dāng)動(dòng)物源性材料中含有病毒感染細(xì)胞或致癌/致瘤潛能的細(xì)胞時(shí),其DNA亦可能攜帶HIV病毒或Ras癌基因等片段[8-10],從而導(dǎo)致病毒感染、致瘤和異?；虮磉_(dá)等安全性風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究認(rèn)為,DNA片段大小的減小極有可能進(jìn)一步降低DNA的風(fēng)險(xiǎn)并增加安全裕度,因?yàn)闅埩舻腄NA片段越小,存在完整癌基因和其他功能序列的可能性就越低[11-13]。由此可見,采用適宜檢測(cè)方法表征的殘留DNA水平對(duì)于保證動(dòng)物源性醫(yī)療器械的安全性和質(zhì)量可控性至關(guān)重要。

由于具有學(xué)科綜合性強(qiáng)、技術(shù)含量和附加值高的特點(diǎn),使動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品的研發(fā)成為熱點(diǎn)。盡管目前關(guān)于動(dòng)物源性醫(yī)療器械中可接受殘留DNA水平(即DNA限值)的研究仍較少,但國(guó)內(nèi)外各類監(jiān)管機(jī)構(gòu)已發(fā)布了細(xì)胞制品等生物源性材料的指導(dǎo)原則和建議要求[14-16]。隨著DNA風(fēng)險(xiǎn)研究的深入,監(jiān)管機(jī)構(gòu)也在不斷更新優(yōu)化殘留DNA限值要求,這將有助于確保動(dòng)物源性等生物材料被科學(xué)管理、安全使用。此外,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,使殘留DNA的檢測(cè)方法更加科學(xué)、準(zhǔn)確,為動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品開展合理的質(zhì)量控制提供了技術(shù)保證[17-19]。通過(guò)分析動(dòng)物源性材料中殘留DNA的潛在風(fēng)險(xiǎn),回顧和比較監(jiān)管機(jī)構(gòu)已發(fā)布的生物制品中殘留DNA的限值要求和各國(guó)藥典中收錄的殘留DNA測(cè)定方法;同時(shí)結(jié)合工藝、材料控制等充分考慮風(fēng)險(xiǎn),探討降低DNA殘留量的措施手段。旨在推動(dòng)動(dòng)物源性醫(yī)療器械生產(chǎn)技術(shù)水平提高,有效去除器械中殘留DNA,通過(guò)合理的質(zhì)量控制,正確進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)/收益評(píng)估,從而保障動(dòng)物源性醫(yī)療器械的安全使用。

1 殘留DNA的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源和潛在危害

DNA是遺傳物質(zhì)的載體,存儲(chǔ)著生物體的形態(tài)和功能信息。通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,機(jī)體代謝產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞DNA和進(jìn)入機(jī)體的外源性DNA能夠被哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取,由細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解和甲基化酶甲基化而失活,隨著細(xì)胞分裂被逐漸清理[20-21]。而未被降解的外源性DNA,特別是一些小片段DNA片段(長(zhǎng)度約500 bp)則可能進(jìn)入細(xì)胞核、插入基因組[22-23],由此產(chǎn)生的生物活性作用將導(dǎo)致不可預(yù)見的安全性風(fēng)險(xiǎn)。由于不同來(lái)源的動(dòng)物源性材料具有不同的潛在風(fēng)險(xiǎn),并且殘留DNA片段大小各異,使其風(fēng)險(xiǎn)復(fù)雜多樣。1999年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(U.S. Food and Drug Administration, FDA)在關(guān)于“細(xì)胞來(lái)源疫苗的監(jiān)管進(jìn)展”工作組會(huì)上,回顧以往生物材料使用史,指出宿主細(xì)胞中殘留DNA具有致癌性、感染性、免疫原性以及致突變性等風(fēng)險(xiǎn)[24]。

1.1 致瘤性/致癌性

殘留DNA致癌的主要機(jī)制是引入了顯性致癌基因。如果編碼癌基因的殘留DNA進(jìn)入細(xì)胞核病并激活相應(yīng)的癌基因,正常細(xì)胞會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化并分化為瘤細(xì)胞。Zheng等[12]、Sheng等[25]的研究已證實(shí)表達(dá)癌基因H-ras和c-myc的質(zhì)粒DNA可以在皮下接種后誘導(dǎo)含有這兩種癌蛋白的腫瘤形成,并且1 μg的質(zhì)粒DNA即可誘導(dǎo)新生NIH Swiss小鼠成瘤[9]。

此外,在禽類和哺乳動(dòng)物中還觀察到由于殘留DNA插入導(dǎo)致的腫瘤形成[26-30]。然而,由于不同種屬間DNA序列的異質(zhì)性和基因組復(fù)雜性[31-32],使得這種插入后發(fā)生DNA整合并且整合位置在原癌基因或抑癌基因區(qū)域的概率非常低,其中整合并活化一個(gè)癌基因的概率是10-10,而原癌基因激活和抑癌基因失活同時(shí)發(fā)生的概率是10-19[33-34]。因此,相對(duì)于插入引起的致癌性,人們更需要關(guān)注殘留DNA引入的顯性致癌基因。對(duì)殘留DNA的致癌性研究提示人們?cè)谶x擇動(dòng)物源性材料時(shí),應(yīng)盡量選取正常的二倍體細(xì)胞,避免采用連續(xù)傳代或具有致癌潛能的細(xì)胞,同時(shí)也要控制DNA殘留量和DNA片段大小,從而盡可能地降低殘留DNA的致癌性風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 感染性

殘留DNA的感染性風(fēng)險(xiǎn)來(lái)自于細(xì)胞中存在的感染性病毒基因組。研究發(fā)現(xiàn)許多病毒基因組具有感染性,例如人乳頭瘤病毒(HPV)[35]、腺病毒[36]、皰疹病毒[37]、EB病毒(EBV)[38]、乙肝病毒(HBV)[39]等,通過(guò)將病毒DNA整合到宿主細(xì)胞基因組上而產(chǎn)生感染性病毒。除了DNA病毒,外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒也具有感染性風(fēng)險(xiǎn),如來(lái)自鳥類和嚙齒動(dòng)物的逆轉(zhuǎn)錄病毒(迄今為止還未發(fā)現(xiàn)人類內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染性)。由于宿主細(xì)胞中存在的多種感染性病毒基因組,可見DNA感染性風(fēng)險(xiǎn)可能比致癌性風(fēng)險(xiǎn)更高。Sheng-Fowler等[8]、Chabot等[40]對(duì)HIV病毒DNA的研究表明,線狀DNA的感染力是環(huán)狀DNA的30～100倍,1 pg殘留線狀DNA就具有感染性,而HIV感染細(xì)胞中環(huán)狀DNA的致病劑量為2 μg?？紤]到殘留DNA的病毒感染性風(fēng)險(xiǎn),除了對(duì)動(dòng)物源性材料中病毒進(jìn)行滅活,人們還需要從殘留DNA的數(shù)量和片段方面來(lái)降低病毒感染性。

1.3 免疫原性

盡管DNA分子缺乏固定的空間結(jié)構(gòu)、不能作為抗原被抗體識(shí)別,然而當(dāng)DNA被設(shè)計(jì)成編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體,即作為DNA疫苗,外源基因可以在體內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生的抗原能夠激活機(jī)體免疫系統(tǒng)而用于免疫治療[41]。但許多研究報(bào)道,DNA免疫時(shí)可在注射局部引起非治療效應(yīng)的炎癥反應(yīng)[41-42]。這可能與DNA誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答而介導(dǎo)的免疫刺激作用有關(guān),例如根據(jù)Hornung等[43]的研究結(jié)果,細(xì)胞中的DNA能夠與酶結(jié)合形成復(fù)合物而激活天然免疫系統(tǒng),釋放炎癥小體引起發(fā)熱和局部腫脹等炎癥癥狀。此外,Mostafa等[44]研究發(fā)現(xiàn)自閉癥兒童的血液中抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體陽(yáng)性率(34%)明顯高于健康兒童(2%),提示這些抗體可能參與自閉癥兒童的自身免疫攻擊。若動(dòng)物源性材料中殘留的DNA與兒童自身的DNA序列相似或重疊,盡管這種情況的發(fā)生概率極低,但當(dāng)兒童暴露于這種非自身DNA片段時(shí),則可能會(huì)產(chǎn)生與其自身DNA相交叉的免疫反應(yīng),誘發(fā)機(jī)體免疫損傷。

1.4 致突變性

DNA插入基因組后還可能導(dǎo)致基因突變。研究發(fā)現(xiàn)X1-連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID-X1)患者接受基因治療后,常發(fā)生基因易位和突變等異常而導(dǎo)致治療失敗[45-47],提示外源性DNA片段可能被外周血干細(xì)胞攝取、引起基因突變。當(dāng)突變發(fā)生于膠質(zhì)細(xì)胞時(shí),則可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。例如,DNA雙鏈斷裂(double strand break, DSB)不僅見于紫外線、電離輻射以及烷化劑等化學(xué)性損傷,還是神經(jīng)活動(dòng)中一個(gè)關(guān)鍵且正常的過(guò)程并能被機(jī)體快速修復(fù)[48]。研究顯示,參與DSB修復(fù)的基因在自閉癥中發(fā)生了突變,導(dǎo)致錯(cuò)誤的基因重組或修復(fù)失敗[49-50]。此外近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),精神分裂癥等神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病與保護(hù)性基因缺失或異常導(dǎo)致的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能信號(hào)系統(tǒng)功能失調(diào)密切相關(guān)[51]。這些由DNA插入誘發(fā)的基因突變研究提示,盡管外源性DNA插入基因組并在特點(diǎn)位點(diǎn)整合的可能性很低[52-54],但對(duì)于本就具有基礎(chǔ)性疾病的患者或DNA代謝活躍的人群,由外源性DNA插入導(dǎo)致的基因突變風(fēng)險(xiǎn)將極大增加,引起基因重組異常或修復(fù)失敗以及多個(gè)組織器官功能障礙。

2 關(guān)于殘留DNA的法規(guī)要求

動(dòng)物源性材料作為一個(gè)快速發(fā)展的新興技術(shù)領(lǐng)域,目前尚無(wú)此類生物材料中殘留DNA規(guī)定和要求,有關(guān)殘留DNA的基本法規(guī)均來(lái)自疫苗等生物制品。在生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中,由于細(xì)胞基質(zhì)殘留的DNA可能存在致癌性、感染性等安全性問題,因此各監(jiān)管機(jī)構(gòu)(WHO、FDA及NMPA等)對(duì)殘留DNA進(jìn)行了嚴(yán)格把控,以保證生物制品的安全使用。這里匯總了過(guò)去數(shù)十年,國(guó)內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)出臺(tái)的生物制品中可接受的殘留DNA水平的法規(guī)要求。

2.1 國(guó)外

細(xì)胞等生物材料中殘留DNA的安全性風(fēng)險(xiǎn)主要與其潛在致癌性有關(guān),這是由于DNA插入基因組后可能發(fā)生癌基因激活。但最初由于研究數(shù)據(jù)有限,世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)Vero細(xì)胞來(lái)源的脊髓灰質(zhì)炎疫苗中DNA含量,采用10 pg/劑作為疫苗中殘留DNA限量[55]。之后,隨著致癌性相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的增多,研究人員假設(shè)在體內(nèi)1 ng DNA對(duì)應(yīng)的活化癌基因約為100個(gè)拷貝,由致癌性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估得出機(jī)體發(fā)生致癌性轉(zhuǎn)化的概率為10-9[56]。由此WHO的生物制品工作組推斷,100 pg DNA約對(duì)應(yīng)1個(gè)拷貝的活化癌基因,發(fā)生致癌性轉(zhuǎn)化的概率為0.5×10-10且該風(fēng)險(xiǎn)是可以忽略的,于是在1986年WHO將殘留DNA的限值提高為100 pg/劑[7, 57]。然而該限值仍較嚴(yán)格,尤其是對(duì)于某些病毒疫苗,例如某些包膜病毒常常難以符合限值要求,由此導(dǎo)致相關(guān)疫苗的生產(chǎn)成本增加、價(jià)格上漲甚至造成嚴(yán)重的市場(chǎng)短缺。進(jìn)一步的癌癥研究發(fā)現(xiàn),DNA誘導(dǎo)致癌還與基因突變、表觀遺傳等多種機(jī)制密切相關(guān)。此外,對(duì)于連續(xù)傳代的非致癌細(xì)胞,如常見的Vero細(xì)胞等,這些細(xì)胞中不太可能存在活化的顯性癌基因[58-60]。因此WHO在1997年組織專家再次討論并修改了DNA的限值,并認(rèn)為減小殘留DNA片段大小有可能進(jìn)一步降低致癌性、感染性等DNA的風(fēng)險(xiǎn)[61]。

目前WHO、美國(guó)FDA和歐洲藥典建議,生物材料的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)應(yīng)考慮原料細(xì)胞的性質(zhì)和給藥途徑。WHO和美國(guó)FDA推薦,來(lái)源于連續(xù)傳代非致瘤細(xì)胞的生物制品,當(dāng)胃腸道外使用時(shí),無(wú)論是否用于嬰幼兒,其殘留DNA應(yīng)不高于10 ng/劑,長(zhǎng)度不大于200 bp[24, 62-63]。同時(shí),基于DNA經(jīng)口和胃腸道暴露的風(fēng)險(xiǎn)差異,FDA建議將口服類疫苗的DNA殘留量放寬至100 μg/劑;以人二倍體細(xì)胞系來(lái)源(如被廣泛用于生物制品的MRC-5細(xì)胞和WI-38細(xì)胞)的生物制品,FDA不認(rèn)為其殘留DNA具有安全性風(fēng)險(xiǎn)[64]。相對(duì)于WHO,歐盟提高了嬰幼兒使用疫苗的要求,嬰幼兒疫苗≤100 pg/劑,非嬰幼兒疫苗≤10 ng/劑。歐洲藥典10.0根據(jù)最小的功能片段長(zhǎng)度,認(rèn)為<200 bp的DNA是安全的[16]。

2.2 中國(guó)

中國(guó)藥典2020年版三部規(guī)定,以大腸桿菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗和治療性生物制品,其DNA殘留量不能超過(guò)10 ng/劑;對(duì)于以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的滅活疫苗和治療性生物制品,其DNA殘留量應(yīng)低于100 pg/劑[14]。同時(shí),藥典2020年版還優(yōu)化了安全性檢測(cè)方法,除了DNA探針雜交法和熒光染色法,在通則3407“外源性DNA殘留量測(cè)定法”中新增了“定量PCR法”,通過(guò)進(jìn)一步完善生物材料的質(zhì)量控制方法,將人用狂犬病疫苗的DNA殘留量由100 pg/劑調(diào)整為3 ng/劑,然而以CHO細(xì)胞為來(lái)源的重組乙型肝炎疫苗仍保留10 pg/劑的限值要求[17]。中國(guó)現(xiàn)行2020版藥典規(guī)定檢測(cè)DNA殘留量的疫苗、生物制品及標(biāo)準(zhǔn)匯總分別如表1(疫苗)和表2(生物制品)所示[14]。

3 殘留DNA的測(cè)定方法

基于動(dòng)物源性醫(yī)療器械的安全性和質(zhì)量可控性,建立準(zhǔn)確、靈敏且特異性強(qiáng)的殘留DNA測(cè)定方法是至關(guān)重要的。各國(guó)藥典給出了數(shù)種檢測(cè)方法用于表征殘留DNA,包括DNA探針雜交法、熒光染色法定量PCR法以及基于DNA結(jié)合蛋白免疫酶法[15-17, 65-66]。這些方法可用于在產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中和成品上測(cè)定DNA殘留量和DNA片段大小。

3.1 DNA探針雜交法

供試品中的DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上,在一定條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)與特異性標(biāo)記的單鏈DNA探針退火復(fù)性、雜交形成雙鏈DNA,使用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果,顏色深度與DNA含量相對(duì)應(yīng),通過(guò)與已知含量的陽(yáng)性DNA比對(duì),計(jì)算供試品中的DNA殘留量[15, 17]。DNA探針雜交技術(shù),將已知的DNA 序列片段作為雜交探針,通過(guò)放射性或熒光標(biāo)記,能夠特異性檢測(cè)未知的DNA樣品片段及其相對(duì)大小。然而在實(shí)際操作時(shí),放射性標(biāo)記物(如32P)存在半衰期短、放射等問題,而熒光標(biāo)記的探針如果采用儀器讀取信號(hào),雜交法理論上可以達(dá)到定量檢測(cè)要求的靈敏度,但是檢測(cè)時(shí)間需要48 h;由此可見,這種方法的操作比較煩瑣、費(fèi)時(shí),操作過(guò)程中殘留的溶劑可能會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果,這些不足限制了雜交法的應(yīng)用。

3.2 免疫閾值法

供試品中DNA變性為單鏈DNA(ssDNA)后,能夠同時(shí)與鏈霉親和素標(biāo)記的ssDNA結(jié)合蛋白和脲酶偶聯(lián)的抗ssDNA單抗結(jié)合,形成含有DNA-鏈霉親和素-脲酶的復(fù)合物并被生物素化膜捕獲。在尿素溶液中,膜上的復(fù)合物通過(guò)與尿素反應(yīng)產(chǎn)生氨(NH3),引起溶液pH改變且改變與DNA含量成正比[15-16]。因?yàn)槭遣捎肈NA抗體的非特異序列免疫檢測(cè)技術(shù),因此閾值法不能特異性識(shí)別宿主殘留DNA序列,且容易受到環(huán)境和操作人員的DNA污染,導(dǎo)致讀值偏高。

3.3 定量PCR法(qPCR法)

針對(duì)供試品DNA設(shè)計(jì)特異性引物和帶有熒光標(biāo)記的探針,在PCR反應(yīng)過(guò)程中,通過(guò)熒光標(biāo)記探針或摻入熒光染料,連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中熒光數(shù)值的變化,實(shí)時(shí)反映特異性擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。當(dāng)PCR反應(yīng)釋放的熒光強(qiáng)度達(dá)到預(yù)設(shè)的閾值時(shí),體系的PCR循環(huán)數(shù)(Ct值)與該體系所含的起始DNA模板量的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系;采用已知含量的DNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)Ct值計(jì)算供試品中的DNA殘留量[15-17]。qPCR法具有序列特異性,其靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等性能好,可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量DNA片段檢測(cè);其中,特異且高度保守的q-PCR引物/探針等試劑是保證殘留DNA準(zhǔn)確可靠檢測(cè)的關(guān)鍵。

表2 中國(guó)藥典規(guī)定的治療性生物制品中DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)[14]Table 2 The limits of residual DNA in therapeutic biologics according to provisions for Chinese Pharmacopoeia[14]

3.4 熒光染色法

這種方法僅適用于測(cè)定雙鏈DNA。雙鏈DNA熒光染料(PicoGreen)與供試品中的雙鏈DNA特異結(jié)合形成復(fù)合物,在波長(zhǎng)480 nm激發(fā)下產(chǎn)生熒光信號(hào),使用熒光酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)520 nm處進(jìn)行檢測(cè);在一定DNA濃度范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度與DNA濃度成正比,可采用已知含量的雙鏈DNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算供試品中的DNA殘留量[17]。除了雙鏈DNA,動(dòng)物源性醫(yī)療器械中還可能殘留單鏈DNA片段,且殘留的DNA片段大小不一,而這種方法中僅僅是將已知含量的雙鏈DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品,這些極大的影響了殘留DNA檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

在選擇合適的殘留DNA檢測(cè)方法時(shí),需結(jié)合樣品的特征考慮檢測(cè)方法的特異性和局限性(見表3)。其中,qPCR方法同時(shí)被中國(guó)藥典[17]、美國(guó)藥典[15]和歐洲藥典[16]收錄,其技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于序列特異性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好,還可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)定量和相對(duì)分子質(zhì)量的高通量檢測(cè),使得操作更簡(jiǎn)便、結(jié)果更精確,從而為企業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供了可靠的檢測(cè)手段。而現(xiàn)行版中國(guó)藥典收錄的以PicoGreen為代表的熒光染料法[17],由于存在技術(shù)缺陷、不能準(zhǔn)確定量,已經(jīng)被美國(guó)和歐盟藥典摒棄。

4 降低DNA風(fēng)險(xiǎn)的手段

對(duì)于動(dòng)物源性醫(yī)療器械中殘留DNA的風(fēng)險(xiǎn),控制其DNA生物活性是關(guān)鍵。除了減少DNA殘留量,對(duì)于胃腸外使用的生物制品,由于殘留的DNA中可能包含致癌基因,WHO還建議將DNA片段化,使其大小降低到功能基因以下,即小于200個(gè)堿基對(duì)[63]。目前常用的降低DNA殘留量及其大小的方法包括的酶解、滲濾、超濾、層析等[67-69]。在生物材料中加入核酸酶,如DNase Ⅰ、非限制性核酸內(nèi)切酶等,可以靶向DNA將大分子酶解成小片段并降低了其分子黏度,但這種方式產(chǎn)生的DNA片段大小不一,還會(huì)導(dǎo)致酶的殘留。根據(jù)DNA帶有負(fù)電荷的特點(diǎn),可使用富含正電荷的物質(zhì),如聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)、魚精蛋白等與之中和形成沉淀而去除DNA[70];也可以采用陰離子交換劑或親和層析的方式,通過(guò)控制吸附、洗脫條件來(lái)除去帶負(fù)電荷的DNA[71]。盡管利用電荷來(lái)去除DNA的操作簡(jiǎn)便,但不適用于同樣帶有負(fù)電荷的材料;若產(chǎn)品帶正電荷,還會(huì)與DNA發(fā)生聚集和包裹,導(dǎo)致DNA去除效果不理想[72]。此外,也可采取化學(xué)滅活的方式,如β-丙內(nèi)酯(BPL)等,降低產(chǎn)品中病毒DNA的大小和活性。

然而動(dòng)物源性醫(yī)療器械生產(chǎn)過(guò)程中的一般工藝難以有效去除DNA,這一方面是由于DNA超強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性,另一方面是由于DNA呈負(fù)電荷易與其他生物大分子結(jié)合從而產(chǎn)生聚集(或吸附)、包裹作用?？紤]到不同的組織來(lái)源和用途,可以通過(guò)多種去除方式組合的方案,以實(shí)現(xiàn)更加充分的DNA去除效果。

表3 不同DNA殘留量檢測(cè)方法異同Table 3 Comparison of the methods for residual DNA testing

5 總結(jié)與展望

隨著越來(lái)越多的動(dòng)物源性醫(yī)療器械參與疾病治療,對(duì)其質(zhì)量控制也日益嚴(yán)格。對(duì)于去除免疫原性物質(zhì)的醫(yī)療器械,盡管在制造過(guò)程中進(jìn)行了脫細(xì)胞等工藝,但最終產(chǎn)品中仍可能殘留DNA片段。因此,動(dòng)物源性醫(yī)療器械中殘留的DNA同樣存在安全性風(fēng)險(xiǎn)和需要開展風(fēng)險(xiǎn)管理。

基于風(fēng)險(xiǎn)分析的安全性研究是進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制的基礎(chǔ),通過(guò)分析動(dòng)物細(xì)胞殘留DNA的潛在風(fēng)險(xiǎn)和來(lái)源,追溯了生物制品中殘留DNA可接受水平的演變,顯示該限值是基于不同材料來(lái)源和使用條件下的殘留DNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過(guò)程。盡管相較于生物制品,動(dòng)物源性醫(yī)療器械與人體的接觸方式更多樣,如表面接觸、外部接入、植入等[73],但它們都來(lái)自于生物材料且不可避免的殘留了宿主細(xì)胞DNA,這提示針對(duì)動(dòng)物源性醫(yī)療器械中殘留DNA開展風(fēng)險(xiǎn)管理時(shí),除了分析這些DNA可能編碼或隱藏的癌基因或感染因子等潛在危害,還應(yīng)關(guān)注不同類型的醫(yī)療器械,通過(guò)深入探究不同接觸方式、接觸周期器械的安全性問題,為科學(xué)監(jiān)管提供殘留DNA表征和穩(wěn)健風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等數(shù)據(jù)支持,從而保障此類器械的安全使用。

為了盡可能去除外源污染、確保產(chǎn)品質(zhì)量,對(duì)宿主細(xì)胞殘留DNA的表征和測(cè)試是控制動(dòng)物源性醫(yī)療器械生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。這些殘留DNA的生物活性決定了其安全性風(fēng)險(xiǎn),它與DNA的多少和片段大小密切相關(guān)。FDA等的監(jiān)管指南建議胃腸外使用生物制品中殘留DNA水平為10 ng/劑和200個(gè)堿基對(duì)大小,而中國(guó)藥典僅對(duì)殘留量的限值進(jìn)行了要求(如表1和表2所示)。由于DNA片段大小與其功能活性密切相關(guān)[8-10, 22-23],并且風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究表明,相同質(zhì)量DNA的條件下,DNA片段的減小將有助于降低風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。這說(shuō)明除了DNA含量,在動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制、提高安全性時(shí),還應(yīng)關(guān)注殘留的DNA片段大小。

殘留DNA表征的目的包括:①確認(rèn)純化工藝合理,能有效去除宿主DNA殘余;②確認(rèn)產(chǎn)品中雜質(zhì)含量符合標(biāo)準(zhǔn)要求。非特異性的DNA檢測(cè)結(jié)果不能區(qū)分究竟是生產(chǎn)中污染、檢測(cè)污染、還是工藝缺陷引起的DNA殘留,所以無(wú)法為解決方案提供有效信息。在嚴(yán)格的生產(chǎn)體系中,殘留DNA準(zhǔn)確表征能夠解決工藝合理性問題。為了加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)的過(guò)程監(jiān)測(cè)和質(zhì)量控制,各國(guó)藥典都對(duì)殘留DNA的檢測(cè)方法進(jìn)行了更新,通過(guò)提高檢測(cè)方法的敏感性確保產(chǎn)品中殘留DNA的安全性。中國(guó)藥典中的檢測(cè)方法與美國(guó)、歐洲各不相同[15-17]。因此,中國(guó)相關(guān)器械企業(yè)在研發(fā)與生產(chǎn)中應(yīng)具有前瞻性,盡早更新相關(guān)檢測(cè)方法,這將有利于改進(jìn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量,有利于產(chǎn)品走出國(guó)門提高產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力。

動(dòng)物源性醫(yī)療器械的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是基于風(fēng)險(xiǎn)-收益權(quán)重的產(chǎn)品安全性和有效性分析過(guò)程。盡管監(jiān)管機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)將殘留DNA作為進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制的性能指標(biāo),但任何生物過(guò)程中殘留DNA的水平還是關(guān)鍵的安全性風(fēng)險(xiǎn),為制造過(guò)程和產(chǎn)品上市提供安全性保證。對(duì)于動(dòng)物源性醫(yī)療器械中殘留DNA帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)隱患,采用安全可靠的工藝手段去除DNA是降低風(fēng)險(xiǎn)、保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。建立合適的殘留DNA檢測(cè)方法有助于監(jiān)測(cè)工藝質(zhì)量,確保動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品的安全性和有效性,造福人類健康。