趙 芳，黃 璐，宦海琳，黃淑婷，張文君，梁晴晴，楊 瑤,

（1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210023；2.浙江商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院旅游烹飪學(xué)院，浙江杭州 310053；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇南京 210014；4.徐州湘然農(nóng)牧發(fā)展有限公司，江蘇徐州 221622）

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌的重要代謝產(chǎn)物，一般包括釋放到培養(yǎng)基中的粘液多糖（slime polysaccharide，SPS）和附著在細(xì)胞壁的莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）兩類[1]。在食品工業(yè)中，乳酸菌EPS 是一類安全的功能性添加劑，應(yīng)用范圍廣泛，通常用作穩(wěn)定劑[2-3]、增稠劑[4-5]和乳化劑[6-7]，能賦予產(chǎn)品良好的質(zhì)地、風(fēng)味和口感。植物乳植桿菌作為一類食源性微生物，因其安全性高，在工業(yè)、食品和醫(yī)藥等重要領(lǐng)域占有一席之地，在眾多乳酸菌EPS 研究中，植物乳植桿菌來源的EPS 產(chǎn)量高，研究報道較多，其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的EPS 被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)[8]、制藥[9]及化工生產(chǎn)等領(lǐng)域[10]。

細(xì)菌EPS 合成相關(guān)基因及其功能最先在肺炎鏈球菌等致病菌中得到了詳細(xì)的闡述[11]。近年來，隨著許多乳酸菌菌株的全基因組序列已經(jīng)公布[12-15]，EPS合成相關(guān)基因的研究也在不斷推進(jìn)。乳酸菌EPS 合成基因簇的大小通常為15～20 kb，所含基因數(shù)不超過30 個，這些基因往往方向相同并以單個mRNA的形式轉(zhuǎn)錄。植物乳植桿菌來源的EPS 合成基因簇研究報道也較多，目前結(jié)果顯示植物乳植桿菌的EPS合成基因簇類型為莢膜多糖基因簇（cpscluster），不同菌株基因組通常含有1～4 個cps基因簇[16]。一個典型的cps基因簇結(jié)構(gòu)上可以分為四個功能區(qū)域，即鏈長調(diào)節(jié)、組裝、合成和輸出區(qū)域，多個基因共同完成EPS 重復(fù)單元的合成、聚合和輸出。植物乳植桿菌WCFS1（以下簡稱WCFS1）是第一個進(jìn)行全基因組測序的乳酸菌，也是目前報道含cps基因簇最多的植物乳植桿菌，其基因組包含四個不同的cps基因簇（cps1A-I，cps2A-J，cps3A-J和cps4A-J），每個基因簇片段大小約10 kb，包含10 個左右負(fù)責(zé)編碼調(diào)控因子或酶的基因。此外，還有一些植物乳植桿菌的cps被較多報道[17]，如ST-III，JDM1，ZJ316 等，各菌株含1～3 個不等的cps基因簇。目前研究顯示植物乳植桿菌的cps基因簇的多樣性與其菌株特異性存在一定相關(guān)性[18]，因此針對不同菌株的cps需要開展更多的功能詢證實(shí)驗(yàn)，為更多潛在益生菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)室前期開展高產(chǎn)EPS 乳酸菌篩選，篩選獲得一株植物乳植桿菌YZH81（簡稱YZH81），其EPS 產(chǎn)量為380.00±47.16 mg/L，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的EPS 產(chǎn)量較高的乳酸菌水平相當(dāng)[19-20]。對YZH81進(jìn)行全基因組測序，分析其cps基因簇結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其基因組上有一個cps基因簇（cps2）與報道菌株同源性較高[21]。另外，還存在一個區(qū)域含多個與EPS 合成相關(guān)基因串聯(lián)一起，推測是YZH81 菌株的另一個cps基因簇（cps1）。進(jìn)一步比對結(jié)果顯示，cps1基因簇中的很多基因也在一些植物乳植桿菌菌株中存在，推測cps1基因簇是植物乳植桿菌中普遍存在的一個cps基因簇，其結(jié)構(gòu)和功能亟待鑒定。因此，本文首先利用同源重組的手段對YZH81 菌株cps1基因簇進(jìn)行敲除，從菌株生長特性、自凝集能力、粘附特性和DPPH 自由基清除能力等不同方面開展研究，旨在揭示cps1基因簇的功能，為進(jìn)一步研究YZH81菌株高產(chǎn)EPS 的特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。本研究中使用的所有植物乳植桿菌均在MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加的紅霉素和氯霉素終濃度均為10 μg/mL，培養(yǎng)溫度為37 ℃。大腸桿菌的培養(yǎng)用LB 培養(yǎng)基，添加的紅霉素或氯霉素終濃度分別為250 和10 μg/mL；MRS培養(yǎng)基 中國青島海博有限公司；LB 培養(yǎng)基 英國Oxoid 有限公司；紅霉素、氯霉素、透析袋（14 kD）、溶菌酶、PBS（磷酸緩沖鹽溶液）、細(xì)菌DNA 提取試劑盒、瓊脂糖（Agarose H）、4S Red 核酸染料（4S Red Plus Nucleic Acid Stain）生工生物工程（上海）股份有限公司；ExTaq、DNA Marker、Bacteria Genomic DNA Extraction Kit 寶生物工程（大連）有限公司；三氯乙酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH·）上海麥克林生化試劑有限公司；無水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸 哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司；人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2 細(xì)胞 生興生物技術(shù)有限公司；

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

本實(shí)驗(yàn)所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

表2 引物序列Table 2 Sequence of primers

HE-90 型電泳儀、水平電泳槽 上海天能科技有限公司；SHP-150 型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZQTY-70T 振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；MCO-15AC 型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司；XD-202 型倒置生物顯微鏡 江南永新光學(xué)有限公司；HH-2 型電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州亞特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-ZF 型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；AG 4309 型高壓脈沖電擊轉(zhuǎn)化儀、Personal PCR 儀、CL-22M 型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；Nano-300 微量分光光度計(jì) 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取 使用細(xì)菌全基因組提取試劑盒提取YZH81 全基因組DNA，具體步驟參照使用說明書。取提取后的DNA 樣本進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因組提取質(zhì)量及完整性。

1.2.2 基因組的測序與分析 YZH81 菌株GenBank編號為JAODTM000000000?；蚪M的測序在生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行，采用Illumina 測序技術(shù)；基因組拼接使用SPAdes 拼接二代測序數(shù)據(jù)，采用GapFiller 對拼接得到的contig 補(bǔ)GAP；利用PrInSeS-G 進(jìn)行序列矯正，修正拼接過程中的剪輯錯誤及小片段的插入缺失。使用Blastn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）將YZH81 基因組的cps基因簇與WCFS1（AL935263.2）、LP90（CP_015857）、ST-Ⅲ（NC_014554）和JDM1（CP001617.1）進(jìn)行對比，由TB Tools（v1.108）進(jìn)行基因組共線性分析。

1.2.3cps基因簇缺失株的構(gòu)建 本研究中使用的引物列于表2。YZH81Δcps1的構(gòu)建基于同源重組原理進(jìn)行[21]，以YZH81 的全基因組DNA 為模板，利用YZH81-Up-F/R、YZH81-Down-F/R 和CAT-F/R引物通過PCR 擴(kuò)增cps1基因簇的上游和下游側(cè)翼區(qū)域，先后克隆至質(zhì)粒pNZ5319XhoI和BgIII酶切位點(diǎn)，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pNZ5319Δcps1。按照電擊轉(zhuǎn)化法，將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化YZH81 感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)產(chǎn)物37 ℃孵育2 h 后涂布于含10 μg/mL 氯霉素的MRS培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h，陽性克隆采用菌落PCR 驗(yàn)證長度約1.7 kb 同源臂序列，最終獲得缺失cps1基因簇的YZH81 突變株，命名為YZH81Δcps1。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證cps1敲除的結(jié)果，將YZH81和YZH81Δcps1序列上傳到Galaxy 平臺進(jìn)行基因組測序。根據(jù)條形碼分離來自Illumina 測序的原始Illumina 序列片段，并使用Bowtie 2 將YZH81Δcps1序列的每個讀數(shù)對應(yīng)的核苷酸片段映射到Y(jié)ZH81基因組。參考Zhang 等[25]的方法，整合基因組學(xué)查看器（IGV）使用核苷酸窗口大小對比對結(jié)果進(jìn)行排序和計(jì)數(shù)，然后對基因求和。讀取映射到基因的最后10%被丟棄，因?yàn)檫@些插入可能不會使基因功能失活。然后，通過以下公式計(jì)算歸一化讀取計(jì)數(shù)RPKM（每百萬輸入讀取每千堿基讀取數(shù)），將每個基因的讀取計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為映射到每個重復(fù)中基因組的讀取總數(shù)：RPKM=（映射到基因×讀取數(shù)106）/（樣本中映射的總輸入讀取數(shù)×基因長度，單位為kb）。

1.2.4 EPS 產(chǎn)量測定 參考李衛(wèi)娜等[26]的實(shí)驗(yàn)方法并做適量改動。將-80 ℃冰箱保藏的YZH81 和YZH81Δcps1菌種劃線相應(yīng)抗性的MRS 平板，單菌落挑取至液體MRS 培養(yǎng)基活化，活化后的種子液以1%接種量發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃靜置培養(yǎng)32 h，離心（10000×g，4 ℃，15 min）取上清液。向上清液中加入80%三氯乙酸至終濃度為4%（w/v），4 ℃下靜置8 h。通過離心（10000×g，4 ℃，15 min）除去沉淀的蛋白質(zhì)。隨后上清加入3 倍體積的冷乙醇在4 ℃下醇沉過夜，離心（10000×g，4 ℃，20 min）取沉淀。將沉淀用適當(dāng)體積去離子水溶解，在4 ℃下透析48 h，然后凍干，最終獲得粗EPS 樣品。采用苯酚-硫酸法測定粗EPS 的碳水化合物含量。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A490nm）作為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，y=0.014x-0.021，R2=0.99。

1.2.5 生長曲線及pH 測定 參考Yang 等[27]的實(shí)驗(yàn)方法并適當(dāng)改動。將-80 ℃冰箱保藏的YZH81和YZH81Δcps1菌種劃線相應(yīng)抗性的MRS 平板，單菌落挑取至液體MRS 培養(yǎng)基活化，活化后的種子液以1%接種量發(fā)酵培養(yǎng)，接種后即刻混勻，取1 mL于比色皿中測定OD600nm值，作為初始零時間點(diǎn)值，隨后每2 h 測定一次OD600nm值和MRS 液體培養(yǎng)基的pH，直至24 h 實(shí)驗(yàn)結(jié)束。以時間為橫坐標(biāo)，OD600nm數(shù)值和pH 為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.6 自凝集能力檢測 參考Gao 等[28]的實(shí)驗(yàn)方法并做適量改動。將-80 ℃冰箱保藏的YZH81 和YZH81Δcps1菌種劃線相應(yīng)抗性的MRS 平板，單菌落挑取至液體MRS 培養(yǎng)基活化，活化后的種子液以1%接種量發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，離心收集菌體（4500×g，15 min），使用PBS（pH7.2）洗滌2 次后于PBS 中重懸，調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL，將4 mL 等量的細(xì)胞菌懸液裝入5 mL 的離心管中，混勻后靜置于室溫。自凝集測定的時間為4 和16 h，每次取0.5 mL 離心管上部菌懸液，加入到1.5 mL的PBS 中，混勻，測定600 nm 下的吸光值。以 PBS作為空白對照，凝集率（%）的計(jì)算公式為：

注：A0是凝集前的上清溶液在600 nm 下測定的OD600nm值；AT是凝集后的上清溶液在600 nm下測定的OD600nm值。

1.2.7 Caco-2 細(xì)胞粘附性測定 Caco-2 細(xì)胞水浴解凍，8000×g 離心5 min 收集細(xì)胞，加入5 mL 完全培養(yǎng)液，吸出上清，保留細(xì)胞沉淀。加入1 mL 完全培養(yǎng)液輕輕吹吸，混勻并移至培養(yǎng)皿中。放置于37 ℃培養(yǎng)，每隔2 d 更換培養(yǎng)液，顯微鏡鏡檢，待細(xì)胞培養(yǎng)皿上Caco-2 的覆蓋率達(dá)到80%后，可進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)參照Yang 等[27]的方法。將YZH81 和YZH81Δcps1的菌懸液（已稀釋調(diào)整至菌濃度為1×108CFU/mL），于12000×g 離心1 min，棄上清，菌體經(jīng)無菌PBS 緩沖液（pH7.2）清洗3 次，然后重懸于不完全DMEM 培養(yǎng)液。待細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞長至單層時，用無菌PBS 緩沖液（pH7.2）清洗后，添加1 mL 含有1×108CFU/mL 重組乳酸菌的DMEM 培養(yǎng)物，于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 h；PBS洗滌去除未粘附細(xì)菌，隨后加入0.5% Triton X-100處理5 min，使粘附細(xì)菌從細(xì)胞脫落，收集孔內(nèi)液體。用細(xì)胞粘附數(shù)表示粘附性，公式如下：

1.2.8 粘附蛋白的表達(dá)量 將活化后的YZH81 和YZH81Δcps1菌株分別轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm吸光度為0.8～1。根據(jù)試劑盒說明書提取YZH81 和YZH81Δcps1的總RNA，使用帶有g(shù)DNA 的PrimeScript? RT 試劑盒合成cDNA。以cDNA 為模板，檢測粘附蛋白的表達(dá)。然后，以rpoBmRNA 為參考基因[24]，采用2-ΔΔCT相對定量方法計(jì)算各組基因表達(dá)，用于RT-qPCR 的引物如表2 所示。

1.2.9 DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn) 取2 mL 的DPPH無水乙醇溶液（400 μmol/L），加入2 mL 待測菌液混勻，室溫避光靜置30 min，8000×g 離心10 min，測定上清液在517 nm 的吸光度值。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式為：

注：A0為等體積無水乙醇代替樣品的吸光度值；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度值；A2為等體積無水乙醇代替DPPH 乙醇溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 次重復(fù)的平均值，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。檢測水準(zhǔn)為0.05，運(yùn)用最小顯著差異（Least significant difference，LSD）法比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)作圖均采用Prism 8.0 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 YZH81 菌株cps 基因簇分析

YZH81 菌株經(jīng)全基因組測序，與cps基因簇研究最為深入的WCFS1 菌株進(jìn)行比對，結(jié)果顯示如圖1。YZH81 基因組上除基因N7E54_08460 與WCFS1 的cps1B基因有相似性（36.94%）以外，比對獲得一個基因簇（自N7E54_12115 至N7E54_12070），含10 個基因，其基因組成、功能、大小及排列與WCFS1 菌株cps4基因簇高度相似，單個基因序列同源性很高，為94.75%～99.62%，故推測該基因簇是YZH81 的一個完整的cps基因簇。

圖1 YZH81 菌株cps 基因簇的功能對比圖示Fig.1 Comparative illustration of cps gene clusters of L.plantarum YZH81

然而，與其他植物乳植桿菌比對的結(jié)果顯示YZH81 基因組上還存在一些連續(xù)排列的基因（共計(jì)14 個，含上述基因N7E54_08460），其功能注釋與植物乳植桿菌cps基因簇的功能基因相符，如編碼糖基轉(zhuǎn)移酶、多糖生物合成蛋白、翻轉(zhuǎn)酶等，檢索比對的基因功能注釋和與其他代表性植物乳植桿菌基因相似性分析結(jié)果列于表3。因此，推測其為YZH81 另一個cps基因簇。

表3 YZH81 菌株cps1 基因簇功能比對Table 3 Functional alignment of cps1 gene clusters of YZH81 strain

綜上所述，YZH81 菌株推測含有兩個cps基因簇，分別命名為cps1和cps2，其中cps1是尚未報道的植物乳植桿菌cps基因簇，遂開展對YZH81 菌株cps1的功能鑒定研究。

2.2 YZH81Δcps1 的構(gòu)建

根據(jù)方法1.2.3，構(gòu)建帶有YZH81Δcps1基因簇上下游側(cè)翼序列的敲除質(zhì)粒pNZ5319Δcps1，電擊轉(zhuǎn)化YZH81 感受態(tài)細(xì)胞，利用紅霉素和氯霉素雙抗性MRS 平板篩選，經(jīng)PCR 驗(yàn)證，獲得陽性菌株YZH81 Δcps1。

由于敲除的cps1基因簇片段較長，為了驗(yàn)證敲除cps1的完整性，對YZH81Δcps1的基因組進(jìn)行了測序，與野生型YZH81 進(jìn)行比對，使用IGV 進(jìn)行定位，如圖2 所示，顯示整個cps1簇在基因水平上被完全去除。

圖2 YZH81Δcps1 的cps1 基因簇完整敲除Fig.2 YZH81Δcps1 complete knockout of cps1 gene cluster

2.3 cps1 對YZH81 產(chǎn)EPS 的影響

根據(jù)方法1.2.4，對YZH81 和YZH81Δcps1的EPS 產(chǎn)量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3。結(jié)果顯示YZH81 Δcps1的EPS 產(chǎn)量為181.33±22.03 mg/L，相比野生型YZH81 的380.00±47.16 mg/L，EPS 產(chǎn)量顯著下降了52.28%（P＜0.05）。該結(jié)果表明cps1基因簇與菌株EPS 的產(chǎn)量非常相關(guān)。

圖3 YZH81Δcps1 的EPS 產(chǎn)量Fig.3 EPS production of YZH81Δcps1

2.4 cps1 對YZH81 生長的影響

YZH81 和YZH81Δcps1分別在相應(yīng)的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每2 h 測定OD600nm繪制生長曲線，結(jié)果如圖4 所示。從OD600nm數(shù)值來看，YZH81 Δcps1生長不如YZH81，培養(yǎng)24 h 的OD600nm吸光值差異顯著（P＜0.05）。然而，從培養(yǎng)基pH 數(shù)據(jù)來看，這兩種菌株沒有顯著差異（P＞0.05），隨后對兩個菌24 h 發(fā)酵液進(jìn)行菌落平板計(jì)數(shù)，結(jié)果為YZH81和YZH81Δcps1的菌落數(shù)分別為（9.57±0.40）×109和（9.53±0.25）×109CFU/mL，無明顯差異（P＞0.05），該結(jié)果與pH 結(jié)果一致。因此，本研究最終結(jié)果表明雖然吸光值OD600nm有顯著（P＜0.05）下降，但cps1缺失沒有影響菌株YZH81 的生長量。

圖4 YZH81Δcps1 的生長曲線及pH 測定Fig.4 Growth curve and pH determination of YZH81Δcps1

2.5 cps1 對菌株自凝集的影響

菌株的自凝集是指同一種菌間相互凝集形成多細(xì)胞簇的現(xiàn)象，與菌株表面結(jié)構(gòu)相關(guān)[28]。YZH81 和YZH81Δcps1的自凝集結(jié)果見圖5。在4 h 時，YZH81和YZH81Δcps1的自凝集率分別是26.30%±3.22%、38.90%±2.31%；在16 h 時，YZH81 和YZH81Δcps1的凝集速率分別是52.07%±2.03%、68.90%±3.14%。YZH81Δcps1在4 h 和16 h 的自凝集率均顯著高于YZH81（P＜0.05），分別是YZH81 的1.48 和1.32 倍。該結(jié)果說明cps1基因簇的缺失加速了菌株自凝集，分析其原因可能由于EPS 的減少改變了菌株表面分子的相互作用力。自凝集速率的增加可能是導(dǎo)致YZH81Δcps1菌株生長時OD600nm值降低的原因。

2.6 cps1 對菌株粘附性的影響

粘附性是乳酸菌發(fā)揮益生作用的前提，與菌體細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)相關(guān)[29]。為了研究cps1基因簇在YZH81 粘附腸上皮細(xì)胞的作用，選擇腸上皮細(xì)胞系（Caco-2 細(xì)胞）為研究對象，對YZH81Δcps1的粘附性進(jìn)行了測定。如圖6 所示，YZH81Δcps1的粘附性為8.52±0.20 CFU/cell，顯著低于YZH81 的粘附性21.50±1.80 CFU/cell，該結(jié)果與Gao 等[28]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即cpsWC可以促進(jìn)植物乳植桿菌在Caco-2 細(xì)胞上粘附。

此外，實(shí)驗(yàn)研究了YZH81 菌株可能的粘附蛋白基因表達(dá)情況。首先，根據(jù)YZH81 基因組序列與WCFS1 的比對結(jié)果，檢索獲得YZH81 菌株中有12 個與WCFS1 粘附蛋白[14]同源的粘附蛋白基因（表4）。結(jié)果顯示，除基因N7E54_11140 外，其余11 個粘附蛋白基因序列與WCFS1 菌株同源性較高，相似性高于75%。通過RT-qPCR 研究cps1的缺失對YZH81 粘附蛋白表達(dá)的影響，如圖7 所示，YZH81Δcps1菌株的12 個粘附蛋白基因中有10 個基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于野生型YZH81 表達(dá)水平（Fold change 比≥1.5），該結(jié)果表明cps1基因簇可能通過影響YZH81 中粘附蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致該菌株與Caco-2 細(xì)胞的粘附性顯著下降。

圖7 粘附蛋白的基因表達(dá)差異Fig.7 Expression of genes coding adhesion proteins

表4 粘附蛋白基因Table 4 Adhesion protein genes

2.7 YZH81Δcps1 對DPPH 自由基清除活性的影響

YZH81 和YZH81Δcps1清除DPPH 自由基能力如圖8 所示，兩株菌株均有一定的清除DPPH 自由基的能力。但是，YZH81 的DPPH 自由基清除率是46.82%±1.95%，顯著高于YZH81Δcps1，清除率為31.64%±1.97（P＜0.05）。乳酸菌的DPPH 自由基清除能力與其分泌到菌體表面和代謝產(chǎn)物中的EPS有關(guān)，這些多糖類物質(zhì)通過氫原子和電子轉(zhuǎn)移中和DPPH 自由基[30]。因此，推測YZH81 菌株cps1的缺失引起的EPS 產(chǎn)量的降低，影響了YZH81 對DPPH自由基清除的能力。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Zhang 等[31]對植物乳植桿菌C88 EPS 抗氧化活性分析的結(jié)果一致。

圖8 YZH81Δcps1 的DPPH 自由基清除率Fig.8 DPPH· scavenging rate of YZH81Δcps1

3 討論

乳酸菌廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品，很多菌株被報道可以產(chǎn)生EPS。目前，植物乳植桿菌來源的EPS 研究較為廣泛，而且，由于相對簡單的基因操作，如成熟的異源表達(dá)載體、成功的基因敲除方法[21]和簡單的電轉(zhuǎn)化方法，現(xiàn)階段對植物乳植桿菌的EPS合成基因簇（cps簇）研究報道較多[32-33]。本實(shí)驗(yàn)室前期從雞的直腸中分離獲得一株高產(chǎn)EPS 的乳酸菌，經(jīng)鑒定為植物乳植桿菌，命名為YZH81，其EPS產(chǎn)量為380 mg/L，本研究開展了該菌株cps基因簇的研究，為進(jìn)一步了解該菌株的EPS 生產(chǎn)特性奠定基礎(chǔ)。

植物乳植桿菌基因組通常含有1～4 個EPS 合成基因簇即cps基因簇。典型的cps基因簇通常包含EPS 合成基因（wzd，wze，wzh）、翻轉(zhuǎn)酶（wzx）和聚合酶（wzy）等相關(guān)功能基因，單向轉(zhuǎn)錄。WCFS1 菌株是植物乳植桿菌中cps簇研究最為透徹的菌株，也是被報道含有最多cps簇的菌株[18]。因此，本文首先將YZH81 菌株與WCFS1 進(jìn)行比對，結(jié)果顯示YZH81的基因組僅含1 個cps基因簇，與WCFS1cps4基因簇高度相似（單個基因相似度高達(dá)94.75%～99.62%）。但是，與其他植物乳植桿菌（LP90 和JDM1）比對結(jié)果顯示，YZH81 基因組上還有一個區(qū)域聚集一連串與EPS 合成相關(guān)基因，功能分別為wze、wzx、wzy和一些編碼糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白的基因，與典型的產(chǎn)EPS 的基因簇結(jié)構(gòu)一致。因此，推測YZH81 具有一個尚未鑒定的cps基因簇，根據(jù)基因組上的物理順序命名為cps1基因簇。

為了鑒定cps1基因簇的功能，本研究構(gòu)建了cps1敲除菌YZH81Δcps1，并隨即開展了該菌株EPS 產(chǎn)量、菌株生長量、菌株自凝集特性和菌株粘附性的體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與野生型YZH81 相比，YZH81Δcps1的EPS 產(chǎn)量下降，細(xì)胞自聚集加速，且粘附性降低。以上結(jié)果不僅說明了cps1基因簇參與了YZH81 菌株的EPS 合成，更為重要的是由于cps1的缺失造成了EPS 的減少，也顯著影響了菌株的表面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了自凝集的加劇和粘附性的降低。考慮到EPS 產(chǎn)量并不是影響菌株粘附性的唯一因素，本文進(jìn)一步研究了YZH81Δcps1粘附蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)檢索比對獲得的12 個YZH81 菌株粘附蛋白中，與野生型相比，cps1的缺失導(dǎo)致了10 個粘附蛋白基因表達(dá)量顯著下降，其余2 個無明顯變化。該結(jié)果說明了YZH81 菌株的cps1基因簇可能通過生產(chǎn)的EPS 產(chǎn)量和調(diào)節(jié)粘附蛋白表達(dá)兩個方面的作用來共同影響菌株的粘附性。在此基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)測定了cps1缺失后DPPH 自由基清除效果，結(jié)果顯示野生型菌株具有一定的抗氧化活性，但cps1基因簇敲除后DPPH 自由基清除率下降了32.42%。該結(jié)果顯示cps1基因簇的缺失造成EPS 的產(chǎn)量下降影響了菌株的抗氧化功能。

綜上所述，YZH81 菌株基因組上發(fā)現(xiàn)一個尚未鑒定的EPS 合成基因簇cps1，本研究結(jié)果顯示該基因簇可影響菌株EPS 的產(chǎn)量，造成菌株粘附性和抗氧化性的改變，為深入研究該菌株EPS 的生物學(xué)功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。乳酸菌EPS 的合成產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程，相關(guān)基因簇的調(diào)控可能涉及各種調(diào)控機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的cps1基因簇，其功能與EPS 的產(chǎn)生和菌株的功能相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步地研究單一cps簇的基因結(jié)構(gòu)與功能以及不同cps簇在EPS 合成中的互作關(guān)系，從而深入揭示其合成EPS 的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究針對一株高產(chǎn)EPS 的植物乳植桿菌YZH81 的EPS 合成基因簇（cpscluster）開展研究，對其中一個cps基因簇（cps1）的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行初步鑒定。利用同源重組方法，構(gòu)建pNZ5319Δcps1敲除質(zhì)粒并成功構(gòu)建了cps1敲除菌YZH81Δcps1。結(jié)果顯示，與野生型YZH81 菌株相比，YZH81Δcps1的EPS 產(chǎn)量顯著降低，自聚集能力加速，粘附性降低，且清除DPPH 自由基能力明顯下降。本研究證明了YZH81 菌株的cps1基因簇在EPS 合成中的重要作用，也為進(jìn)一步研究該菌株EPS 合成基因簇及其作用機(jī)制建立有利條件。