劉郁夫,陳曉潔,區(qū)炳明,容 芳,郝文茜,4,陳瑞愛2,,4*

(1.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東肇慶 526060;2.華農(nóng)(肇慶)生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司,廣東肇慶 526238;3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心,廣東肇慶 526238;4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

H5亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是一種重要的禽類動物疫病病原,以高發(fā)病率、高致死率、傳播速度快、病毒變異快為主要特點[1]。H5亞型AIV每年給我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失,是我國一類動物疫病,屬于國家強制免疫范疇。目前我國針對H5亞型AIV的防控主要依賴滅活疫苗免疫[2],但H5亞型AIV可感染人,具有重要的公共衛(wèi)生意義,因此H5亞型AIV傳統(tǒng)雞胚苗的生產(chǎn)還需要生物安全三級車間,并且生產(chǎn)的AIV病毒液中含有大量雞胚雜蛋白,不利于病毒液進(jìn)一步的濃縮純化。探索AIV新型亞單位疫苗的生產(chǎn)制備方法,具有良好的應(yīng)用前景[3-4]。

AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬成員,基因組由8條分節(jié)段的RNA組成,至少編碼11種病毒蛋白,根據(jù)病毒表面的糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)可將AIV分為不同的亞型[5-6]。其中HA是AIV主要的免疫原性蛋白,試驗表明SPF雞體內(nèi)HA抗體水平越高,抵抗同源AIV攻毒的保護(hù)率越高[6-7]。

此前國內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報道通過各種方法制備AIV HA蛋白,如大腸埃希氏菌原核表達(dá)系統(tǒng)[8]、桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[9]、病毒活載體系統(tǒng)[10]等,其中桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的蛋白因具有一定糖基化修飾、蛋白產(chǎn)量高、表達(dá)成本低、便于放大懸浮生產(chǎn)等優(yōu)點而研究較多。本試驗以H5亞型AIV國內(nèi)流行分支clade 2.3.4.4d的HA基因為靶基因,通過桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),并利用Strep-tag親和層析純化重組蛋白,以提高HA蛋白純度和回收率,保持HA蛋白的生物活性。本試驗可為H5亞型AIV新型疫苗研發(fā)、HA單克隆抗體制備及后續(xù)研究奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 pFastBac1質(zhì)粒、Sf9昆蟲細(xì)胞,由嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心保存。DH5α感受態(tài)細(xì)胞(C1100),DH10BAC感受態(tài)細(xì)胞(C1480),北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 H5亞型AIV雞陽性血清(Re-11株),由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司提供;PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(R050A),BamHⅠ限制性內(nèi)切酶(1605),HindⅢ限制性內(nèi)切酶(1615),寶日醫(yī)生物科技(北京)有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小量提取試劑盒(D6943),膠回收試劑盒(D2500),BAC/PAC DNA小量提取試劑盒(D2156),OMEGA公司產(chǎn)品;青鏈霉素混合液(P1400),Anti-Strep鼠源單抗(K200012M),FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(SF131),FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗(K1035R-FITC),羊抗鼠酶標(biāo)二抗(SE131),兔抗雞酶標(biāo)二抗(SE235),Strep瓊脂糖樹脂(YA2500),北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;胎牛血清(31985088),Sf-900 Ⅲ昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(12658035),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Ⅱ(10362100),Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(31985088),Gibco公司產(chǎn)品;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A),硝酸纖維素膜(FFN02),BeyoECL Plus(P0018S),上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(C1000-48/48),伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品;超微量分光光度計(nanodrop one),生物安全柜(1389),倒置熒光成像系統(tǒng)(EVOS M5000),賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡(DMI1),德國徠卡顯微系統(tǒng)公司產(chǎn)品;全能型成像儀(AI800),美國通用電氣公司產(chǎn)品;生化培養(yǎng)箱(LRH-250),上海一恒科學(xué)儀器有限公司;凝膠成像儀(2500B),上海天能生命科學(xué)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因設(shè)計與合成 從NCBI網(wǎng)站上下載H5亞型禽流感病毒中國流行株A/duck/China/1033/2017(H5N1)(clade 2.3.4.4d)的HA蛋白序列(MK554842),在HA基因的起始密碼子之前設(shè)計Kozac序列和BamHⅠ酶切位點,并將HA的血凝素信號肽序列替換成蜂毒素信號肽序列(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA),在肽鏈C端設(shè)計Strep-tag Ⅱ小分子標(biāo)簽(WSHPQFEK)和HindⅢ酶切位點,基因序列由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化和合成。

1.2.2 重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-HA的構(gòu)建 使用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,將目的基因HA克隆至桿狀病毒穿梭質(zhì)粒中pFastBac1,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,PCR鑒定正確的單菌落送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序驗證,序列完全沒有突變的質(zhì)粒命名為pFastBac-HA。HA基因的PCR鑒定引物序列HA-F:AAATCGCCACCAGAAGTAAGA,HA-R:CTGCGTTGTAAGTCCAGAC- G,擴增的目的片段大小約642 bp。

根據(jù)說明書構(gòu)建重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-HA,向剛化凍的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中加入桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBac-HA 10 ng,于冰上靜置30 min后,置于42℃水浴鍋熱擊90 s,之后向感受態(tài)細(xì)胞加入900 μL SOC培養(yǎng)基(不含抗生素),并置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)4 h,取50 μL菌液涂布于抗性LB平板中。平板中含卡那霉素50 μg/mL、四環(huán)素10 μg/mL、慶大霉素7 μg/mL、IPTG 125 μg/mL、X-gal 100 μg/mL,37℃溫箱培養(yǎng)20 h后挑選白色單菌落進(jìn)行PCR鑒定。

根據(jù)BAC/PAC DNA小量提取試劑盒(D2156)說明書抽提重組HA基因的桿狀病毒桿粒Bacmid-HA,檢測核酸濃度后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組桿狀病毒的拯救 將處于對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞以1×106個細(xì)胞每孔的密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置于27℃溫箱培養(yǎng)2 h,取3 μg的桿粒Bacmid-HA,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將桿粒Bacmid-HA轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至96 h,細(xì)胞經(jīng)凍融3次后離心取上清,并在Sf9細(xì)胞中連續(xù)盲傳3代,直至產(chǎn)生Sf9細(xì)胞變大、漂浮、脫落等明顯細(xì)胞病變[11]。

1.2.4 間接免疫熒光試驗 將收集的桿狀病毒病毒液接種重新至Sf9細(xì)胞,置于27℃溫箱培養(yǎng)72 h后,經(jīng)4%多聚甲醛固定處理、0.1% Triton X-100細(xì)胞透化,分別以anti-Strep鼠源單抗(1∶500稀釋)和H5亞型陽性血清(1∶250稀釋)為一抗孵育1 h,用PBS洗滌3次,再用FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶500稀釋)和FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗(1∶500稀釋)孵育1 h,然后置于熒光顯微鏡下觀察[12]。

1.2.5 重組HA蛋白的表達(dá)與純化 收集接種桿狀病毒病毒液的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞總蛋白,通過Western blot試驗檢測HA蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)12% SDS-PAGE電泳、NC膜轉(zhuǎn)印、5%脫脂奶粉封閉后,分別以anti-Strep鼠源單抗(1∶1 000稀釋)和H5亞型陽性血清(1∶250稀釋)為一抗,羊抗鼠酶標(biāo)二抗(1∶10 000稀釋)和兔抗雞酶標(biāo)二抗(1∶10 000稀釋)孵育NC膜,以化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行成像。最后通過strep標(biāo)簽親和層析的方式從Sf9細(xì)胞上清中純化HA重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-HA的構(gòu)建

構(gòu)建的桿狀病毒穿梭質(zhì)粒pFastBac-HA經(jīng)測序驗證完全正確,并且從抗性平板挑取的白色單菌落,可通過PCR檢測到大小相似的目的條帶(圖1),表明重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-HA構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～8.Bacmid-HA菌液PCR鑒定M.DNA Marker DL 5 000; 1-8.PCR identification of Bacmid-HA圖1 重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-HA的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant baculovirus plasmid Bacmid-HA

2.2 重組桿狀病毒的拯救

結(jié)果如圖2所示,表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA基因的重組桿狀病毒在盲傳3代后,可見細(xì)胞形態(tài)變大、死亡脫落等細(xì)胞病變,表明重組桿狀病毒拯救成功。分別以anti-Strep鼠源單抗和H5亞型禽流感病毒陽性血清為一抗,進(jìn)行間接免疫熒光檢測,可觀察到大約50%～80%的Sf9細(xì)胞被綠色熒光著色,表明接種重組桿狀病毒后,Sf9細(xì)胞可表達(dá)特異性目的蛋白(圖3)。

A.正常Sf9細(xì)胞;B.桿狀病毒感染引起的細(xì)胞病變A.Normal Sf9 cells; B.Cytopathic effect caused by baculovirus infection圖2 重組桿狀病毒感染造成的Sf9細(xì)胞病變Fig.2 Sf9 cell cytopathic effect caused by recombinant baculovirus

A.以anti-Strep鼠源單抗為一抗孵育;B.以H5陽性血清為一抗孵育;C.空白對照A.Incubation with anti-Strep monoclonal antibody as primary antibody; B.Incubation with H5 positive serum as primary antibody; C.Blank control圖3 間接免疫熒光鑒定Fig.3 Indirect immunofluorescence identification

2.3 重組HA蛋白的表達(dá)與鑒定

為鑒定感染重組桿狀病毒是否表達(dá)H5亞型AIVHA蛋白,將重組桿狀病毒接種Sf9細(xì)胞72h后,收集細(xì)胞總蛋白,分別以anti-Strep鼠源單抗和H5陽性血清為一抗,進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示(圖4A,圖4B),anti-Strep鼠源單抗和H5陽性血清都能與蛋白樣品在70 ku蛋白處可出現(xiàn)有一特異性反應(yīng)條帶,大小與預(yù)期(65.2 ku)相符,表明Sf9細(xì)胞可成功表達(dá)H5亞型AIV HA蛋白。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.以anti-Strep鼠源單抗為一抗;2.以H5陽性血清為一抗;3.Sf9細(xì)胞接毒72 h后細(xì)胞破碎沉淀;4.Sf9細(xì)胞接毒72 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清M.Protein molecular weight Marker; 1.Incubation with anti-Strep monoclonal antibody as primary antibody; 2.Incubation with H5 positive serum as primary antibody; 3.Cell fragmentation precipitate of Sf9 72 hours post infection; 4.Cell culture supernatant of Sf9 72 hours post infection圖4 H5亞型禽流感病毒HA蛋白的Western blot鑒定Fig.4 Western blot identification of H5 subtype AIV HA protein

為鑒定重組HA蛋白的分泌形式,收集接毒72 h后的細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)上清,以anti-Strep鼠源單抗為一抗進(jìn)行Western blot鑒定,結(jié)果顯示在Sf9細(xì)胞破碎沉淀和細(xì)胞培養(yǎng)上清中均可檢測到表達(dá)HA蛋白(圖4C),且Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清中雞紅細(xì)胞凝集效價為1:64,而空載桿狀病毒感染的血凝效價為0(圖5A)。

2.4 重組HA蛋白的純化

采用親和層析方法對細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行純化,使用50 mmol/L碳酸銨,0.5 mol/L NaCl, pH10.0的洗滌液洗滌雜蛋白,使用50 mmol/L乙酸銨,0.5 mol/L NaCl,pH4.0的洗脫液洗脫目的蛋白,純化后產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳(圖5B),在70 ku分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附近可觀察到一條明顯的目的條帶,純度90%以上,經(jīng)Bradford法檢測HA重組蛋白濃度為0.364 mg/mL。

3 討論

HA基因編碼的血凝素蛋白HA分布在病毒囊膜表面,是決定AIV受體結(jié)合特異性的關(guān)鍵蛋白,具有凝集雞紅細(xì)胞的作用[2]。當(dāng)病毒粒子表面的HA蛋白與宿主細(xì)胞膜表面的唾液酸受體識別結(jié)合后,啟動下游信號通路介導(dǎo)病毒粒子通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)[13]。HA蛋白是AIV主要的免疫原性蛋白,在疫苗免疫評價中常通過微量血凝抑制試驗法,檢測免疫后血清中HA抗體的效價[14]。

目前H5亞型AIV商品化疫苗以雞胚滅活疫苗為主,但雞胚生產(chǎn)的傳統(tǒng)滅活疫苗存在著外源病毒污染、需要生物安全三級生產(chǎn)車間等缺陷,AIV亞單位疫苗的研發(fā)是當(dāng)前AIV研究熱點[15-16]。Ecker等[14]通過哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功實現(xiàn)H1N1 HA蛋白的表達(dá)純化,并且表達(dá)的蛋白具有凝集雞紅細(xì)胞的生物特性,可適用于大規(guī)模蛋白生產(chǎn),但未評價HA重組蛋白在實驗動物中的免疫原性。相比哺乳動物表達(dá)系統(tǒng),桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的蛋白表達(dá)成本更低,具有一定的糖基化修飾,且可同時高效表達(dá)多種蛋白[17]。Yang等[18]利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng),構(gòu)建可同時表達(dá)H5、N6和M1蛋白的病毒樣顆粒,該病毒樣顆粒在小鼠模型具有良好的抗原性,但尚未評價該病毒樣顆粒在SPF雞中的免疫保護(hù)力。類似的,王同燕等[19]也將H9、N2和M1基因的全長片段克隆到桿狀病毒穿梭質(zhì)粒上,拯救重組桿狀病毒,并且免疫保護(hù)試驗證明,該病毒樣顆粒制備的疫苗可有效降低H9亞型AIV攻毒導(dǎo)致的SPF雞排毒。此外仝曉丹等[20]也成功利用桿狀病毒表達(dá)H5亞型AIV的HA蛋白,并且通過His鎳株親和層析獲得可溶性表達(dá)的HA。上述試驗結(jié)果均表明桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)是一種技術(shù)成熟、高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

為表達(dá)具有生物活性的HA蛋白、研制AIV亞單位疫苗,本試驗通過桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)H5亞型AIV的HA蛋白,并將HA信號肽替換成蜂毒信號肽,以提升分泌表達(dá)的水平。與6×組氨酸標(biāo)簽相比,Strep-tag親和純化系統(tǒng)具有純化過程溫和、目的蛋白純度高、特異性強、兼容多種表達(dá)系統(tǒng)等優(yōu)點[21],因此本試驗在HA蛋白C端設(shè)計Strep-tag標(biāo)簽,以提高重組蛋白的純度和回收率。最終本試驗表達(dá)的HA蛋白可以細(xì)胞培養(yǎng)上清的形式表達(dá),并且可與Strep標(biāo)簽抗體、H5亞型陽性血清特異性結(jié)合,具有良好的生物學(xué)活性,可凝集雞紅細(xì)胞(血凝效價為1∶64),親和純化回收后蛋白濃度為0.364 mg/mL,但與同類報道相比,表達(dá)純化的HA重組蛋白產(chǎn)量較低,需要進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件,且該HA重組蛋白在實驗動物中是否具有良好的免疫原性,仍需后續(xù)試驗證明。本試驗可為H5亞型AIV亞單位疫苗研發(fā)、HA單克隆抗體制備等后續(xù)研究奠定前期基礎(chǔ)。