王澤亮，范智義，張 敏，張星燦，陳相杰，宋小焱，鄧維琴，張其圣，4，李 恒，4，5*

（1 四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司 成都611130 2 四川振興產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司 成都610023 3 成都圣恩生物科技股份有限公司 成都611130 4 四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 四川眉山620030 5 江南大學(xué) 江蘇無(wú)錫 214000）

香辛料作為一種天然的食品添加劑，有改善食品風(fēng)味、掩蓋不良?xì)馕兜淖饔肹1-3]，是川鹵鹵汁揮發(fā)性風(fēng)味的重要來(lái)源[4]。解析其在鹵汁中的風(fēng)味貢獻(xiàn)作用，對(duì)實(shí)現(xiàn)川鹵標(biāo)準(zhǔn)化有著重要意義。當(dāng)前，川鹵鹵汁中的香辛料種類達(dá)20 余種，多種香辛料及原輔料的共同作用使得川鹵鹵汁風(fēng)味體系相對(duì)復(fù)雜，而對(duì)鹵汁中單一香辛料的風(fēng)味貢獻(xiàn)機(jī)理尚不明確，這在一定程度上阻礙了川鹵鹵汁及川鹵制品標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。

目前，尹樂(lè)斌等[5]和伍濤等[1]分別對(duì)鹵汁中揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究，初步解析了鹵水揮發(fā)性成分構(gòu)成及其在鹵制過(guò)程中的變化規(guī)律。賀文杰[6]通過(guò)3 種常用香辛料主效成分對(duì)鹵鴨腿品質(zhì)的影響研究，確定辣椒、花椒、八角可有效增強(qiáng)鹵鴨腿風(fēng)味，改善產(chǎn)品品質(zhì)。蔡玉潔[7]解析了辣椒、花椒等6種香辛料主效成分在鹵制過(guò)程中的變化規(guī)律。張圳等[8]和孫靈霞等[9]對(duì)鹵制食品風(fēng)味的研究發(fā)現(xiàn)，鹵制食品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分大多來(lái)源于鹵汁，而鹵汁中香辛料的添加量對(duì)鹵汁及鹵制食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量有著重要影響。上述研究多集中于鹵汁風(fēng)味構(gòu)成與香辛料主效成分解析等方面，對(duì)鹵汁復(fù)雜條件下單一香辛料風(fēng)味的貢獻(xiàn)作用研究較少。

本文基于川鹵香辛料風(fēng)味貢獻(xiàn)分析模型，開(kāi)展缺失實(shí)驗(yàn)及差異性分析，解析川鹵鹵汁風(fēng)味形成關(guān)鍵香辛料及其風(fēng)味的貢獻(xiàn)作用，以期為川鹵鹵汁標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-甲基-2-戊醇（色譜純），阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；八角、小茴香、桂皮、香茅、排草、靈草、陳皮、肉蔻、川砂仁、山奈、丁香、紅花椒、干朝天椒、香通由成都圣恩生物科技股份有限公司提供；植物油購(gòu)自成都市當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.2 設(shè)備與儀器

DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FW-400A 粉碎機(jī)，青島聚創(chuàng)嘉恒分析儀器有限公司；TQ8040 三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；固相微萃取裝置，美國(guó)Supelco 公司；DB-WAXms（60 m×0.25 μm×2.5 mm）色譜柱，美國(guó)安捷倫公司；50/30 μmDVB/CAR/PDMS 固相萃取纖維，Supelco 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 川鹵香辛料風(fēng)味貢獻(xiàn)分析模型及鹵汁樣品制備 川鹵香辛料風(fēng)味貢獻(xiàn)分析模型建立：參考典型川式鹵汁制備工藝，經(jīng)工藝簡(jiǎn)化及輔料去除后進(jìn)行構(gòu)建，其具體制備步驟為：將香辛料粉碎后按表1 的比例混合，并將質(zhì)量比為1∶5 的混合香辛料粉和植物油混合均勻，加熱至200 ℃后持續(xù)攪拌5 min，自然冷卻至常溫，加入料液比為1∶18（香辛料∶水）的水煮沸，保持95 ℃以上加熱30 min，取濾液-20 ℃冷藏備用。

表1 川鹵鹵汁香辛料用量（以250 mL 計(jì)）Table 1 Spice dosage in the Sichuan seasoning stew（calculated as 250 mL）

鹵汁樣品制備：以風(fēng)味貢獻(xiàn)分析模型制得鹵汁為對(duì)照組，香辛料缺失后制得鹵汁為試驗(yàn)組，共15 組。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)照組與試驗(yàn)組間差異性分析確定不同種類香辛料對(duì)川鹵鹵汁的風(fēng)味貢獻(xiàn)作用。

1.3.2 感官評(píng)價(jià) 以未缺失鹵汁樣品為參考樣，選取15 位受過(guò)“偏好檢測(cè)”和“三點(diǎn)檢驗(yàn)”培訓(xùn)和考核的感官品評(píng)員，參考標(biāo)準(zhǔn)《Sensory analysis-Methodology-Triangle test》（ISO-4120-2021）[10]以嗅聞的方式對(duì)樣品進(jìn)行差異性感官評(píng)價(jià)，其具體步驟為：于30 ℃恒溫條件下放置3 個(gè)帶標(biāo)簽的受試樣品（包含對(duì)照組鹵汁和1 組試驗(yàn)組鹵汁），在告知感官評(píng)價(jià)人員受試樣品中存在1 個(gè)差異樣品的前提下，受試者以嗅聞的方式對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)并選出存在差異的樣品，試驗(yàn)人員通過(guò)統(tǒng)計(jì)受試人員回答正確次數(shù)進(jìn)行樣品間顯著性差異判別。

1.3.3 鹵汁樣品揮發(fā)性成分測(cè)定 參考范智義等[11]、鄧維琴等[12]方法略作修改后進(jìn)行鹵汁樣品中揮發(fā)性成分測(cè)定，具體步驟如下：取2 mL 鹵汁注入固相微萃取瓶中，加入10 μL 5 μg/mL 4-甲基-2-戊醇甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，密封萃取瓶，混合均勻后于60 ℃水浴平衡20 min，然后置入固相微萃取纖維，60 ℃萃取30 min。萃取完成后，將固相微萃取纖維插入GC 氣化室中進(jìn)行分析。

1.3.3.1 色譜條件 升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，10 ℃/min 升溫至90 ℃，保持0.5 min，2℃/min 升溫至120 ℃，保持0.5 min，10 ℃/min 升溫至140 ℃，2 ℃/min 升溫至202 ℃，7.6 ℃/min 升溫至250 ℃，保持2 min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件 氣相色譜分析以高純氦氣為載氣，質(zhì)譜離子源溫度：230 ℃，定性采用Q3 Scan掃描模式，質(zhì)荷比掃描范圍為30～500 m/z。電子轟擊能量70 eV，檢測(cè)電壓0.1 kV。揮發(fā)性化物的鑒定利用NIST17、FFNSC1 譜庫(kù)檢索結(jié)果（相似度大于80%）和人工圖譜解析共同確定。

1.3.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量及OAV（Odor activity value，OAV）計(jì)算 相對(duì)含量計(jì)算公式如式1 所示。

式中，RC——揮發(fā)性成分相當(dāng)于內(nèi)標(biāo)當(dāng)量的相對(duì)含量（μg/kg）；A1——目的物質(zhì)的峰面積；c——內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度（μg/mL）；V——內(nèi)標(biāo)添加的體積（μL）；A2——內(nèi)標(biāo)峰面積；m——鹵汁的取樣質(zhì)量（g）。

揮發(fā)性成分OAV 值計(jì)算

OAV 計(jì)算公式如式2 所示[13]。

式中，RC——揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量（mg/kg）；OT——化合物的水中嗅覺(jué)閾值（mg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021 繪 制heatmap 圖；采 用SIMCA 進(jìn)行PLS-DA 分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)差異性分析

三點(diǎn)檢驗(yàn)適用于對(duì)1 種或多種官感官指標(biāo)是否存在差別的判定[14]，該方法可通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法對(duì)兩個(gè)樣品間是否存在顯著性差異做出判別。表2 為香辛料缺失鹵汁樣品感官評(píng)價(jià)結(jié)果，同對(duì)照組相比，八角、小茴香、陳皮、肉蔻、川砂仁及靈草缺失后鹵汁樣品與對(duì)照組樣品的感官存在顯著差異（P〈0.05），說(shuō)明上述6 種香辛料缺失后將對(duì)鹵汁風(fēng)味造成較大影響，其余香辛料缺失后并未導(dǎo)致鹵汁顯著感官差異。因此，八角、小茴香等6種香辛料為川鹵鹵汁風(fēng)味形成的關(guān)鍵香辛料成分。

表2 香辛料缺失鹵汁樣品感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of missing spices and seasoning stew samples

2.2 川鹵鹵汁揮發(fā)性成分解析

對(duì)對(duì)照組鹵汁及6 種關(guān)鍵香辛料缺失后鹵汁進(jìn)行揮發(fā)性成分測(cè)定，共檢測(cè)出鹵汁樣品中揮發(fā)性物質(zhì)93 種，相對(duì)含量在0.01～70.57 μg/kg 之間，包括萜類47 種、醛酮類12 種、醇類10 種、酯類7種、烷烴類6 種、酚類7 種及其它類別化合物3種。對(duì)照組鹵汁中，萜類物質(zhì)含量最高，達(dá)114.82 μg/kg，其次依次為烷烴類、酚類化合物，其含量分別為74.94 μg/kg 和34.17 μg/kg，其余種類揮發(fā)性化合物含量相對(duì)較低（〈20 μg/kg），同尹樂(lè)斌等[5]研究結(jié)果一致。

試驗(yàn)組中揮發(fā)性物質(zhì)含量（90.56～185.37 μg/kg）較對(duì)照組（258.98 μg/kg）出現(xiàn)明顯下降（圖1），各試驗(yàn)組間存在一定差異。其中，八角、小茴香缺失后鹵汁烷烴類物質(zhì)含量明顯降低。肉蔻、川砂仁缺失后鹵汁中萜類及烷烴類物質(zhì)含量均出現(xiàn)明顯降低，靈草、陳皮中萜類、烷烴類物質(zhì)含量出現(xiàn)一定程度下降。張根生等[15]研究認(rèn)為，不同種類香辛料所含活性成分存在一定差異，對(duì)鹵制品中風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn)作用也有所不同。本研究中，試驗(yàn)組中揮發(fā)性成分含量較對(duì)照組出現(xiàn)不同程度降低，表明各關(guān)鍵香辛料對(duì)鹵汁中揮發(fā)性成分種類及含量的貢獻(xiàn)作用存在差異，與張根生等[15]研究結(jié)果一致。

圖1 鹵汁樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量熱圖Fig.1 Heatmap of volatile compound contents in seasoning stew

表3 為對(duì)照組中重要香氣化合物（OAV〉1）篩選結(jié)果。OAV 反映了化合物對(duì)于物質(zhì)總體香氣的貢獻(xiàn)程度，一般認(rèn)為OAV 大于1 便對(duì)物質(zhì)總體風(fēng)味形成具有貢獻(xiàn)作用，且OAV 越大貢獻(xiàn)作用就越明顯[16-17]。本研究重點(diǎn)解析鹵汁中重要香氣化合物36 種，包括萜類物質(zhì)21 種（83.31 μg/kg），醛酮類物質(zhì)5 種（5.21 μg/kg），醇類1 種（4.55 μg/kg），酯類2 種（0.73 μg/kg），烷烴類2 種（72.60 μg/kg），酚類3 種（0.99 μg/kg）和其它類別化合物2 種（4.68 μg/kg）。其中，萜類和烷烴類物總量達(dá)155.91 μg/kg，占鹵汁重要香氣化合物總量的90%以上，是鹵醛類物質(zhì)含量均出現(xiàn)明顯下降，說(shuō)明，3 種香辛料的共同作用將抑制或消耗鹵汁中醛類物質(zhì)抑制物，進(jìn)而增加鹵汁中醛類物質(zhì)含量，豐富鹵汁香氣。

風(fēng)味修飾化合物中，桃金娘烯醇、α-水芹烯、α-松油烯、香芹酮、3-乙基-3，6-二甲基-吡嗪、乙酸香葉酯、苯酚、水楊酸甲酯及百里香酚在部分香辛料缺失后未檢出，將對(duì)鹵汁風(fēng)味豐富度造成一定影響。其中，除香芹酮和百里香酚是由川砂仁直接貢獻(xiàn)外，其余風(fēng)味修飾化合物均由兩種或以上香辛料協(xié)同產(chǎn)生，其具體形成機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

2.3 關(guān)鍵差異性香氣成分鑒定

PLS-DA 是一種監(jiān)督性的差異分析[26]，可對(duì)各組差異性進(jìn)行判別，各組在得分圖上間距越大，表明組間差異越大。選取關(guān)鍵香辛料缺失后鹵汁與未缺失鹵汁樣品中重要香氣化合物（OAV〉1）進(jìn)行PLS-DA 分析，以明確各試驗(yàn)組間差異性成分，結(jié)果如圖2 所示。可看出，各關(guān)鍵香辛料缺失后鹵汁樣品與未缺失鹵汁樣品間存在較明顯差異（P〈0.05），表明各香辛料缺失后將導(dǎo)致鹵汁中重要香氣化合物出現(xiàn)較大變化，進(jìn)而對(duì)鹵汁風(fēng)味造成較大影響。

圖2 關(guān)鍵香辛料缺失鹵汁與未缺失鹵汁差異性分析Fig.2 Difference analysis of key spices in seasoning stew with missing and complete recipes

圖3 為鹵汁樣品PLS-DA 分析變量重要性因子VIP 值。本次共篩選出各組間重要差異性化合物（VIP 值〉1）15 種，分別為茴香烯、桃金娘烯醇、水楊酸甲酯、糠醛、反式-2-辛烯-1-醇、桉樹(shù)腦、草蒿腦、α-松油醇、反式-2-庚醛、反式-2-辛醛、辛醛、苯酚、α-松油烯、樟腦及芳樟醇。

圖3 鹵汁樣品PLS-DA 分析變量重要性因子（VIP 值）Fig.3 Significance factor of the PLS-DA analysis variables in the seasoning stew（VIP value）

圖4 為鹵汁中重要差異性化合物含量熱圖。與未缺失鹵汁樣品相比，八角缺失后鹵汁中茴香烯、水楊酸甲酯、桃金娘烯醇及苯酚含量出現(xiàn)明顯降低，表明八角對(duì)鹵汁中上述4 種揮發(fā)性成分貢獻(xiàn)作用相對(duì)突出；同理可得，小茴香對(duì)苯酚貢獻(xiàn)作用較為明顯，靈草對(duì)苯酚、糠醛貢獻(xiàn)作用較為突出，陳皮對(duì)鹵汁中糠醛具備一定貢獻(xiàn)作用，肉蔻、川砂仁對(duì)鹵汁中多種物質(zhì)均有貢獻(xiàn)作用。

圖4 重要差異性化合物含量熱圖Fig.4 Heatmap of important differential compounds

3 結(jié)論

川鹵鹵汁風(fēng)味形成是鹵汁中主體風(fēng)味化合物、關(guān)鍵風(fēng)味化合物及風(fēng)味修飾化合物共同作用的結(jié)果，反式-2，4-癸二烯醛、芳樟醇、草蒿腦、黃樟素、對(duì)傘花烴、茴香烯及反式-2-壬烯醛為川鹵鹵汁的主體風(fēng)味來(lái)源。

結(jié)合感官評(píng)定及OAV 分析認(rèn)為，八角、小茴香、陳皮、靈草、川砂仁及肉蔻對(duì)鹵汁中部分重要香氣化合物具有較為突出的貢獻(xiàn)作用，為川鹵鹵汁的關(guān)鍵香辛料成分。其中，八角對(duì)鹵汁中茴香烯、桃金娘烯醇、水楊酸甲酯及苯酚貢獻(xiàn)相對(duì)突出，小茴香對(duì)苯酚貢獻(xiàn)作用較為明顯，靈草對(duì)苯酚、糠醛貢獻(xiàn)作用較為突出，陳皮對(duì)鹵汁中糠醛具備一定貢獻(xiàn)作用，肉蔻、川砂仁對(duì)鹵汁中多種物質(zhì)均有貢獻(xiàn)作用。本研究可為川鹵鹵汁標(biāo)準(zhǔn)化、定量化發(fā)展提供一定數(shù)據(jù)參考。