陳穎綜述 董衛(wèi)國(guó)審校

原發(fā)性肝癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率與病死率居高不下,是全球第6大常見的癌癥,也是癌癥死亡的第3大原因[1]。在我國(guó),原發(fā)性肝癌是第4位常見惡性腫瘤和第2位腫瘤致死病因[2]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最多發(fā)的類型,占比高達(dá)75%～85%[1]。HCC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、異質(zhì)性大,肝炎病毒感染、酒精或非酒精性脂肪性肝病、黃曲霉毒素、遺傳誘發(fā)因素等均與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對(duì)于符合特定條件的患者,手術(shù)切除是最佳的治療手段,但手術(shù)后也伴隨著極大復(fù)發(fā)可能。鑒于疾病復(fù)雜性及個(gè)體差異化,目前臨床推薦多學(xué)科參與,制訂個(gè)體化的綜合治療方案[3]。

諸多研究表明,三結(jié)構(gòu)域蛋白21(tripartite motif containing protein 21,TRIM21)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡及干燥綜合征等自身免疫性疾病相關(guān),其在特異性與非特異性抗病毒感染中也發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[4-5]。近年來(lái),TRIM21在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也備受重視。如TRIM21參與諸多惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程,包括乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、腎癌等[6-9]?，F(xiàn)階段的研究提示以TRIM21為靶點(diǎn)的治療方式有望在癌癥的臨床實(shí)踐中得以應(yīng)用。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)TRIM21在HCC中也扮演著復(fù)雜且重要的角色,但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)較全面的描述,故本文對(duì)TRIM21在HCC發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 TRIM21的結(jié)構(gòu)與功能

TRIM21屬于TRIM家族的成員,編碼該蛋白的基因位于11號(hào)染色體上,在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)。TRIM21蛋白氨基端包含TRIM家族蛋白特征保守的RING、B-box和Coiled-coil結(jié)構(gòu)域,其羧基端則為PRYSPRY結(jié)構(gòu)域。RING結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶活性[10];B-box(在TRIM21中為1個(gè)B-box2)結(jié)構(gòu)域或能調(diào)節(jié)由RING介導(dǎo)的泛素化以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用[11];Coiled-coil結(jié)構(gòu)域參與TRIM21同源二聚體的形成,進(jìn)而促進(jìn)RING結(jié)構(gòu)域E3連接酶的底物識(shí)別與泛素化過(guò)程[12];PRYSPRY結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)蛋白質(zhì)及RNA的各種底物分子的識(shí)別[13]。蛋白質(zhì)的泛素化修飾由酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成。泛素在ATP依賴性反應(yīng)中被E1酶激活并在C末端與E1形成硫酯鍵,然后轉(zhuǎn)移到E2酶的半胱氨酸活性位點(diǎn)上形成E2-Ub硫酯中間體。E3連接酶與E2-Ub硫酯和底物結(jié)合,催化泛素從E2的活性位點(diǎn)半胱氨酸轉(zhuǎn)移到底物賴氨酸殘基或N末端。RING結(jié)構(gòu)域是真核生物中重要的E3泛素連接酶,泛素化的蛋白接著被引導(dǎo)入蛋白酶體并被降解,從而抑制蛋白的活性[14]。現(xiàn)有研究證實(shí)TRIM21發(fā)揮各種功能很大程度上基于其E3泛素連接酶活性。

2 TRIM21在HCC中的表達(dá)

2.1 表達(dá)增加 有學(xué)者在人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站中對(duì)相關(guān)免疫組織化學(xué)圖像進(jìn)行比較,得出人類HCC組織TRIM21的蛋白質(zhì)表達(dá)水平高于正常組織的結(jié)論[15]。類似的,通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)分析,結(jié)果顯示HCC組織較正常肝組織TRIM21表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常人肝細(xì)胞系MIHA相比,TRIM21在Hep3B中表達(dá)增高[16]。Wang等[17]將49個(gè) HCC 樣本作為病例組,29個(gè)癌旁組織和20個(gè)肝血管瘤組織的隊(duì)列作為對(duì)照,進(jìn)行了TRIM21免疫組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)TRIM21蛋白水平在HCC組織中明顯高于來(lái)自肝血管瘤或癌旁的非惡性肝組織。

2.2 表達(dá)減少 相反地,亦有研究通過(guò)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus,GEO)中的高通量數(shù)據(jù),得出TRIM21在HCC組織中表達(dá)降低的結(jié)論[18]。相較正常人肝細(xì)胞系MIHA,TRIM21在HepG2、Huh7和SK-Hep-1中mRNA水平降低[16]。Ding 等[18]用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)了TRIM21在70個(gè)肝癌組織樣本(61例HCC和9例膽管細(xì)胞癌)和10個(gè)非腫瘤性肝組織樣本中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)正常肝組織中強(qiáng)陽(yáng)性或中度陽(yáng)性樣本的百分比顯著高于腫瘤組織。在人HCC細(xì)胞系SMMC7721、Huh7、Bel-7402、PLC、LM3、97L、97H中,TRIM21的蛋白表達(dá)低于正常肝細(xì)胞系L02。

HCC組織中TRIM21的表達(dá)水平是否較正常肝組織升高,不同的研究通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析、肝癌細(xì)胞系與臨床樣本收集檢測(cè)的方式得出了不同的結(jié)論?；跀?shù)據(jù)庫(kù)中的分析存在著不同的研究在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)選取不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步分析的差異。而收集臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中也存在著納入與排除標(biāo)準(zhǔn)不同,收集樣本的數(shù)量、來(lái)源、人種、性別、分期等因素的差異。無(wú)論是收集到的在線數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣本或臨床收集樣本都需要樣本具有代表性才能更好地推論TRIM21在HCC總體中表達(dá)的變化情況?；A(chǔ)研究中針對(duì)肝癌細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞系進(jìn)行TRIM21表達(dá)量的檢測(cè)也與細(xì)胞系的類型密切相關(guān)。

3 TRIM21差異表達(dá)與HCC的聯(lián)系

在細(xì)胞和動(dòng)物模型中進(jìn)行TRIM21表達(dá)的敲除或者敲低,所引起的HCC調(diào)節(jié)也存在兩個(gè)截然相反的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生的HCC模型中,TRIM21敲除小鼠相較野生型小鼠誘導(dǎo)模型,其肝損傷更嚴(yán)重并且產(chǎn)生了更多的癌結(jié)節(jié)[19]。實(shí)驗(yàn)性敲低97H及LM3細(xì)胞系中TRIM21的表達(dá)可增強(qiáng)HCC 細(xì)胞的體外侵襲能力;裸鼠尾靜脈注射siTRIM21 LM3細(xì)胞可增強(qiáng)其肺轉(zhuǎn)移能力[20]。此外,李濤等[21]通過(guò)siRNA干擾肝癌細(xì)胞系中TRIM21的表達(dá),發(fā)現(xiàn)TRIM21表達(dá)降低可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。同樣的,Ding 等[18]研究顯示HepG2和LM3細(xì)胞中TRIM21的沉默可促進(jìn) HCC 細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和癌細(xì)胞抗凋亡。相反地,有研究提示小鼠TRIM21敲除可抑制二乙基亞硝胺/苯巴比妥誘導(dǎo)下的HCC發(fā)展[17]。

TRIM21表達(dá)水平的高低與HCC疾病進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系在不同的研究中也未得到一致的結(jié)論。有研究認(rèn)為TRIM21的mRNA表達(dá)水平與HCC的個(gè)體癌癥分期和腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。然而,進(jìn)一步分析顯示TRIM21的mRNA表達(dá)與HCC患者的預(yù)后相關(guān)性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。而另有研究指出,TRIM21高表達(dá)患者較低表達(dá)患者預(yù)后更差[16]。另一項(xiàng)研究認(rèn)為TRIM21的高表達(dá)與疾病進(jìn)展及較差的總生存期呈正相關(guān),但與無(wú)病生存期無(wú)關(guān)[22]。但是,Ding 等[18]的研究分析了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)數(shù)據(jù),結(jié)果提示TRIM21高表達(dá)腫瘤比TRIM21低表達(dá)腫瘤具有更佳的預(yù)后。研究證明抑制代償性NRF2升高可增強(qiáng)雙硫侖/Cu誘導(dǎo)的鐵死亡對(duì) HCC細(xì)胞的攻擊,從而促進(jìn)雙硫侖/Cu和索拉非尼協(xié)同作用的細(xì)胞毒性[22]。Nrf2還受到Quiescin巰基氧化酶1抑制,協(xié)同增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡[23]。在HepG2細(xì)胞系中的研究表明,P62表達(dá)水平的上調(diào)與肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性降低有關(guān)[24]。由此猜測(cè),TRIM21對(duì)P62-Keap1-Nrf2途徑的抑制作用可能增強(qiáng)索拉非尼治療的敏感性。此外,明確HCC中TRIM21差異表達(dá)有助于TRIM21在HCC診斷中的應(yīng)用。Wang等[17]比較了TRIM21與臨床常用的HCC生物標(biāo)志物甲胎蛋白的診斷能力,發(fā)現(xiàn)在受試者工作特征曲線中,TRIM21的曲線下面積(AUC=0.798)高于甲胎蛋白(AUC=0.756)。有趣的是,TRIM21基因多態(tài)性也與HCC相關(guān),并可用于評(píng)估HCC患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Lee等[25]分析了來(lái)自1 196例正常對(duì)照組和394例HCC患者的TRIM21基因的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性:rs4144331和re915956,發(fā)現(xiàn)擁有TRIM21 rs915956 A等位基因的年輕患者(<65歲)和有吸煙史且攜帶rs4144331的T等位基因的患者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)均增加。

TRIM21參與 HCC 發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié),明確TRIM21在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制對(duì)HCC臨床診斷、治療、預(yù)后判斷有潛在的價(jià)值,甚至可發(fā)現(xiàn)HCC治療的新靶點(diǎn),進(jìn)而補(bǔ)充現(xiàn)有治療方案。

4 TRIM21在HCC中的作用機(jī)制

4.1 p62-Keap1-Nrf2途徑 有研究報(bào)道TRIM21利用其泛素E3連接酶活性調(diào)節(jié)p62-Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch like-ECH-associated protein 1,Keap1)-核因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)途徑,從而促進(jìn)HCC發(fā)生。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明TRIM21敲除可防止氧化性肝損傷從而減少HCC的發(fā)生發(fā)展[17]。

Nrf2在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)以適應(yīng)性地響應(yīng)外源化合物和氧化應(yīng)激中占據(jù)著重要的角色[26]。處于穩(wěn)態(tài)時(shí),Keap1與細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2相互作用并促進(jìn)Keap1依賴的泛素化,繼而使Nrf2在蛋白酶體中被降解而維持在較低水平,即Keap1是Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在氧化應(yīng)激情況下,Keap1對(duì)Nrf2的抑制作用主要受到經(jīng)典與非經(jīng)典途徑的負(fù)調(diào)控,Nrf2較穩(wěn)態(tài)時(shí)表達(dá)增加[27]。(1)經(jīng)典途徑:Keap1的半胱氨酸殘基被氧化并誘導(dǎo)其構(gòu)象變化,這種蛋白修飾阻止Keap1對(duì)Nrf2的泛素化,更多的Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。(2)非經(jīng)典途徑:SQSTM1/p62(簡(jiǎn)稱p62)具有ETGE基序的蛋白質(zhì),磷酸化的p62與Keap1親和力增高,競(jìng)爭(zhēng)Keap1-Nrf2結(jié)合,從而阻斷Keap1依賴的Nrf2泛素化。Nrf2正調(diào)節(jié)p62基因表達(dá),構(gòu)成正反饋環(huán)路。通過(guò)上述途徑,更多的Nrf2發(fā)生核易位并與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合,激活抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[28]。TRIM21在蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下利用其PRYSPRY結(jié)構(gòu)域直接與p62相互作用并通過(guò)K63鍵在賴氨酸K7處泛素化p62,進(jìn)而阻礙p62的寡聚化及與Keap1的結(jié)合,抑制p62-Keap1-Nrf2抗氧化應(yīng)激途徑[29],從而增加細(xì)胞氧化損傷并誘發(fā)HCC。

最近的研究已經(jīng)確定了Nrf2的許多功能,超出了其氧化還原調(diào)節(jié)能力,其中就包括其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的復(fù)雜作用[30]。p62的缺失促進(jìn)了L-Atg5/Tsc1雙基因敲除鼠中肝臟腫瘤的進(jìn)展。Nrf2敲除能夠加強(qiáng)肝細(xì)胞的增殖,改善雙基因敲除小鼠的代謝重編程和存活,而不會(huì)形成腫瘤[31]。在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型中,在HCC發(fā)展過(guò)程中Nrf2靶向基因的表達(dá)逐漸增加,Nrf2同Keap1與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的相互作用在HCC結(jié)節(jié)內(nèi)被破壞[32]。有研究表明,TRIM21和p62之間的關(guān)聯(lián)可被升高的RPRD1A競(jìng)爭(zhēng)性地中斷,隨后抑制p62的泛素化,穩(wěn)定Nrf2,進(jìn)一步促進(jìn)HCC的進(jìn)展[33]。一項(xiàng)在大鼠中的研究提示Nrf2在肝癌發(fā)生的早期會(huì)發(fā)生突變或者激活,這在后續(xù)肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[34]。

與氧化應(yīng)激反應(yīng)類似,p62-Keap1-Nrf2抗氧化途徑在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用復(fù)雜,與具體病理生理環(huán)境相關(guān),是一把雙刃劍,同時(shí)在疾病的不同階段有不同的促癌機(jī)制[35]。基于p62-Keap1-Nrf2抗氧化途徑多樣的調(diào)節(jié)效應(yīng),以及HCC發(fā)病機(jī)制的高度復(fù)雜性與異質(zhì)性,需要更多的相關(guān)研究來(lái)明確TRIM21利用該途徑對(duì)HCC發(fā)揮的作用。

4.2 抗HBV途徑 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC的重要危險(xiǎn)因素。TRIM21能夠抑制病毒的復(fù)制,從而減少由病毒性肝炎發(fā)展而來(lái)的HCC。HBV病毒DNA復(fù)制過(guò)程中,TRIM21可結(jié)合HBx蛋白發(fā)揮其E3泛素連接酶活性使得相關(guān)蛋白降解,從而抑制病毒復(fù)制與HCC發(fā)生發(fā)展[36]。HBx是由HBV DNA開放閱讀框X編碼的一種調(diào)節(jié)蛋白,是通過(guò)蛋白質(zhì)間相互作用控制細(xì)胞和病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)HBV病毒感染的關(guān)鍵。此外,HBx還在HCC中扮演重要角色,通過(guò)調(diào)節(jié)HCC標(biāo)志物以維持增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),逃避生長(zhǎng)抑制,促進(jìn)免疫逃逸和永生性復(fù)制,輔助參與腫瘤引發(fā)的炎性反應(yīng),觸發(fā)侵襲和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)血管生成,誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定,防止細(xì)胞凋亡和擾亂細(xì)胞能量代謝來(lái)影響下游細(xì)胞機(jī)制[37]。HBV感染早期,特異性抗體尚未形成,TRIM21可以與HBx直接結(jié)合,促進(jìn)HBx降解[36]。特異性抗體形成之后,抗體包被病毒并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),TRIM21的PRYSPRY結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗體的Fc段,從而介導(dǎo)HBx蛋白質(zhì)降解[38]。除了泛素化降解HBx蛋白之外,有研究表明TRIM21可以結(jié)合HBV DNA聚合酶并參與泛素化降解,進(jìn)一步抑制病毒復(fù)制活性[39]。

綜上所述,TRIM21通過(guò)介導(dǎo)HBV復(fù)制所需的HBx蛋白以及HBV DNA聚合酶的泛素化降解以抑制HBV的復(fù)制。同時(shí),HBx在HCC進(jìn)程中發(fā)揮多種多樣的作用,促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。TRIM21通過(guò)抗HBV途徑對(duì)HCC起到抑癌因子的作用。

4.3 其他途徑 HCC的危險(xiǎn)因素眾多,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,TRIM21在其他通路中泛素化降解相關(guān)蛋白,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Wang等[40]報(bào)道,胰腺祖細(xì)胞分化和增殖因子與RIPK1相互作用,通過(guò)募集TRIM21促進(jìn)了RIPK1 k63相關(guān)的泛素化,促進(jìn)了RIPK1和NF-κB信號(hào)的激活,從而抑制HCC。一項(xiàng)研究利用免疫共沉淀測(cè)定表明TRIM21能夠與β-連環(huán)蛋白相互結(jié)合,TRIM21通過(guò)促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的泛素化和降解來(lái)抑制β-連環(huán)蛋白的核易位,繼而抑制HCC細(xì)胞的侵襲[20]。另一項(xiàng)研究提示乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1 (acetyl-CoA acetyltransferase 1,ACAT1)使甘油磷酸-O-酰基轉(zhuǎn)移酶(glyceronephosphate O-acyltransferase,GNPAT)在K128位點(diǎn)乙?；?抑制TRIM21介導(dǎo)的GNPAT泛素化和降解。更多穩(wěn)定的GNPAT加速抑制TRIM21介導(dǎo)的脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)降解并促進(jìn)脂質(zhì)代謝[41]。實(shí)驗(yàn)證明,shRNA介導(dǎo)的ACAT1消融和GNPAT乙酰化缺失可抑制裸鼠異種移植和二乙基亞硝胺/四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠HCC中的脂質(zhì)代謝和腫瘤進(jìn)展。此外,聯(lián)合ACAT1抑制劑與索拉非尼給藥可顯著延緩小鼠腫瘤的形成[41]。類似地,李濤等[21]認(rèn)為TRIM21通過(guò)下調(diào)自噬相關(guān)蛋白4B(autophagy-related protein 4B,ATG4B)影響細(xì)胞周期,進(jìn)而抑制HCC細(xì)胞增殖。

5 小結(jié)與展望

TRIM21具有泛素連接酶E3活性,參與蛋白質(zhì)泛素化降解,影響蛋白生物活性,從而發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。在不同的研究中,HCC中TRIM21的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)一結(jié)論,但更多的研究認(rèn)為HCC中TRIM21表達(dá)增加。這可能與不同研究之間所檢索的在線數(shù)據(jù)庫(kù)以及納入研究的病例數(shù)和患者特征存在差異有關(guān)。增加病例數(shù),根據(jù)患者特征進(jìn)行分組分析與合理設(shè)置對(duì)照或能得出信度與效度更高的結(jié)論。TRIM21對(duì)HCC調(diào)控結(jié)果也存在爭(zhēng)議。TRIM21通過(guò)對(duì)p62-Keap1-Nrf2途徑負(fù)調(diào)節(jié)以對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng),但氧化應(yīng)激本身在癌癥中就擁有著雙面效應(yīng),在導(dǎo)致HCC中,TRIM21通過(guò)此途徑引發(fā)相反的調(diào)節(jié)作用。此外,TRIM21能夠加速HBx和HBV DNA聚合酶降解,抑制HBV復(fù)制與發(fā)揮其他抗HCC作用。β-連環(huán)蛋白、ATG4B、GNPAT和FASN等在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)的泛素化也由TRIM21介導(dǎo),最終抑制HCC發(fā)生發(fā)展。HCC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,患者間異質(zhì)性大,TRIM21在不同病因?qū)е碌腍CC及不同階段有不同的表現(xiàn),這可能是導(dǎo)致結(jié)論不一致的重要因素。TRIM21與HCC 之間關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜,想要清晰描繪TRIM21在HCC中的作用網(wǎng)絡(luò)并應(yīng)用于臨床需要展開更多更全面而深入的研究。