李春強(qiáng)，劉 俊，趙虹霏，謝文茹，邵俊花，張銘蕓

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽 110866）

乳液是由兩種互不相容的液體借助乳化劑形成的亞穩(wěn)態(tài)體系，乳化劑因能降低自由能，減少界面張力，故常用于穩(wěn)定乳液體系。Pickering 乳液是由納米級(jí)/微米級(jí)的固體顆粒直接吸附在油-水界面的穩(wěn)定乳液[1-2]。相較小分子表面活性劑，固體顆粒更容易吸附在油-水界面上，可抑制奧斯瓦爾德熟化，使液滴間形成物理屏障，穩(wěn)定乳液[1，3-5]，具有安全性高、兼容性強(qiáng)、易生物降解等優(yōu)勢(shì)[6]，廣泛應(yīng)用于替代脂肪[7]，包埋、輸送活性物質(zhì)[8]，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期等方面[9]。食品級(jí)Pickering 乳液中固體顆粒的主要原料是來源廣泛且廉價(jià)的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等材料，通過物理方法（如加熱、超聲、高壓均質(zhì)）[10-11]或化學(xué)方法（如糖基化、pH 偏移）[12]等進(jìn)行表面修飾以提高其乳化性能。例如，加熱能使蛋白表面疏水基團(tuán)暴露出來[13]；pH 偏移可改變蛋白間靜電斥力，提高空間位阻[14-16]；超聲處理引起空化效應(yīng)使聚集的蛋白分散，暴露出更多活性基團(tuán)，改善理化和功能特性[17-19]。采用單一方法改性植物蛋白的技術(shù)雖然相對(duì)成熟，但是改性結(jié)果并不理想。有學(xué)者嘗試?yán)枚喾N改性技術(shù)來改性蛋白，獲得的大豆蛋白顆粒具備良好的熱穩(wěn)定性[20]。

本文以大豆球蛋白（SG）為研究對(duì)象，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)探究加熱、超聲、pH 偏移聯(lián)合改性制備SG 納米顆粒的最佳條件，以及體系環(huán)境（離子強(qiáng)度、二次熱處理、pH 值、凍融循環(huán)）對(duì)改性SG 納米顆粒穩(wěn)定性的影響，為其更好地應(yīng)用于食品級(jí)Pickering 乳液生產(chǎn)及功能性食品開發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕，山東萬得福生物科技有限公司；亞硫酸氫鈉（NaHSO3）、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）、氯化鈉、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（ANS-），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、考馬斯亮藍(lán)G-520，索萊寶生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；Starter2100 pH 計(jì)，奧豪斯儀器有限公司；DJ-1 大功率磁力攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；BL-500 電子天平，上海亞津電子科技有限公司；AUY120 萬分之一電子天平，日本島津公司；CR21N 高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi 公司；LG-0.2 真空冷凍干燥機(jī)，沈陽航天新陽速凍設(shè)備制造有限公司；DK-S26 水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；VCX750 超聲波細(xì)胞破碎儀，美國Sonics 公司；Zetasizer Nano ZS 納米粒度電位儀，馬爾文儀器有限公司；Cary50 紫外可見光分光光度計(jì)，美國Varian 公司；F-4600 熒光光譜儀，日本Hitachi 公司；SIM-F140adl 制冰機(jī)，松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；TSE SERIES 立式超低溫冰箱，美國賽默飛世爾科技公司；HH 數(shù)顯恒溫油浴槽，金壇市正基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SG 的提取 SG 的提取參考Takao 等[21]的方法并稍加改動(dòng)。脫脂豆粕用去離子水溶解，料水比為1∶15（g/mL），將pH 值調(diào)至7.5 后充分?jǐn)嚢? h（25 ℃），于9 000×g 離心20 min，取上清液加入終質(zhì)量濃度為1.04 g/L 的NaHSO3，調(diào)至pH 值至6.4，在4 ℃水化整夜。翌日，于8 000×g 離心20 min（4 ℃），沉淀用去離子水稀釋溶解，調(diào)pH 7.5透析48 h（4 ℃），凍干后即得SG。經(jīng)測(cè)定該SG 中蛋白質(zhì)含量為96.72%（GB/T 5009.5-2016，凱氏定氮法）、脂肪含量為0.28%（GB/T 5009.6-2016，索氏抽提法）、水分含量為3.3%（GB/T 5009.3-2016，直接干燥法），總灰分為3.1%（GB/T 5009.4-2016）。

1.3.2 聯(lián)合改性SG 納米顆粒的制備

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 取適量?jī)龈蒘G 粉末溶解于去離子水，充分?jǐn)嚢? h（25 ℃），于4 ℃水化18 h，調(diào)pH 值至7.0，在8 000×g 離心20 min（4 ℃），將上清液稀釋為2 mg/mL，采用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度[22]。將SG 溶液利用熱處理（Heating，H）、超聲處理（Ultrasound，U）和pH 偏移處理（pH，P）進(jìn)行聯(lián)合改性，依次確定最佳改性順序（HUP、HPU、UHP、UPH、PHU、PUH）、加熱時(shí)間、超聲振幅和超聲時(shí)間。加熱條件：在95 ℃水浴中加熱SG 溶液5，10，15，20，30 min；超聲條件：在額定功率750 W，輸出頻率20 kHz 條件下以30%，40%，50%，60%，70%振幅處理1，3，6，9，12 min；pH 偏移 條件：將SG 溶液pH 值調(diào)至12.0，于25 ℃緩慢攪拌1 h 后，將pH 值調(diào)至7.0，維持1 h。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 利用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化改性條件，以表面疏水性為響應(yīng)值，響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Design factors and levels of the response surface experiment

1.3.3 粒徑和Zeta-電位測(cè)定 去離子水稀釋SG納米顆粒溶液至1.0 mg/mL，采用馬爾文Zetasizer Nano ZS 納米粒度電位儀測(cè)定。參數(shù)設(shè)置：散射角為173°，水系折光系數(shù)1.33，測(cè)量溫度25 ℃。樣品測(cè)定3 次并計(jì)算平均值。

1.3.4 表面疏水性測(cè)定 采用ANS-熒光探針法測(cè)定SG 納米顆粒表面疏水性[23]。將SG 納米顆粒溶解在磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）進(jìn)行一定梯度的稀釋（0.04～0.2 mg/mL），4 mL 樣品與20 μL 8 mmol/L ANS-（pH 7.0）充分混合，避光反應(yīng)2 min 后于F-4600 熒光光譜儀測(cè)定。參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，狹縫寬5 nm。以SG 濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪圖，樣品表面疏水性由初始斜率表示。

1.3.5 外觀變化觀察 制得SG 納米顆粒溶液倒入10 mL 透明螺口試劑瓶，4 ℃貯藏，并拍照觀察。

1.3.6 溶解度測(cè)定 參考Samoto 等[24]的方法測(cè)定SG 溶解度。將未經(jīng)處理SG 溶液稀釋至固定濃度，并按照試驗(yàn)要求進(jìn)行處理。于12 000×g 離心20 min，采用Bradford 法測(cè)定上清液中蛋白含量。以離心后上清液中的蛋白質(zhì)量與樣品所含蛋白總質(zhì)量的比值表示SG 溶解度。計(jì)算公式如下：

1.3.7 穩(wěn)定性測(cè)定 以粒徑、Zeta-電位、溶解度、乳液外觀為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究離子強(qiáng)度（NaCl 終濃度0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mol/L，反應(yīng)2 h）、熱處 理（100，110，120，130，140，150 ℃，反 應(yīng)20 min）、pH 值（2，4，6，8，10，反應(yīng)1 h）、凍融循環(huán)（-20 ℃/-80 ℃冷凍24 h，室溫放置4 h 解凍，重復(fù)5 次）對(duì)改性SG 穩(wěn)定性的影響。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)所有結(jié)果均為3 次重復(fù)試驗(yàn)平均值，使用SPSS 2017 進(jìn)行方差和顯著性分析（LSD 法）；使用Origin 2018 繪圖，標(biāo)記字母以區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)間的顯著性；使用Design-Expert 8.0.6.1 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性順序?qū)G 納米顆粒的影響

2.1.1 粒徑和Zeta-電位 加熱、超聲和pH 偏移聯(lián)合處理可能產(chǎn)生協(xié)同作用，改善SG 的功能性質(zhì)，也可能相互抗衡削弱改性效果，因此改性順序?qū)Ω男孕Ч哂兄匾绊憽ｎw粒粒徑大小與蛋白功能性質(zhì)相關(guān)，粒徑越小，界面吸附效率越高，Pickering 乳液穩(wěn)定越好[25-26]。如圖1a 所示，樣品UHP 的粒徑顯著大于其它樣品（P〈0.05），樣品HPU、PHU、PUH 的粒徑較低，樣品HUP 的粒徑介于二者之間。Zeta-電位表征顆粒穩(wěn)定性，Zeta-電位的絕對(duì)值越大，顆粒之間靜電斥力越強(qiáng)，顆粒穩(wěn)定性越好[27]。由圖1b 可知，樣品HUP、PHU、PUH、UPH 和UHP 的粒徑絕對(duì)值較大，差異不顯著（P〉0.05），而樣品HPU 的Zeta-電位絕對(duì)值最低。

圖1 改性順序?qū)G 納米顆粒粒徑和Zeta-電位的影響Fig.1 Effect of modification order on the particle size and Zeta-potential of SG nanoparticles

2.1.2 表面疏水性 表面疏水性能反映蛋白疏水基團(tuán)暴露在環(huán)境中的程度，表面疏水性越高，蛋白乳化特性越好[28]。如圖2 所示，樣品HUP 的表面疏水性最高為2 648.13，而樣品HPU 和UHP 表面疏水性最低。

圖2 改性順序?qū)G 納米顆粒表面疏水性的影響Fig.2 Effect of modification order on the surface hydrophobicity of SG nanoparticles

圖3 改性順序?qū)G 納米顆粒外觀變化的影響Fig.3 Effect of modification order on the appearance changes of SG nanoparticles

2.1.3 外觀變化 將改性顆粒置于4 ℃觀察隨時(shí)間變化顆粒的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)樣品HPU 和UHP在第8 天時(shí)最先分層，樣品UPH 和PHU 在第9天分層，樣品PUH 在第10 天分層，而樣品HUP在第11 天仍未分層穩(wěn)定性最好，這與表面疏水性測(cè)定結(jié)果一致。綜上，選定HUP 為最優(yōu)改性順序。

2.2 加熱時(shí)間對(duì)SG 納米顆粒的影響

2.2.1 粒徑和Zeta-電位 由圖4 可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，聯(lián)合改性SG 納米顆粒的粒徑呈先增大再減小的趨勢(shì)。當(dāng)加熱5～10 min 時(shí)，SG 粒徑從130.31 nm 顯著增加至161.60 nm（P〈0.05），熱處理促進(jìn)SG 顆粒聚集。當(dāng)加熱10～20 min 時(shí)，SG粒徑顯著降低（P〈0.05），這可能是超聲處理使蛋白分子間轉(zhuǎn)為以疏水相互作用力主導(dǎo)，因此熱聚集體崩潰瓦解[17]。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)（0～20 min），SG 去折疊，暴露出的活性基團(tuán)依賴靜電相互作用靠攏，形成可溶性聚集體。帶電基團(tuán)在新聚集體表面重新排列，使Zeta-電位絕對(duì)值顯著增大[29]。當(dāng)加熱20～30 min 時(shí)，SG 分子結(jié)構(gòu)更加膨脹，蛋白單位表面積所覆蓋的靜電荷數(shù)量減少，因此SG 的Zeta-電位絕對(duì)值顯著降低（P〈0.05）。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)SG 納米顆粒粒徑和Zeta-電位的影響Fig.4 Effect of heating time on the particle size and Zeta-potential of SG nanoparticles

2.2.2 表面疏水性 如圖5 所示，在0～20 min 內(nèi)隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，聯(lián)合改性SG 納米顆粒表面疏水性逐漸增強(qiáng)（P〈0.05），并在20 min 達(dá)到最大值。一方面加熱改變SG 分子構(gòu)象，使更多包裹在球蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，從而增加ANS-熒光探針的結(jié)合位點(diǎn)[30-31]，提高樣品表面疏水性；另一方面，加熱促進(jìn)蛋白亞基和肽鏈的裂解[32]，同樣有利于增強(qiáng)SG 表面疏水性。當(dāng)加熱延長(zhǎng)至30 min時(shí)，SG 表面疏水性顯著降低（P〈0.05），這是由于當(dāng)加熱強(qiáng)度達(dá)到一定水平時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)獲得最大程度的伸展；若此時(shí)進(jìn)一步加熱，更多熱能的輸入會(huì)加劇蛋白分子的運(yùn)動(dòng)和碰撞，導(dǎo)致原本裂解的多肽鏈再次形成聚集體[33]，而暴露的疏水基團(tuán)也被重新包埋到分子內(nèi)部，從而使表面疏水性降低。

圖5 加熱時(shí)間對(duì)SG 納米顆粒表面疏水性的影響Fig.5 Effect of heating time on the surface hydrophobicity of SG nanoparticles

2.2.3 外觀變化 如圖6 所示，第6 天時(shí)加熱5 min 和10 min 的樣品最先沉淀，第9 天時(shí)加熱15 min 的樣品沉淀；第11 天時(shí)加熱30 min 的樣品沉淀；加熱20 min 的樣品穩(wěn)定時(shí)間可達(dá)12 d。綜合2.2.2 節(jié)的結(jié)果可得，95 ℃加熱20 min 為最優(yōu)加熱時(shí)間。

圖6 加熱時(shí)間對(duì)SG 納米顆粒外觀變化的影響Fig.6 Effect of heating time on the appearance changes of SG nanoparticles

2.3 超聲振幅對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒的影響

2.3.1 粒徑和Zeta-電位 采用美國Sonics 公司的VCX750 型超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)SG 進(jìn)行超聲處理，該儀器的超聲振幅與超聲功率存在一定的正相關(guān)性。如圖7 所示，隨著超聲振幅的增加，聯(lián)合改性SG 納米顆粒的粒徑呈先減小再增大的趨勢(shì)。較低振幅的超聲處理（0%～40%）使SG 納米顆粒的粒徑顯著降低（P〈0.05），這可能是由于超聲空化作用損壞了蛋白質(zhì)分子間的非共價(jià)鍵作用，使蛋白球狀結(jié)構(gòu)伸展、聚集體破碎，蛋白在溶液中的分布更加均勻[34]；然而隨超聲振幅增強(qiáng)（40%～70%）SG 粒徑又顯著變大（P〈0.05），高功率的超聲處理導(dǎo)致了一系列微射流效應(yīng)，在改變蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，加速溶液中微小粒子的運(yùn)動(dòng)和碰撞，使SG 再次形成了大的聚合體[19]。如圖7 所示，SG的Zeta-電位絕對(duì)值呈先增大后減小的趨勢(shì)，在40%振幅時(shí)，電位的絕對(duì)值最大為20.93 mV，這是由于超聲使SG 內(nèi)部的帶電基團(tuán)暴露出來，增大蛋白分子表面的靜電斥力。當(dāng)超聲振幅進(jìn)一步增大（≥40%），蛋白質(zhì)因過度變性聚集，帶電基團(tuán)再度裹藏于分子內(nèi)部，Zeta-電位絕對(duì)值也因此減小。

圖7 超聲振幅對(duì)SG 納米顆粒粒徑和Zeta-電位的影響Fig.7 Effect of ultrasonic amplitude on the particle size and Zeta-potential of SG nanoparticles

2.3.2 表面疏水性 表面疏水性關(guān)乎蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)蛋白功能性質(zhì)有著重要影響。如圖8 所示，聯(lián)合改性SG 納米顆粒表面疏水性隨超聲振幅的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)（P〈0.05），這與Zeta-電位絕對(duì)值和粒徑的測(cè)定結(jié)果相一致。這是因?yàn)槲唇?jīng)改性的SG 將疏水基團(tuán)等非極性基團(tuán)包裹于蛋白分子結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，超聲處理使蛋白結(jié)構(gòu)展開，促進(jìn)疏水基團(tuán)的外露[35]；而高強(qiáng)度的超聲處理會(huì)導(dǎo)致部分蛋白分子聚集，從而降低樣品表面疏水性。這與Yan 等[36]的報(bào)道超聲功率對(duì)表面疏水性的影響一致。

圖8 超聲振幅對(duì)SG 納米顆粒表面疏水性的影響Fig.8 Effect of ultrasonic amplitude on the surface hydrophobicity of SG nanoparticles

2.3.3 外觀變化 如圖9 所示，SG 納米顆粒經(jīng)歷了高強(qiáng)度超聲處理后（60%～70%振幅）在貯藏第8天時(shí)最先開始分層；未超聲處理及50%超聲振幅處理樣品在第9 天時(shí)分層；30%超聲振幅處理樣品在第12 天時(shí)分層；而40%超聲振幅處理樣品在第12 天時(shí)仍然穩(wěn)定。綜合2.3 節(jié)的結(jié)果可得，40%超聲振幅處理為最優(yōu)的超聲振幅。

圖9 超聲振幅對(duì)SG 納米顆粒外觀變化的影響Fig.9 Effect of ultrasonic amplitude on the appearance changes of SG nanoparticles

2.4 超聲時(shí)間對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒的影響

2.4.1 粒徑和Zeta-電位 由圖10 可知，超聲時(shí)間對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒的影響與圖7 中超聲振幅對(duì)樣品影響近似。0～6 min 超聲處理使蛋白球狀結(jié)構(gòu)展開，帶電基團(tuán)外露，從而使SG 的粒徑顯著減?。≒〈0.05），而Zeta-電位的絕對(duì)值增加。隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)（6～12 min），SG 再次聚集形成可溶聚合體，SG 的粒徑顯著增大（P〈0.05），而Zeta-電位的絕對(duì)值減小。Hu 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理仍會(huì)形成大尺寸的顆粒，可能是蛋白分子間通過疏水相互作用聚集有關(guān)。這與Zhou等[38]的研究結(jié)果一致。

圖10 超聲時(shí)間對(duì)SG 納米顆粒粒徑和Zeta-電位的影響Fig.10 Effect of ultrasonic time on the particle size and Zeta-potential of SG nanoparticles

2.4.2 表面疏水性 由圖11 所示，0～12 min 的超聲處理沒有對(duì)SG 表面疏水性造成顯著影響可能是短時(shí)的原因。超聲處理6 min 時(shí)SG 納米顆粒表面疏水性最大。

圖11 超聲時(shí)間對(duì)SG 納米顆粒表面疏水性的影響Fig.11 Effect of ultrasonic time on the surface hydrophobicity of SG nanoparticles

2.4.3 外觀變化 從圖12 可知，未經(jīng)超聲處理樣品和超聲處理9 min 樣品在貯藏第8 天時(shí)最先沉淀；超聲處理12 min 樣品第9 天沉淀；超聲處理1 min 樣品第10 天沉淀；超聲處理3 min 樣品第12天沉淀；而超聲處理6 min 樣品第12 天時(shí)仍然未出現(xiàn)分層。綜合2.4 節(jié)的結(jié)果可知，超聲處理6 min 為最優(yōu)的超聲時(shí)間。

圖12 超聲時(shí)間對(duì)SG 納米顆粒外觀變化的影響Fig.12 Effect of ultrasonic time on the appearance changes of SG nanoparticles

2.5 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.5.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 在最優(yōu)改性順序（HUP）下，通過響應(yīng)面試驗(yàn)，探究加熱時(shí)間（A），超聲振幅（B），超聲時(shí)間（C）對(duì)表面疏水性的影響，優(yōu)化SG納米顆粒聯(lián)合改性的條件。響應(yīng)面因素及水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及表面疏水性的響應(yīng)值Table 2 Design of response surface experiments and response values of surface hydrophobicity

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=3458.95-168.61A+143.37B-108.12C-14.06AB-65.12AC+75.77BC-269.36A2-230.90B2-143.58C2。表面疏水性回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 表面疏水性回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of surface hydrophobicity regression model

由表3 可知，該模型極為顯著（P〈0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P〉0.05）。該模型的變異系數(shù)（C.V.%）為0.91%（小于10%）；信噪比為36.073（大于4）；R2為0.9952，Adj-R2為0.989（均大于0.8 且接近于1）。綜上，該試驗(yàn)精確性較高，模型擬合情況較好，是理想的擬合模型，預(yù)測(cè)聯(lián)合改性SG 納米顆粒表面疏水性的實(shí)際變化情況真實(shí)可靠。一次項(xiàng)加熱時(shí)間（A）、超聲振幅（B）、超聲時(shí)間（C）和二次項(xiàng)A2、B2、C2均極顯著（P〈0.01），交互項(xiàng)中AC 和BC極顯著（P〈0.01）。由F 值可知，各因素對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒表面疏水性的影響大小為：加熱時(shí)間〉超聲振幅〉超聲時(shí)間。

2.5.2 響應(yīng)面分析 由圖13 可直觀地看到各因素對(duì)表面疏水性的影響。由響應(yīng)面趨勢(shì)可知，AC和BC 因素間交互作用對(duì)表面疏水性影響顯著；由等高線可知最佳表面疏水性對(duì)應(yīng)的三因素水平范圍，分析結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果一致。在此改性條件下，經(jīng)3 次以上試驗(yàn)測(cè)定表面疏水性平均值為3 548.77，相對(duì)誤差較小，說明模型準(zhǔn)確性高，是預(yù)測(cè)聯(lián)合改性SG 納米顆粒表面疏水性的可靠模型。由響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)選加熱-超聲-pH 偏移聯(lián)合改性條件為Step1：95 ℃加熱20 min 19 s。Step2：在43%振幅下超聲5 min 17 s（750 W，20 kHz）。Step3：pH 12 條件下處理1 h，聯(lián)合改性SG納米顆粒表面疏水性為3 516.16。

圖13 三因素間兩兩交互的響應(yīng)面及等高線圖Fig.13 The response surface and contour plot of the interaction among various factors

2.6 聯(lián)合改性SG 納米顆粒穩(wěn)定性的研究

2.6.1 離子強(qiáng)度對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒的影響

2.6.1.1 粒徑和Zeta-電位 如圖14 所示，隨著鹽濃度增加，SG 納米顆粒的粒徑顯著增大（P〈0.05）。這可能是因?yàn)槿芤褐械柠}離子屏蔽SG 納米顆粒表面電荷，減小顆粒間的靜電斥力；或是鹽離子與蛋白分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合水的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致蛋白間碰撞機(jī)率增大，形成蛋白聚集體。這與Fan 等[39]的研究結(jié)果一致。相較未加鹽離子的樣品，加鹽離子后SG納米顆粒Zeta-電位絕對(duì)值顯著降低（P〈0.05）；隨著鹽濃度增加（0.1～0.6 mol/L），Zeta-電位絕對(duì)值呈越來越小的趨勢(shì)。這可能是由于Na+引入增加了SG 納米顆粒表面的陽離子，使其表層的擴(kuò)散雙電層受到擠壓，使得Zeta-電位絕對(duì)值降低。

圖14 離子強(qiáng)度對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒粒徑和Zeta-電位的影響Fig.14 Effect of ionic strength on the particle size and Zeta-potential of co-modified SG nanoparticles

2.6.1.2 溶解度 如圖15 所示，鹽離子濃度增加顯著降低了SG 納米顆粒的溶解度（P〈0.05），這可能是因?yàn)樘烊籗G 是通過疏水相互作用維持的低聚球蛋白，鹽離子濃度增加使得單個(gè)蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水相互作用增強(qiáng)而聚集，產(chǎn)生“鹽析效應(yīng)”，因此溶解度降低[40]。

2.6.1.3 外觀變化 如圖16 所示，未添加鹽離子的SG 納米顆粒溶液在貯藏第12 天時(shí)仍穩(wěn)定；SG溶液在添加0.1 mol/L 鹽離子后，于第7 天開始沉淀；添加0.2～0.4 mol/L 鹽離子后，于第8 天沉淀；添加0.5 mol/L 鹽離子后，于第12 天沉淀；添加0.6 mol/L 鹽離子的SG 溶液與未添加鹽離子時(shí)，穩(wěn)定程度相當(dāng)。由此可知，添加適量的鹽離子（≤0.6 mol/L）使聯(lián)合改性SG 納米顆粒維持穩(wěn)定至少6 d，滿足肉制品、烘焙食品等基本生產(chǎn)需求。

圖16 離子強(qiáng)度對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒外觀變化的影響Fig.16 Effect of ionic strength on the appearance changes of co-modified SG nanoparticles

2.6.2 加熱對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒的影響

2.6.2.1 粒徑和Zeta-電位 為了拓寬聯(lián)合改性SG 納米顆粒的應(yīng)用領(lǐng)域，分別模擬蒸煮（100～110℃）、油炸（120～150 ℃）溫度進(jìn)行20 min 加熱處理，探究其能否適應(yīng)生產(chǎn)加工中的高溫條件。圖17 可知，聯(lián)合改性SG 納米顆粒粒徑隨加熱溫度的升高而增大（P〈0.05），這表明加熱溫度越高使溶液中越多蛋白聚集體形成。而高溫加熱后SG 納米顆粒的Zeta-電位絕對(duì)值小于低溫加熱后（100℃）的樣品，這也是蛋白相互聚集，外露活性基團(tuán)減少的表現(xiàn)。

圖17 加熱對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒粒徑和Zeta-電位的影響Fig.17 Effect of heating on the particle size and Zeta-potential of co-modified SG nanoparticles

2.6.2.2 溶解度 加熱使蛋白質(zhì)形成可溶性、不可溶的聚合體，影響蛋白溶解度。如圖18 所示，改性后SG 納米顆粒溶解度隨加熱溫度升高而增大（100～130 ℃），這或許是因?yàn)榇藭r(shí)蛋白分子間的交聯(lián)和折疊成為主導(dǎo)，疏水性基團(tuán)包埋于結(jié)構(gòu)內(nèi)部，形成一些可溶性聚集體，從而提高樣品溶解度。而隨加熱強(qiáng)度提高（130～150 ℃）改性SG 納米顆粒溶解度降低，可能是由于此時(shí)蛋白分子運(yùn)動(dòng)劇烈，形成某些不溶性聚集體。

圖18 加熱對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒溶解度的影響Fig.18 Effect of heating on the solubility of co-modified SG nanoparticles

2.6.2.3 外觀變化 圖19 可知，改性SG 納米顆粒溶液經(jīng)歷100 ℃二次加熱后，于貯藏第4 天輕微分層；經(jīng)110～120 ℃后于第5 天沉淀；經(jīng)歷130～150 ℃后于第6 天沉淀。綜上，即使經(jīng)歷蒸煮或油炸處理聯(lián)合改性SG 納米顆粒仍能維持3～5 d 穩(wěn)定，基本滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。

2.6.3 pH 值對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒的影響

2.6.3.1 粒徑和Zeta-電位 如圖20 所示，聯(lián)合改性SG 納米顆粒在強(qiáng)酸性環(huán)境（pH 2，4）中帶正電荷，弱酸及強(qiáng)堿性環(huán)境（pH 6，8，10）中帶負(fù)電荷。當(dāng)pH 值分別為4 和6 時(shí)，改性SG 納米顆粒的粒徑顯著大于其它pH 條件下的樣品，Zeta-電位絕對(duì)值顯著低于其它pH 條件下的樣品（P〈0.05）。這可能是由于聯(lián)合改性使得球狀SG 的天然結(jié)構(gòu)瓦解、暴露出內(nèi)部的酸性亞基，pH 4 較接近SG 酸性亞基等電點(diǎn)pH 4.8～5.4，而pH 6 接近于大豆球蛋白等電點(diǎn)pH 6.4，蛋白表面靜電荷減少，液滴間靜電斥力不足導(dǎo)致。

2.6.3.2 溶解度 圖21 可知，pH 值（pH 4，6）接近大豆球蛋白等電點(diǎn)時(shí)，聯(lián)合改性SG 納米顆粒在水中溶解度顯著降低（P〈0.05），在20%以下。pH值遠(yuǎn)離大豆球蛋白等電點(diǎn)時(shí)（如pH 2，8，10）聯(lián)合改性SG 溶解度均在70%以上。pH 值為10 時(shí)，聯(lián)合改性SG 納米顆粒溶解度最高為91.05%，說明聯(lián)合改性SG 在強(qiáng)酸/堿的環(huán)境中能保持良好溶解度。

2.6.3.3 外觀變化 由圖22 可知，當(dāng)pH 值為4和6 時(shí)較接近大豆球蛋白等電點(diǎn)時(shí)，由于液滴間靜電斥力的減少，在貯藏第1 天時(shí)產(chǎn)生肉眼可見的聚集沉降；當(dāng)pH 值為8 在貯藏第4 天時(shí)沉降；當(dāng)pH 值為10 在第6 天沉降；當(dāng)pH 值為2 在第20 天沉降。由此可見，聯(lián)合改性SG 納米顆粒在極端酸性或堿性的條件下都能保持良好的穩(wěn)定性（≥3 d）。

圖22 pH 對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒外觀變化的影響Fig.22 Effect of pH on the appearance changes of co-modified SG nanoparticles

2.6.4 凍融循環(huán)對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒的影響

2.6.4.1 粒徑和Zeta-電位 聯(lián)合改性SG 納米顆粒的粒徑在凍融后顯著增大（P〈0.05），且隨凍融次數(shù)的增多粒徑越大（圖23a），可見冷凍對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)造成不可逆的傷害。相較-20 ℃凍融處理，-80℃凍融處理后的顆粒粒徑更小，Zeta-電位絕對(duì)值更大。這是由于-80 ℃條件下水滴轉(zhuǎn)化成冰晶的速率更快，且大體積冰晶生成更少，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的傷害更小。凍融循環(huán)后樣品的Zeta-電位絕對(duì)值整體呈逐漸上升的趨勢(shì)（圖23b），這或許是因?yàn)閮鋈陔m然導(dǎo)致部分蛋白的聚集，但在上清中的蛋白顆粒卻暴露出更多的帶電基團(tuán)。

圖23 凍融循環(huán)對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒粒徑和Zeta-電位的影響Fig.23 Effect of freeze-thaw cycles on the particle size and Zeta-potential of co-modified SG nanoparticles

2.6.4.2 溶解度 如圖24 所示，聯(lián)合改性SG 納米顆粒的溶解度隨凍融次數(shù)的增加而顯著降低（P〈0.05）。在相同次數(shù)的凍融循環(huán)后，經(jīng)-80 ℃凍融處理樣品溶解度顯著高于-20 ℃凍融處理的樣品（P〈0.05）。這表明相較-20 ℃冷凍環(huán)境，-80 ℃速凍環(huán)境對(duì)SG 納米顆粒造成的傷害更小。

圖24 凍融循環(huán)對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒溶解度的影響Fig.24 Effect of optimal freeze-thaw cycles on the solubility of co-modified SG nanoparticles

2.6.4.3 外觀變化 如圖25 所示，在-20 ℃冷凍下，聯(lián)合改性SG 溶液經(jīng)歷1 次凍融循環(huán)出現(xiàn)少量沉淀，且隨凍融循環(huán)次數(shù)增多，沉淀逐漸增多；而在-80 ℃速凍下，聯(lián)合改性SG 溶液經(jīng)過2 次凍融循環(huán)，只產(chǎn)生極少量沉淀。結(jié)合粒徑、Zeta-電位、溶解度和貯藏時(shí)間綜合分析可知，-80 ℃更利于改性SG 納米顆粒的貯藏。

圖25 凍融循環(huán)對(duì)聯(lián)合改性SG 納米顆粒外觀變化的影響Fig.25 Effect of freeze-thaw cycles on the appearance changes of co-modified SG nanoparticles

3 結(jié)論

以大豆球蛋白（SG）為研究對(duì)象，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了加熱、超聲、pH 偏移聯(lián)合改性的最佳條件：95 ℃加熱20 min 19 s；43%振幅超聲處理5 min 17 s；pH 12 處理1 h。聯(lián)合改性有利于減小SG 納米顆粒的粒徑，改善表面疏水性和Zeta-電位，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。而且，聯(lián)合改性SG納米顆粒對(duì)高濃度鹽離子、高溫、極酸極堿環(huán)境以及快速冷凍-融化循環(huán)具有較好的穩(wěn)定性。本研究所研制的聯(lián)合改性SG 納米顆粒有望成為食品級(jí)Pickering 乳液的良好穩(wěn)定劑，為Pickering 乳液在功能性食品中應(yīng)用提供技術(shù)支持。