羅世聞, 武利慶, 楊 彬, 劉亞輝

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

1 引 言

蛋白質(zhì)是生物體中廣泛存在的一類生物大分子,它是由核酸編碼的α氨基酸通過α氨基和α羧基形成肽鍵,并連接成肽鏈,再經(jīng)翻譯后加工生成了具有特定立體結(jié)構(gòu)和活性的大分子[1]。生物體中的蛋白質(zhì)通過與其他分子的相互作用表現(xiàn)出其活性,并在細(xì)胞中發(fā)揮著催化、免疫、傳導(dǎo)、調(diào)控等重要功能[2]。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物,是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾,即使具有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu),也會(huì)因不同的折疊形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及翻譯后修飾的不同而導(dǎo)致活性的不同。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮往往僅依賴其具有活性的部分,因此,正確測(cè)定蛋白質(zhì)的活性濃度對(duì)于更好地了解與評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)功能,提升和控制蛋白類生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)的量顯得尤為重要[3]。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析技術(shù),如凱氏定氮法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、考馬斯亮藍(lán)染色法[4]等,都依據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量,測(cè)定出的蛋白質(zhì)濃度是蛋白質(zhì)的理化濃度而不是活性濃度。即使目前發(fā)展起來的蛋白質(zhì)定量潛在計(jì)量基準(zhǔn)方法,如同位素稀釋質(zhì)譜法、定量核磁法、高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用法、電噴霧-差分電遷移-顆粒計(jì)數(shù)法[5,6]等,也是依據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量。這種方法雖然可以準(zhǔn)確測(cè)定出蛋白質(zhì)的理化濃度,但是該濃度與廣為關(guān)注的蛋白質(zhì)活性濃度之間沒有必然的關(guān)系。

蛋白質(zhì)作為一類復(fù)雜的生物大分子,多肽鏈在一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步盤旋折疊并與其他蛋白質(zhì)亞基結(jié)合,從而形成不同的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu),同時(shí)經(jīng)過翻譯后修飾的加工才具有最終的生理功能。具有正確高級(jí)結(jié)構(gòu)以及翻譯后修飾的蛋白質(zhì)只是存在相同氨基酸序列,是蛋白質(zhì)中的一部分,但只有這部分蛋白質(zhì)才具有生理活性,因此需對(duì)這部分活性蛋白濃度的測(cè)定更為關(guān)注。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、數(shù)字酶聯(lián)免疫吸附法[7]等各種免疫分析方法,雖然通過抗原與抗體之間的相互作用可以反映出部分蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)與翻譯后修飾等對(duì)蛋白質(zhì)濃度測(cè)量的影響,但是這類方法一般都是相對(duì)測(cè)定法。需通過活性蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線才能對(duì)樣品中的蛋白進(jìn)行活性測(cè)定。然而目前還未研制出蛋白質(zhì)活性濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),從而使得通過免疫分析測(cè)定蛋白質(zhì)活性濃度的方案也不可行。

迫于蛋白質(zhì)功能評(píng)價(jià)表征以及蛋白制品活性指標(biāo)質(zhì)量控制對(duì)蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)量和計(jì)量的需求,近年來研究人員提出并逐步發(fā)展了基于表面等離子體共振光譜(surface plasmon resonance,SPR)的無校準(zhǔn)濃度分析技術(shù)(calibration free concentration analysis,CFCA)[8,9],成功實(shí)現(xiàn)了在無需標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,對(duì)蛋白質(zhì)活性濃度的絕對(duì)測(cè)定,并逐步在蛋白質(zhì)純化、疫苗開發(fā)、臨床檢驗(yàn)、蛋白類生物制品質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制等眾多領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。該技術(shù)已經(jīng)引起國(guó)際國(guó)內(nèi)計(jì)量界的廣泛關(guān)注,CFCA有望成為蛋白質(zhì)活性濃度計(jì)量的基準(zhǔn)方法。故此,本文對(duì)該技術(shù)的測(cè)量原理、應(yīng)用領(lǐng)域、存在不足以及未來可能地發(fā)展方向等進(jìn)行了綜述和展望。

2 表面等離子體共振技術(shù)的基本原理

表面等離子體共振的概念早已出現(xiàn)[10],是一種由隱失波引發(fā)金屬表面疏密電子振蕩的物理學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)光從光密介質(zhì)進(jìn)入光疏介質(zhì)時(shí)會(huì)產(chǎn)生一束反射光和一束折射光,折射光的角度與兩種介質(zhì)的折射率有關(guān),且符合菲涅爾公式:

n1sinθ1=n2sinθ2

(1)

當(dāng)入射角增大到臨界點(diǎn)時(shí),折射光將徹底消失,只存在反射光,這一現(xiàn)象被稱為全反射[11]。在這一過程中入射光并不是在剛接觸界面時(shí)產(chǎn)生反射光,而是先進(jìn)入光疏介質(zhì)沿著界面流過波長(zhǎng)量級(jí)再返回光密介質(zhì),其中經(jīng)過光疏介質(zhì)的光稱為消逝波[12]。這時(shí)如果介質(zhì)中存在一層具有等離子波的金屬膜,2種波相遇可能發(fā)生共振,導(dǎo)致入射光的部分能量轉(zhuǎn)移到表面等離子波中,使得反射光的強(qiáng)度大幅度減弱。使反射光完全消失的入射角就被稱為SPR角。SPR角通常與金屬表面折射率相關(guān),而金屬表面折射率又和其表面捕獲的分子質(zhì)量成正比,所以通過檢測(cè)SPR角的改變可以獲得分子間相互作用的信息[13,14]。

從1902年首次觀察到表面等離子體共振現(xiàn)象到1983年首次引入氣體傳感和生物傳感器,SPR技術(shù)在納米技術(shù),光學(xué)技術(shù),流體技術(shù)和光源技術(shù)的支持下得到了迅速發(fā)展[15]。近幾十年來,表面等離子體共振技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物研發(fā)、材料開發(fā)等方面被廣泛應(yīng)用,覆蓋了醫(yī)藥、環(huán)境、生物和材料等多個(gè)領(lǐng)域[16,17]。SPR技術(shù)具有樣本需求量小、檢測(cè)速度快、耗材成本低和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[18],無需對(duì)生物分子進(jìn)行熒光或放射性標(biāo)記就可以直接測(cè)量分子間相互作用的親和力及動(dòng)力學(xué)常數(shù)[19],可應(yīng)用于各類分子間相互作用的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[20],如抗體-抗原、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、酶-底物、蛋白質(zhì)-DNA、受體-藥物、蛋白質(zhì)-多糖、蛋白質(zhì)-病毒[21,22]等。

3 蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)量原理

基于SPR的蛋白質(zhì)活性濃度絕對(duì)測(cè)量技術(shù),即無校準(zhǔn)濃度分析技術(shù)(calibration free concentration analysis,CFCA)的概念最早于1993年提出,隨后被逐步完善和發(fā)展。使用CFCA時(shí),需將分析物在層流條件下注入傳感器表面,傳感器的表面上要固定有分析物的受體或抗體。溶液中分析物首先通過擴(kuò)散來到傳感器的表面,隨后表面附近分析物中具有的活性分子將與固定在傳感器表面的受體或抗體結(jié)合,從而引起傳感器表面質(zhì)量變化,而這種變化將引起SPR產(chǎn)生響應(yīng),整個(gè)過程如圖1所示。

當(dāng)分析物在層流條件下注入傳感器表面且傳感器表面偶聯(lián)的受體或抗體足夠多、分子之間的結(jié)合反應(yīng)足夠快的時(shí)候,整體的擴(kuò)散與結(jié)合反應(yīng)速率就僅受到分析物擴(kuò)散速率的影響,即處于傳質(zhì)限制(mass transferlimited,MTL)條件下,此時(shí)溶液中的分析物與傳感器表面的分析物濃度之間存在下式中的化學(xué)平衡。

(2)

式中:Abulk代表溶液中分析物的濃度,g/L;Asurface代表傳感器表面分析物的濃度,g/L。根據(jù)質(zhì)量作用定律,可以寫下式:

(3)

(4)

式中:D代表分析物的擴(kuò)散系數(shù),m2/s;f代表流動(dòng)池中溶液的流速,m3/s;H、w和l分別流動(dòng)池的幾何尺寸即高度、寬度和長(zhǎng)度,m。擴(kuò)散系數(shù)D取決于分析物的分子量和粘度等常數(shù)[23],如下所示:

(5)

式中:M代表分析物的分子量,Da;ηrel代表溶劑的相對(duì)粘度(20 ℃下)。

4 蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)量的應(yīng)用

4.1 在蛋白質(zhì)活性計(jì)量中的應(yīng)用

Su[24]等建立了測(cè)定轉(zhuǎn)基因蛋白G2-EPSPS活性濃度的CFCA方法,研究發(fā)現(xiàn)該方法日內(nèi)精密度為3.26%～4.59%,日間精密度為8.36%。在1.5～8 nmol/L 的濃度范圍內(nèi),該方法的回收率為97.46%～104.34%。通過與同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)定的理化濃度進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)G2-EPSPS的比活性僅為0.18,證明針對(duì)選擇的抗體,大部分蛋白沒有活性,同時(shí)反映出如果采用理化濃度替代活性濃度計(jì)算親和常數(shù)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)的活性進(jìn)行質(zhì)控,將引起較大的誤差。

Hu[25]等以人肌紅蛋白為研究對(duì)象,進(jìn)一步采用3種經(jīng)過篩選的不同單克隆抗體建立CFCA方法對(duì)肌紅蛋白的活性濃度進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果分別為2.985、2.912和3.032 mg/mL,不僅不同抗體獲得的活性濃度結(jié)果一致,而且與通過同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)得的理化濃度2.851 mg/mL接近,比活性為 1.02～1.06,證明所用蛋白活性良好。Hu認(rèn)為該方法可能成為蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)定的基準(zhǔn)方法并用于蛋白質(zhì)活性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

Ludmilla[26]等使用Biacore 2000設(shè)備和胺偶聯(lián)試劑盒測(cè)定了重組RVG的活性濃度。通過將p75NTR中可溶解的伯胺基團(tuán)與CM5傳感器芯片的羧甲基化葡聚糖基質(zhì)共價(jià)連接得到共振單元,然后將稀釋液以7種不同流速在CM5(p75)表面上流動(dòng) 5 min 并與空白CM5芯片進(jìn)行對(duì)照,最后使用BIA-CONC程序分析初始結(jié)合率以測(cè)定重組RVG的活性濃度。

4.2 在蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的應(yīng)用

雖然目前還沒有直接采用CFCA方法研制蛋白質(zhì)活性濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的例子,但是中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院的Wu[27]等研究發(fā)現(xiàn),CFCA的蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)定技術(shù)可用到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互換性評(píng)價(jià)中。Wu等分別采用CFCA和同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)定候選蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的活性濃度與理化濃度,當(dāng)活性濃度與理化濃度在不確定度范圍內(nèi)相等時(shí),說明2種方法識(shí)別的被測(cè)量一致,因此用同位素稀釋質(zhì)譜方法定值的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將在免疫學(xué)方法中具有良好的互換性,且相關(guān)的研究工作和技術(shù)已經(jīng)獲得專利授權(quán)[27]。

4.3 在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

Grover[28]等使用CFCA方法直接測(cè)定患有不同傳染病和非傳染病患者血清樣品中的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物豐度。對(duì)近100個(gè)血清樣品中β2-微球蛋白(β2M)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)的濃度進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)CFCA都具有很好的重復(fù)性、準(zhǔn)確性和靈敏度。在血清稀釋度為1 000的檢測(cè)中可測(cè)到低至 13 ng/mL 的β2M,說明該方法可用于檢測(cè)體液中的低豐度蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。應(yīng)用CFCA方法,患病受試者的血清SAA與健康組相比,豐度存在顯著差異,這與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致。該研究使得CFCA在快速監(jiān)測(cè)血清樣品中的多種蛋白質(zhì)標(biāo)志物方面邁出了重要一步。

Ray[29]等通過使用Biacore T200系統(tǒng)的CFCA方法對(duì)SAA進(jìn)行定量,將每個(gè)血清樣品連續(xù)稀釋至1/100和1/200進(jìn)行濃度分析,并在25 ℃下以 5 μL/min和100 μL/min的流速通過活性和參考流動(dòng)池,然后使用Biacore T200系統(tǒng)的軟件分析結(jié)合率數(shù)據(jù)從而確定SAA濃度,最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明SAA的血清豐度隨感染的嚴(yán)重程度依次增加。

Aniol-Nielsen[30]等提出了一種用于抗藥抗體(ADA)定量的CFCA方法,該方法是一種用于確定藥物特異性抗體比例的方法,它允許在基于流動(dòng)的系統(tǒng)中直接確定由配體定義的活性抗體濃度。在研究中,他們使用針對(duì)內(nèi)源性人胰島素、德谷胰島素和凝血因子的多克隆陽(yáng)性對(duì)照抗體進(jìn)行開發(fā)和驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)CFCA的方法可以精準(zhǔn)地測(cè)量出藥物特異性抗體的濃度,精密度為±10%,與單抗陽(yáng)性對(duì)照抗體的預(yù)期值回收率為90%～112%。

4.4 在蛋白類生物制品研發(fā)與質(zhì)控中的應(yīng)用

Karlsson[31]等將CFCA技術(shù)應(yīng)用于溫度應(yīng)激TNF-α抗體的質(zhì)量控制中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過CFCA測(cè)定的活性濃度與抗體效價(jià)之間存在良好的相關(guān)性,Karlsson認(rèn)為基于SPR的劑量響應(yīng)曲線、傳感圖的比較和CFCA技術(shù)的組合可以增強(qiáng)抗體相對(duì)效價(jià)評(píng)估的可信度,并表明SPR技術(shù)可用于生物藥物質(zhì)量控制中并替代效價(jià)測(cè)定。

Pol[8]等采用CFCA方法測(cè)定了貝伐單抗、利妥昔單抗、干擾素a-2a等活性濃度,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,CFCA方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。在干擾素α-2a純化制備過程中,通過CFCA測(cè)定樣品和參考物質(zhì)的活性濃度計(jì)算相對(duì)效價(jià)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制,發(fā)現(xiàn)比CFCA測(cè)定單一活性濃度的方法更加可靠。

4.5 在基礎(chǔ)科研中的應(yīng)用

Pol[9]等通過使用Biacore X100進(jìn)行實(shí)時(shí)分析,探索了牛半胱氨酸蛋白酶抑制劑胱抑素B與木瓜蛋白酶的催化失活形式之間的相互作用。他們使用CFCA的方法確定了每個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑B變體特異性結(jié)合濃度,并將獲得的值與A(280 nm)確定的總蛋白濃度進(jìn)行比較。結(jié)果說明在結(jié)構(gòu)功能的研究中使用CFCA的方法有助于獲得可靠的結(jié)果以及正確解釋相互作用機(jī)理。

Stefan[32]等在研究YpdB基因如何啟動(dòng)脈沖基因表達(dá)時(shí),使用SPR技術(shù)分析測(cè)量了原生型YpdB和磷酸化變體型YpdB-D53E與yhjX啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。通過使用CFCA的方法在2種不同的流速下測(cè)量蛋白質(zhì)的初始結(jié)合速率,然后通過Biacore系統(tǒng)的擴(kuò)散常數(shù)計(jì)算程序算出YpdB-D53E的擴(kuò)散系數(shù),從而得到Y(jié)pdB-D53E的活性濃度,最后后將所得活性蛋白濃度用于計(jì)算動(dòng)力學(xué)結(jié)合常數(shù),獲得了更加準(zhǔn)確的值。

Yasmina[33]等在研究FcRn/Fc相互作用的過程中,使用了Biacore公司的SPR生物傳感器進(jìn)行了CFCA分析,在傳質(zhì)限制條件下對(duì)每種分析物的活性濃度進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)試數(shù)據(jù)顯示,FcRn/IgG的相互作用可以在相反的檢測(cè)方向上進(jìn)行研究,這樣可以最大限度地減少表面?zhèn)斡?并得到與溶液測(cè)量接近的親和力常數(shù)。

5 蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)量的不足

目前相對(duì)較為成熟的蛋白質(zhì)活性濃度測(cè)定方法均是基于SPR的CFCA方法。雖然該方法在蛋白質(zhì)計(jì)量、臨床檢驗(yàn)、蛋白類生物制品質(zhì)量控制等領(lǐng)域逐漸被應(yīng)用,并且可以不依賴標(biāo)準(zhǔn)用于絕對(duì)活性濃度測(cè)定,但通?？赡軙?huì)產(chǎn)生15%～30%的誤差。受限于該方法的測(cè)量原理,目前還存在以下不足與亟待解決的問題。

1) 該方法要求在傳質(zhì)限制(MTL)條件下進(jìn)行,因此要求芯片表面具有較高的受體或抗體偶聯(lián)密度,同時(shí)蛋白質(zhì)與抗體或受體結(jié)合的反應(yīng)速率要足夠快,但是這些要求不是每個(gè)研究體系都能符合,如果不能滿足測(cè)量原理的要求,則不能通過這種方式測(cè)定蛋白質(zhì)活性濃度。一般來說,只有當(dāng)目標(biāo)蛋白的分子量大于5 000時(shí),才能獲得比較好的分析效果。雖然后續(xù)有研究工作將該方法擴(kuò)展到在部分傳質(zhì)限制條件下的活性濃度測(cè)定,并給出了描述生物分子復(fù)合物形成的微分方程的解析,但是模型的準(zhǔn)確性有待更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。

2) 計(jì)算模型中的流通池幾何尺寸、分析擴(kuò)散系數(shù)、流速、1 RU對(duì)應(yīng)的單位面積質(zhì)量等若干常數(shù)或參數(shù)均為經(jīng)驗(yàn)估算值或系統(tǒng)平均值,用于特定體系的計(jì)算可能會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。當(dāng)SPR信號(hào)從傳感器表面呈指數(shù)衰減傳導(dǎo)時(shí),遠(yuǎn)離傳感器表面的分子比靠近傳感器表面的分子其單位質(zhì)量響應(yīng)低也會(huì)造成轉(zhuǎn)換系數(shù)的誤差。

3) CFCA計(jì)算模型通常采用1:1模型進(jìn)行計(jì)算,如果分析物具有多個(gè)相同的結(jié)合位點(diǎn),則不能直接確定單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的活性濃度。

6 展望與總結(jié)

隨著生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,尤其是蛋白質(zhì)藥物等蛋白類生物制品的不斷上市,對(duì)蛋白質(zhì)活性濃度準(zhǔn)確可比測(cè)量的需求也不斷攀升,解決蛋白質(zhì)活性濃度計(jì)量問題、建立蛋白質(zhì)活性濃度量值溯源傳遞體系變得尤為迫切。國(guó)際計(jì)量局物質(zhì)的量咨詢委員會(huì)(CCQM)蛋白質(zhì)分析工作組于2018年專門成立了蛋白質(zhì)活性焦點(diǎn)工作組,專門研究蛋白質(zhì)活性的測(cè)量與量值溯源問題,本課題組有成員擔(dān)任了該工作組的召集人。2019年CCQM成立25周年紀(jì)念大會(huì)上,專門邀請(qǐng)中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院的專家介紹了基于SPR的蛋白質(zhì)活性濃度計(jì)量研究成果。2021開始國(guó)家科技部的質(zhì)量基礎(chǔ)(NQI)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目指南中,也對(duì)蛋白質(zhì)活性濃度計(jì)量技術(shù)研究提供經(jīng)費(fèi)支持。蛋白質(zhì)活性濃度計(jì)量研究在我國(guó)已經(jīng)全面鋪開。未來一段時(shí)間,CFCA方法憑借不依賴標(biāo)準(zhǔn)品直接測(cè)定出蛋白質(zhì)活性濃度的優(yōu)點(diǎn),依然是蛋白質(zhì)活性濃度計(jì)量方法研究的重點(diǎn)。CFCA方法將進(jìn)一步朝著提高方法準(zhǔn)確度和擴(kuò)大適用范圍的方向發(fā)展。例如,通過改善部分傳質(zhì)限制條件下傳質(zhì)參數(shù)和數(shù)學(xué)模型的準(zhǔn)確度提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確度;通過儀器參數(shù)的校準(zhǔn)和有關(guān)常數(shù)的準(zhǔn)確測(cè)定提高準(zhǔn)確度,及不同儀器間的可比性;通過采用捕獲模式等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),解決無法通過共價(jià)固定在傳感器芯片上的配體進(jìn)行活性濃度測(cè)定的問題[34]?？傊?相信不久的將來,基于SPR的CFCA方法將在蛋白質(zhì)活性濃度計(jì)量與蛋白質(zhì)活性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中發(fā)揮巨大的作用[35]。