鄭 青,葛海霞

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 湖州 313000)

0 引 言

槲皮素(Quercetin,QUE)是一種天然黃酮醇類化合物,廣泛存在于多種天然植物的葉、莖、芽、種子和果實(shí)中[1].多項(xiàng)研究表明,槲皮素具有廣泛的藥理作用,如抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和免疫抑制等[2-3].槲皮素化學(xué)名為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮,又名櫟精,分子式為C15H10O7,其分子結(jié)構(gòu)見圖1.

圖1 槲皮素的分子結(jié)構(gòu)

血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是紅細(xì)胞中最主要的蛋白質(zhì)成分,是血液中的氧載體,能直接或間接地幫助二氧化碳的運(yùn)輸,并調(diào)節(jié)血液的pH值[4].Hb的相對(duì)分子質(zhì)量約為64 500,分子中含有4個(gè)亞基、2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基,每個(gè)亞基連接一個(gè)血紅素基團(tuán)[5].除白蛋白外,血紅蛋白作為一種細(xì)胞內(nèi)蛋白,可以與藥物結(jié)合.當(dāng)QUE進(jìn)入人體時(shí),它們可能會(huì)穿透紅細(xì)胞并與Hb相互作用而影響QUE的生物利用度,以及Hb的空間構(gòu)象和生物功能.牛血紅蛋白(bovine hemoglobin,BHb)與Hb具有高達(dá)85%的氨基酸序列同源性,且比Hb更便宜、更容易獲得,常被用于模擬血紅蛋白與小分子化合物結(jié)合的研究[6].

本試驗(yàn)通過紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜,以及對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定,研究在模擬人體生理?xiàng)l件下QUE與BHb的相互作用和抗氧化性,從而為了解QUE在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝及其對(duì)BHb空間構(gòu)象的影響等提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RF-6000PC型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)、Evolution 201/220 紫外可見分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)、BS224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、DK-S24型恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、pHS-3C型pH酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)等.

槲皮素(QUE,純度≥99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、牛血紅蛋白(BHb,生物試劑,上海源葉生物科技有限公司)、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH,分析純,合肥巴斯夫生物科技有限公司).QUE儲(chǔ)備液(1.0×10-4mol·L-1)用無水乙醇溶解配制,避光保存;BHb儲(chǔ)備液(1.0×10-5mol·L-1)用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液配制,于4 ℃ 冰箱保存;DPPH儲(chǔ)備液(1.0×10-3mol·L-1)用無水乙醇配制,避光保存.其他所用試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外-可見吸收光譜的測(cè)定

在5個(gè)10 mL容量瓶中分別加入適量的BHb和QUE儲(chǔ)備液,用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容,固定BHb濃度為1.0×10-6mol·L-1,QUE濃度為(0、6.0、12.0、18.0、24.0)×10-6mol·L-1,置于298 K下恒溫0.5 h,在200～500 nm范圍內(nèi)測(cè)定紫外-可見吸收光譜.

1.2.2 熒光光譜和同步熒光光譜的測(cè)定

在7個(gè)10 mL容量瓶中分別加入適量的BHb和QUE儲(chǔ)備液,用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容,固定BHb濃度為1.0×10-6mol·L-1,QUE濃度為(0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0)×10-6mol·L-1,置于一定溫度(294、302、310 K)的水浴中恒溫0.5 h.設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)λex為280 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm,在300～400 nm 范圍內(nèi)測(cè)定熒光光譜.同步熒光光譜設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)λex與發(fā)射波長(zhǎng)λem的差Δλ分別為15 nm 和60 nm,其他條件同熒光光譜.

1.2.3 抗氧化性的測(cè)定

抗氧劑的抗氧化活性大小可用DPPH自由基清除率代替表示.準(zhǔn)確量取1 mL 10-4mol·L-1槲皮素溶液于10 mL容量瓶中,分別加入1×10-5mol·L-1BHb溶液 0、1、2、4、8 mL,再加入1 mL 10-3mol·L-1DPPH乙醇溶液,定容,避光反應(yīng) 30 min 后,測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值.

2 結(jié)果與討論

2.1 QUE與BHb相互作用的熒光光譜

2.1.1 熒光猝滅光譜

BHb的固有熒光主要來自色氨酸(Trp)殘基和酪氨酸(Tyr)殘基.BHb中含有6個(gè)Trp殘基和10個(gè)Tyr殘基,其中β-37 Trp是主要的熒光團(tuán),對(duì)四級(jí)結(jié)構(gòu)變化敏感[7-9].圖2為在294、302、310 K溫度下,不同濃度的QUE與BHb相互作用的熒光猝滅圖.從圖2可以看出,當(dāng)λex為280 nm時(shí),BHb在 330 nm 附近有很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,且隨著QUE濃度的增大,BHb在330 nm附近的熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅,但最大發(fā)射峰沒有發(fā)生移動(dòng).這說明QUE與BHb相互之間產(chǎn)生了作用,但QUE并沒有引起B(yǎng)Hb分子構(gòu)象的改變[10].

2.1.2 熒光猝滅類型、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

為推測(cè)QUE與BHb的猝滅機(jī)理,將所測(cè)數(shù)據(jù)用Stern-Volmer方程[11]做以下處理:

(1)

其中,F0和F分別代表不加QUE和加入QUE時(shí)BHb的熒光強(qiáng)度,[Q]為QUE的濃度,Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù),KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),τ0為不含QUE時(shí)的熒光分子壽命,生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s.以F0/F為縱坐標(biāo)、[Q]為橫坐標(biāo)作圖,見圖3(a).由此可求出直線斜率KSV,進(jìn)而得出Kq,見表1.

假設(shè)小分子在蛋白質(zhì)上有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),按式(2)[12]進(jìn)行處理:

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q],

(2)

其中,Ka為QUE與BHb的結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù).以lg[(F0-F)/F]為縱坐標(biāo)、lg[Q]為橫坐標(biāo)作圖,見圖3(b).由此可求出n和Ka,見表1.

注:c(BHb)=1.0×10-6 mol·L-1;c(QUE) 1→7:(0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0)×10-6 mol·L-1;pH 7.40.圖2 不同溫度下QUE對(duì)BHb的熒光猝滅光譜

圖3 QUE猝滅BHb的Stern-Volmer圖和雙倒數(shù)曲線圖

表1 不同溫度下QUE-BHb的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

從表1可以看出,在3個(gè)不同溫度下,Stern-Volmer方程擬合曲線的相關(guān)系數(shù)r均大于0.99,線性擬合關(guān)系良好.這說明Stern-Volmer模型可用于研究QUE與BHb之間的相互作用,也意味著在槲皮素與BHb的相互作用過程中,有一種猝滅類型占主導(dǎo)地位[13].猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而減小,3個(gè)溫度下的Kq值均遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)擴(kuò)散猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1.由此判斷,QUE對(duì)BHb的猝滅為QUE與BHb形成基態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[14].

經(jīng)計(jì)算得出,n和Ka均隨溫度的升高而降低,說明溫度升高能夠降低QUE-BHb復(fù)合物的穩(wěn)定性,符合靜態(tài)猝滅.Ka的數(shù)量級(jí)為103L·mol-1,表明理論上QUE與BHb的結(jié)合作用較強(qiáng),可被蛋白質(zhì)輸送或儲(chǔ)存.3個(gè)溫度下的平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為0.82、0.80和0.75,說明大約每個(gè)QUE分子與一個(gè)BHb結(jié)合形成復(fù)合物.由于β-37 Trp是BHb內(nèi)源熒光的主要來源,所以QUE與BHb的作用位點(diǎn)更接近β-37 Trp.

2.1.3 熱力學(xué)分析和作用力類型

化合物小分子與蛋白質(zhì)大分子的結(jié)合是依靠非共價(jià)健作用力實(shí)現(xiàn)的,主要包括疏水作用、范德華力、氫鍵和靜電引力等相互作用力類型[15].通過Van’t Hoff 方程計(jì)算QUE-BHb體系的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG,可判斷QUE和BHb之間的主要作用力.

ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS,

(3)

其中,Ka、T和R分別為特定溫度下的結(jié)合常數(shù)、溫度和氣體常數(shù)8.314 J·mol-1·K-1.

計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG見表2.由表2可知,QUE和BHb在294、302、310 K溫度下反應(yīng)的ΔG<0,說明QUE與BHb的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)的過程;ΔH<0、ΔS<0,說明QUE與BHb結(jié)合的作用力主要為氫鍵和范德華力[16].

表2 QUE-BHb體系的熱力學(xué)參數(shù)

2.1.4 結(jié)合距離

QUE與BHb的結(jié)合距離,可根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論及關(guān)系式(4)(5)(6)[17]計(jì)算得到:

(4)

(5)

(6)

式(4)中,E為能量轉(zhuǎn)移效率,R0為能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離,r為QUE與BHb之間的距離.式(5)中,K2為偶極空間取向因子,n為介質(zhì)的折射指數(shù),φ為熒光殘基的熒光量子產(chǎn)率,J為BHb的發(fā)射光譜與QUE的吸收光譜重疊積分.式(6)中,F(λ)為BHb在波長(zhǎng)為λ處的熒光強(qiáng)度,ε為QUE在λ處的摩爾消光系數(shù).

圖4為QUE的紫外吸收光譜與BHb的熒光發(fā)射光譜的重疊光譜.將發(fā)射光譜重疊區(qū)域按式(6)計(jì)算,得到J=1.33×10-14cm3·L·mol-1.K2取2/3,n取有機(jī)物平均值1.36,Trp量子產(chǎn)率φ=0.15[18],計(jì)算得到臨界距離R0=2.65 nm,r=2.09 nm.QUE與BHb的β-37 Trp殘基之間的結(jié)合距離r小于 7 nm,符合0.50R0

注:c(BHb)=1.0×10-5 mol·L-1,c(QUE)=1.0×10-5 mol·L-1.圖4 QUE吸收光譜和BHb熒光光譜的重疊圖譜

2.2 QUE對(duì)BHb二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜可用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的形成.BHb有3個(gè)吸收峰,在約208、278、405 nm處的吸收峰分別反映BHb的肽鍵、芳香族氨基酸殘基(Trp和Tyr)和血紅素卟啉-Soret帶的構(gòu)象[19].圖5為當(dāng)溫度為298 K、pH為7.4時(shí)QUE與BHb相互作用的紫外-可見吸收光譜圖.隨著QUE濃度的增大,BHb在約278 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸減小且出現(xiàn)了紅移.這表明QUE與BHb的芳香殘基存在相互作用,從而使包埋在BHb分子內(nèi)部的Trp和Tyr殘基部分裸露于水相,同時(shí)疏水基團(tuán)之間的疏水作用增強(qiáng),引起Trp和Tyr的π-π*躍遷所需能量減少[20].而當(dāng)QUE濃度增大時(shí),在約405 nm處的吸收峰降低,但吸收峰幾乎未發(fā)生位移,表明QUE對(duì)BHb的血紅素輔基幾乎不產(chǎn)生影響[21].

注:c(BHb)=1.0×10-6 mol·L-1,c(QUE) 1→7:(0、6.0、12.0、18.0、24.0)×10-6 mol·L-1;pH=7.40.圖5 QUE-BHb體系的紫外-可見吸收光譜

2.2.2 同步熒光光譜

同步熒光光譜被廣泛用于檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的信息.當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的差值Δλ為15 nm或60 nm時(shí),BHb的同步熒光光譜可分別提供BHb的Tyr和Trp殘基的特征信息,并檢測(cè)Tyr和Trp殘基所處微環(huán)境是否發(fā)生變化[22].

QUE-BHb體系的同步熒光發(fā)射光譜見圖6.由圖6可知,當(dāng)Δλ=15 nm時(shí),隨著QUE濃度的遞增,Tyr殘基的熒光強(qiáng)度逐漸降低,且最大發(fā)射波長(zhǎng)的峰沒有明顯的藍(lán)移或紅移,說明QUE對(duì)BHb的Tyr殘基周圍微環(huán)境的極性和疏水性影響較小;當(dāng)Δλ=60 nm時(shí),隨著QUE濃度的遞增,Trp殘基的熒光強(qiáng)度逐漸降低,且最大發(fā)射波長(zhǎng)的峰發(fā)生輕微紅移,說明QUE可使BHb中Trp殘基周圍的微環(huán)境極性增加,疏水性降低,這也是槲皮素與BHb發(fā)生靜態(tài)猝滅生成復(fù)合物的體現(xiàn)[23].

BHb每個(gè)二聚體中含有3個(gè)Trp殘基和5個(gè)Tyr殘基.Trp殘基和Tyr殘基是以BHb腔為對(duì)稱中心對(duì)稱的[7].QUE對(duì)BHb的同步熒光猝滅見圖7.由圖7可知,Δλ為15 nm時(shí)的圖像斜率與Δλ為60 nm時(shí)的圖像斜率相似,說明QUE接近Trp殘基和Tyr殘基的機(jī)會(huì)相等.由此得出,QUE與血紅蛋白中心腔結(jié)合能形成QUE-BHb復(fù)合物[24].

注:c(BHb)=1.0×10-6 mol·L-1;c(QUE) 1→7:(0、2、4、6、8、10、12)×10-6 mol·L-1;pH=7.40.圖6 QUE-BHb體系的同步熒光光譜

注:c(BHb)=1.0×10-6 mol·L-1.圖7 QUE對(duì)BHb的同步熒光猝滅

2.3 QUE對(duì)DPPH自由基的抗氧化性

DPPH自由基清除率可根據(jù)式(7)[25]計(jì)算得到:

(7)

其中,A0為Tris緩沖溶液與DPPH溶液混合反應(yīng)后的吸光度,Ai為QUE和BHb混合溶液與DPPH溶液混合反應(yīng)后的吸光度,Aj為QUE和BHb的混合溶液與Tris緩沖溶液混合反應(yīng)后的吸光度.

QUE-BHb對(duì)DPPH自由基的清除率見圖8.由圖8可知,保持QUE濃度不變,加入梯度濃度的BHb,QUE對(duì)DPPH自由基的清除率在加入BHb后顯著提高,表明BHb可以促進(jìn)QUE對(duì)DPPH自由基的清除.QUE對(duì)DPPH自由基的清除率在0～1×10-6mol·L-1范圍內(nèi)上升,而在1×10-6mol·L-1～ 8×10-6mol·L-1范圍內(nèi)反而下降,表明QUE對(duì)DPPH自由基的清除率,對(duì)BHb濃度沒有依賴性,過高濃度的BHb反而不利于QUE對(duì)DPPH自由基的清除,降低其抗氧化性.

圖8 QUE-BHb對(duì)DPPH自由基的清除率

3 結(jié) 論

Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而減小,QUE對(duì)BHb熒光的猝滅是一個(gè)靜態(tài)猝滅過程.熱力學(xué)參數(shù)ΔH<0、ΔS<0,說明QUE與BHb結(jié)合的作用力主要為氫鍵和范德華力.根據(jù)熒光共振轉(zhuǎn)移理論,QUE與BHb中Trp殘基之間的平均結(jié)合距離為2.09 nm.QUE可使BHb構(gòu)象和微環(huán)境發(fā)生變化,QUE與BHb中心腔結(jié)合可形成QUE-BHb復(fù)合物.QUE與BHb結(jié)合可使QUE對(duì)DPPH自由基的清除率顯著提升,且對(duì)BHb沒有濃度依賴性.該研究有助于從分子水平了解QUE在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝,以及對(duì)BHb空間構(gòu)象和生物學(xué)功能的影響,可為設(shè)計(jì)、修飾和篩選黃酮類藥物分子提供依據(jù).