徐娜,陳桂玲,楊磊,朱子涵,陳麗,韓亞丁,劉飛

玻璃化法超低溫高效保存‘Gala’蘋果組培苗

徐娜,陳桂玲,楊磊,朱子涵,陳麗,韓亞丁,劉飛*

濟寧醫(yī)學院, 山東 日照 276800

本試驗以蘋果‘Gala’蘋果為材料，從低溫鍛煉時間、預培養(yǎng)基蔗糖濃度、預培養(yǎng)時間和玻璃化溶液及處理時間4個方面優(yōu)化玻璃化超低溫保存體系，獲得‘Gala’蘋果莖尖超低溫保存的最佳體系。結果表明，將生長30 d的組培苗在4 ℃的條件下低溫鍛煉5周，剝取莖尖，將其置于含0.4 mol/L蔗糖的預培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，滲透裝載液滲透30 min，0 ℃的條件下用PVS3玻璃化溶液處理60 min，放入液氮中冷凍24 h，取出后置于40 ℃水浴中1 min快速化凍，卸載液清洗2次，每次10 min，然后在恢復培養(yǎng)基上培養(yǎng)，莖尖的再生率最高達到96.6%且生長穩(wěn)定性好。本試驗成功建立了‘Gala’蘋果的玻璃化法超低溫保存體系，為蘋果種質資源的長期保存提供了一條有效途徑。

‘Gala’蘋果; 超低溫處理; 組培

蘋果富含糖類、蛋白質、有機酸、維生素和微量元素等多種有益于身體健康的物質，是深受大眾喜愛的一種水果。中國是野生蘋果主要起源地之一，也是世界上最大的蘋果生產國[1,2]。農業(yè)生產上，一個優(yōu)良的品種是決定蘋果產量與品質的關鍵因素。據(jù)統(tǒng)計，目前世界上的蘋果品種約有1000個，其中已有幾十個品種在生產中廣泛栽培，但沒有一個品種能夠完全滿足生產者和消費者的所有需求?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多具有優(yōu)良性狀的自然突變體，并將其引入到生產中，成功改善了蘋果的品質。蘋果的野生種、半野生種和栽培種等種質資源，是蘋果傳統(tǒng)育種和基因工程育種的基礎，也是培育優(yōu)良蘋果品種的保障[3]。因此，建立安全、有效的蘋果種質資源保存方法是非常必要的。

蘋果既可利用種子繁殖也可無性繁殖，因無性繁殖具有能夠保存母本優(yōu)良性狀且耗時較短的優(yōu)點，生產上蘋果以無性繁殖為主。田間保存和試管保存是用來保存無性繁殖植物種質的傳統(tǒng)方法[4]。中國、美國、德國、意大利等多個國家通過建立蘋果種質圃保存了多份蘋果材料[5-8]。田間保存的優(yōu)點是可原位保存且操作簡易，但田間保存需占用大面積的土地、耗費大量的勞力、受自然災害和病蟲害的影響大，容易造成珍貴種質材料的喪失。試管苗保存法可有效節(jié)省空間、避免了自然環(huán)境的威脅，但所需成本高，且需不斷繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)次數(shù)增多易引起材料污染和遺傳變異，致使保存材料丟失[9-11]。超低溫保存法是將植物的組織或器官保存在-196 ℃的液氮中，在此溫度下，被保存植物材料的生命活動幾乎完全停止，延長了保存時間，避免了反復繼代培養(yǎng)，有效地保持了植物組織的遺傳穩(wěn)定性，并且無需占用土地，節(jié)省了大量的空間和勞力[4,12,13]。超低溫保存法克服了傳統(tǒng)保存法存在的問題，被認為是長期保存無性繁殖植物材料的最有效、最理想的方法[3,14]。

1960年Sakai首次在Nature上報道了超低溫冷凍法保存桑樹材料[15]。隨后不斷對超低溫保存體系進行優(yōu)化，發(fā)展了兩步冷凍法和快速冷凍法[3,4,13,16]。迄今已報道了多種果樹如柑橘、杏、桃、柿子等的材料成功利用超低溫法獲得保存[17-20]。近年來，多個國家已建立并成功使用超低溫種質資源基因庫，如秘魯?shù)鸟R鈴薯超低溫基因庫[21]、比利時的香蕉種質資源超低溫庫[22]、韓國和德國的大蒜超低溫基因庫[23,24]、美國的甘薯種質資源超低溫庫[25]等。

1985年Kuo and Lineberge首次使用超低溫保存法成功保存了蘋果試管苗莖尖材料[26]，之后相繼報道了多種優(yōu)化的蘋果超低溫保存技術，如:兩步冷凍法[27]、玻璃化法[28,29]、小滴-玻璃化法[30]等。超低溫保存法通常包含培養(yǎng)、預處理、預培養(yǎng)、低溫鍛煉、液氮冷凍、解凍、再生等幾個步驟[31,32]。不同的超低溫保存技術體系會影響蘋果組織的再生和遺傳穩(wěn)定性，因此我們以‘Gala’蘋果組培苗為材料，在保證蘋果材料遺傳穩(wěn)定性的基礎上，通過不斷改進和優(yōu)化玻璃化法超低溫保存試驗條件，進一步提高蘋果種質冷凍保存的效率及穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘Gala’蘋果的離體莖尖為材料，組培苗在繼代培養(yǎng)基上生長30 d，每天16 h光照，光強為75 μmo1/(m2·s)，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2 試劑

繼代培養(yǎng)基（pH=5.8）：MS、6-BA（0.5 mg/L）、NAA（0.05 mg/L）、sucrose（0.5 mol/L）、agar（0.7%）；

預培養(yǎng)液（蔗糖濃度梯度）：MS、sucrose（0～1.2 mol/L）；

裝載液：MS、sucrose（0.4 mol/L）、甘油（2 mol/L）；

PVS2：MS、乙二醇（15%）、甘油（30%）、二甲基亞砜（15%）、sucrose（0.4 mol/L）；

PVS3：甘油（50%）、sucrose（50%）；

卸載液：MS、sucrose（1.2 mol/L）；

恢復培養(yǎng)基（pH=5.8）：MS、6-BA（0.5 mg/L）、sucrose（0.5 mol/L）、agar（0.7%）；

1.3 ‘Gala’蘋果莖尖玻璃化超低溫保存步驟

4 ℃條件下，低溫馴化繼代生長30 d的組培苗0～8周。取含頂芽的莖段，在顯微鏡下剝取莖尖（長度約1.5 mm，含1～2個葉原基），放入含蔗糖（0～1.2 mol/L）的預培養(yǎng)液中0～7 d，每組莖尖至少30個；預培養(yǎng)后的莖尖放入裝載液中30 min；除去裝載液，添加玻璃化溶液PVS2或PVS3，0 ℃放置0～90 min；去除玻璃化溶液，再加入新的玻璃化溶液至恰好浸沒莖尖，投入液氮中冷凍24 h。取出液氮中保存的材料，放入40 ℃水浴中快速化凍1 min；添加卸載液，放置10 min，重復1次；將莖尖轉至恢復培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1周后光照培養(yǎng)，光強75 μmo1/(m2·s)光周期12 h/d，溫度25 ℃。

光照培養(yǎng)2周后統(tǒng)計存活率，綠色或黃綠色、長出小葉或者脫分化形成愈傷組織的莖尖均視為存活，存活率(%) = 存活的莖尖個數(shù)/總莖尖數(shù)×100，重復3次，取平均值。

2 結果分析

2.1 低溫鍛煉時間對超低溫保存的影響

低溫處馴化組培苗能誘發(fā)植物的自然休眠，提高細胞內的溶質濃度，降低自由水含量，增強試管苗的抗寒能力，有助于提升試管苗冷凍后的再生能力[33,34]。為獲得‘Gala’蘋果試管苗的最佳低溫鍛煉時間，進行了低溫煉苗的時間進程試驗。結果顯示蘋果莖尖存活率隨低溫鍛煉時間的延長呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。沒有經過低溫處理的試管苗莖尖存活率只有46.2%，處理1周后的莖尖存活率顯著提高，達到62.7%；隨著低溫處理時間增長至5周，蘋果莖尖存活率都逐漸升高，且升高趨勢顯著；處理5周后，蘋果莖尖的存活率升高趨勢變緩，變化不明顯（圖1）。隨著低溫處理時間增長，培養(yǎng)瓶內養(yǎng)分、水分不斷減少，致使試管苗開始萎蔫、發(fā)黃甚至死亡，不利于后續(xù)莖尖的剝取，因此‘Gala’蘋果的低溫鍛煉的最佳時間為5周。

圖 1 不同低溫鍛煉時間對蘋果莖尖超低溫保存后存活率的影響

2.2 預培養(yǎng)液蔗糖濃度和時間對超低溫保存的影響

植物材料細胞中的自由水含量是超低溫保存成功的關鍵因素。自由水含量過高，細胞內易形成冰晶，造成細胞機械損傷；含量過低，細胞會因過度脫水而死亡[35]。按冰凍保護劑能否滲透到細胞內，可將其分為滲透性和非滲透性兩類，蔗糖屬于非滲透性冰凍保護劑，是目前預培養(yǎng)培養(yǎng)基中常添加的冰凍保護劑[36,37]。為研究‘Gala’蘋果莖尖預培養(yǎng)的最適蔗糖濃度，進行了蔗糖濃度梯度實驗。由圖2A可知，蘋果莖尖存活率隨蔗糖濃度的升高呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，預培養(yǎng)液中蔗糖濃度為0.3 mol/L時，存活率達到最高，說明預培養(yǎng)液中蔗糖濃度顯著影響蘋果莖尖玻璃化法超低溫保存的成活率。

植物組織的預培養(yǎng)時間對玻璃化超低溫保存的成功率有很大的影響。如圖2B所示，蘋果莖尖玻璃化法超低溫保存后的存活率隨預培養(yǎng)天數(shù)的延長表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在預培養(yǎng)5天時蘋果莖尖存活率達到最高，之后隨著時間延長，再生率開始下降。

圖 2 預培養(yǎng)基蔗糖濃度和預培養(yǎng)時間對蘋果莖尖超低溫保存后存活率的影響

A：不同蔗糖濃度預培養(yǎng)蘋果莖尖，超低溫保存后存活率的統(tǒng)計；B：蘋果莖尖預培養(yǎng)不同時間，超低溫保存后存活率的統(tǒng)計。

A: Effect of sucrose concentration of preculture on survival rate of cryopreserved ‘Gala’ shoot tips; B: Effect of preculture duration on survival rate of cryopreserved ‘Gala’ shoot tips.

2.3 玻璃化溶液及處理時間對超低溫保存的影響

玻璃化溶液對莖尖細胞有滲透保護的作用，降低細胞的自由水含量，減少冷凍時細胞內冰晶的形成，進而保護細胞的完整性，因此玻璃化法可提高超低溫保存的存活率[38]。目前常用的玻璃化溶液主要有PVS2[39]和PVS3[40]兩種。由于玻璃化溶液的濃度及處理時間影響植物細胞的狀態(tài)及再生效果，需不斷優(yōu)化試驗條件，尋找最佳的玻璃化溶液和處理時間。由圖3所知，與沒有經過玻璃化溶液處理的材料相比，玻璃化處理的莖尖材料的再生率顯著提高，就‘Gala’蘋果莖尖材料而言，玻璃化溶液PVS3的效果要明顯優(yōu)于PVS2，且處理60 min時，冷凍保存后的再生率高達96.6%，效果最好。

圖 3 玻璃化溶液及處理時間對蘋果莖尖超低溫保存后存活率的影響

2.4 ‘Gala’蘋果莖尖玻璃化超低溫冷凍保存后的生長狀態(tài)分析

為探究優(yōu)化的玻璃化超低溫保存技術是否影響再生后組培苗的生長狀態(tài)，將超低溫保存的蘋果莖尖與未經超低溫保存的莖尖在恢復培養(yǎng)基上進行生長并觀察其生長狀態(tài)（圖4）。通過統(tǒng)計對比發(fā)現(xiàn)，玻璃化超低溫冷凍保存的蘋果莖尖再生苗在葉片長寬比、葉片顏色、擴繁系數(shù)和生根能力等方面均與未經超低溫保存的莖尖再生苗無顯著差異（表1）。說明優(yōu)化的‘Gala’蘋果莖尖玻璃化超低溫冷凍保存法不影響植物材料的生長狀態(tài)，能保持其生長的穩(wěn)定性。

圖 4 蘋果莖尖再生苗

A：超低溫冷凍保存復活后的組培苗；B：未冷凍保存處理的蘋果莖尖組培苗。

A: Regrowth of cryopreserved ‘Gala’ shoot tips; B: Regrowth of apple stem tip without cryopreservation treatment.

表 1 超低溫冷凍保存后蘋果莖尖組培苗生長狀態(tài)觀察

3 討 論

超低溫保存技術的成功率與被保存植物材料的生理特性有密切關系，因此必須對材料進行預處理。預處理通常有反復繼代、低溫鍛煉和預培養(yǎng)3種方法，進而減少細胞內的自由水含量，增強被保存材料的抗凍能力，提高超低溫保存材料的再生力[41]。我們的研究發(fā)現(xiàn)低溫鍛煉和預培養(yǎng)都對‘Gala’莖尖的超低溫保存效果有顯著的影響?！瓽ala’莖尖的存活率隨低溫鍛煉時間的延長而提高，而吳傳金等[42]發(fā)現(xiàn)超低溫冷凍的新疆野蘋果的成活率隨低溫鍛煉時間的延長呈下降趨勢，說明低溫鍛煉的效果與蘋果的品種有關。由于不同蘋果樹種對超低溫保存的要求和條件差異較大，并且整個超低溫保存過程耗時較長，致使現(xiàn)今仍缺乏高效、廣譜的蘋果莖尖超低溫保存技術[43]，限制了蘋果種質資源超低溫保存庫的建立。今后，在保持蘋果莖尖存活率的基礎上，仍需簡化超低溫保存技術的操作，建立簡易、高效的保存體系。

多個莖尖超低溫保存的研究中發(fā)現(xiàn)，不同實驗室利用相同的技術體系保存同一基因型材料，統(tǒng)計的再生率表現(xiàn)出極大差異[44,45]。這可能是由受試材料的帶毒狀況不同導致的，病毒對試管苗的分化、生長及生理代謝等都有顯著的影響[46]。在研究莖尖超低溫保存技術時可以與脫毒技術相結合，建立新型的脫毒技術，保存蘋果無毒苗，為蘋果的無毒生產開辟新的途徑。

4 結 論

玻璃化超低溫保存法是目前果樹資源種質保存的常用方法。本研究從低溫鍛煉時間、預培養(yǎng)基蔗糖濃度、預培養(yǎng)時間和玻璃化溶液及處理時間四個方面對‘Gala’蘋果莖尖的玻璃化超低溫保存體系進行了優(yōu)化，獲其保存的最佳體系為：將生長30 d的組培苗在4 ℃的條件下低溫鍛煉5周，剝取莖尖，放置于含0.4 mol/L蔗糖的預培養(yǎng)基中，預培養(yǎng)5 d，在滲透裝載液中滲透30 min，0 ℃條件下，用PVS3玻璃化溶液處理60 min，放入液氮中冷凍24 h，取出后置于40 ℃水浴中1 min快速化凍，卸載液清洗兩次，每次10 min，然后在恢復培養(yǎng)基上培養(yǎng)，莖尖的再生率最高且生長穩(wěn)定性好。

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Cryopreservation of 'Gala' Apple in Vitro by Vitrification

XU Na, CHEN Gui-ling, YANG Lei, ZHU Zi-han, CHEN Li, HAN Ya-ding, LIU Fei*

276800,

We optimized the vitrified cryopreservation system from low-temperature trained time, sucrose concentration of pre-culture medium, pre-culture time, vitrification solution and treatment time for cryopreservation of 'Gala' apple stem tip. Tissue culture seedlings grown for 30 days were subjected to cold acclimation at 4℃ for 5 weeks; the shoot tips were stripped, cultured in the preculture solution containing 0.4 mol/L sucrose for 5 days; followed by permeating in loading solution for 30 min; vitrified by PVS3 for 60 min at 0 ℃;frozen in liquid nitrogen for 24 h; thawed in water bath at 40 ℃for 1 min; washed twice by dilution solution, 10 min each time; finally recovered in the medium, the shoot tips grew stably and the regeneration rate was up to 96.6%. The study has successfully established effective vitrification cryopreservation protocol of 'Gala' shoot tips, and provided an innovative way for long-term conservation of apple germplasm.

‘Gala’ apple; cryopreservation; tissue culture

S602.4

A

1000-2324(2023)05-0718-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.011

2023-06-21

2023-10-19

國家自然科學基金(32000194);山東省自然科學基金(ZR2017BC081);作物生物學國家重點實驗室開放項目(2017KF08);山東省高等學校青年創(chuàng)新團隊(2022KJ102);山東省教育科學規(guī)劃創(chuàng)新素養(yǎng)專項課題(2022CYB210);濟寧醫(yī)學院教師國內訪學項目

徐娜(1985-),女,博士研究生,研究方向:植物營養(yǎng)學及果樹種質資源保存. E-mail:xuna828@163.com

Author for correspondence. E-mail:liufei092531@163.com