金楠，陳欣，黃李瓊

(1. 莆田學院藥學與醫(yī)學技術學院藥學系，福建莆田 351100；2. 莆田學院藥物分析與檢驗醫(yī)學福建省高校重點實驗室，福建莆田 351100)

0 引言

燙傷是最具破壞性的皮膚創(chuàng)傷之一[1]，輕者留疤、重者致死[2]，甚至會影響心理健康[3]．作為常見的意外疾病，燙傷影響的全球患者每年可達1 500萬人[2]，死亡人數(shù)每年可達30萬人[4]．燙傷后人體皮膚防御功能被破壞，多種創(chuàng)面滲出物和壞死組織聚集在燙傷部位[2]，加上全身免疫力下降[3]等原因，使得創(chuàng)面易感染細菌[5]，而創(chuàng)面感染又加大死亡概率．此外，燙傷不僅造成局部皮膚組織壞死，還能引發(fā)肝臟等遠端器官衰竭[4]．肝臟作為上游器官，一旦受損又會通過代謝和免疫功能紊亂導致下游器官損傷[4]．因此，優(yōu)異的燙傷治療手段應該能夠吸收創(chuàng)面滲液、加快創(chuàng)面愈合、抑制細菌感染和減小肝臟損傷[6]．

臨床已有治療燙傷的藥物，比如抗菌藥物、銀鹽等[7]，短期使用有抗感染作用，但長期會造成耐藥和嗜中性粒細胞減少，不利于創(chuàng)面恢復[2]，無法兼顧抗菌和優(yōu)異的組織修復功能，不適合深Ⅱ度以上的燙傷．因為這類燙傷損傷到了真皮全層，壞死的焦痂會阻礙組織再生，導致創(chuàng)面再上皮化緩慢，需要借助敷料、皮膚移植[6]、間充質干細胞療法[6]進行治療．但無論是皮膚移植還是間充質干細胞療法均對醫(yī)生技術和患者經(jīng)濟條件要求較高[2]．故而急需開發(fā)使用簡單、價格能惠及廣大患者的燙傷創(chuàng)面敷料．

姜黃是治療燒燙傷的重要中藥[7]，其主要成分姜黃素（Curcumin, Cur）已證實對燙傷創(chuàng)面有一定修復作用，能提高創(chuàng)面組織中IL-1β的表達[8]．雖然其單獨使用具有一定抗菌活性，但需要在較高濃度下才能發(fā)揮作用[9]．而其作為單線態(tài)氧產率更高的二代光敏劑，結合藍光照射在抗菌應用上潛力更大[9]．由甘草組成的經(jīng)典名方玉紅膏，其治療燙傷的主要有效成分為甘草酸（Glycyrrhizic Acid, GA）[10]．且甘草酸對于燙傷所致的肝損害亦有保護作用．

課題組前期制備出專利制劑――共載姜黃素和甘草酸的微米介孔硅（μm-sized mesoporous silica,μmS）Cur+GA@μmS[11]．微米介孔硅是指具有介孔（2～50 nm）孔徑的商用膠體二氧化硅（silica），是一種粒徑為微米的、具有巨大比表面積和三維孔道結構的常見藥用輔料[12]，毒性低、價格低廉[13]，常作為片劑中的流動劑．微米介孔硅的商品有很多，當選用其中的Aeroperl?300 Pharm作為載體承載姜黃素和甘草酸得到Cur+GA@μmS，前期實驗發(fā)現(xiàn)其具有如下理化性質[14]：經(jīng)掃描電鏡觀察，其結構仍保持載藥前的球型，粒徑約為50 μm；在室溫下放置12個月后，經(jīng)X射線衍射檢測發(fā)現(xiàn)其仍能保持無定型態(tài)；同超純水混合后，經(jīng)流變儀檢測，其流變性質符合假塑性，黏度介于甘油和蜂蜜之間，適合涂抹到皮膚上．

本研究擬將上述Cur+GA@μmS應用在小鼠深Ⅱ度燙傷感染模型創(chuàng)面處，聯(lián)合藍光照射，通過體重、創(chuàng)面愈合率、組織學評價、創(chuàng)面處的血管內皮生長因子VEGF和肝臟中的炎癥因子白介素IL-1β來評估Cur+GA@μmS作為燙傷敷料的愈合效果．通過細菌瓊脂平板實驗來揭示Cur+GA@μmS對燙傷的愈合能力與對抑菌性能之間的關系．通過檢測加入活性氧檢測劑的Cur+GA@μmS經(jīng)藍光照射后，在410 nm處的吸光度變化來探究抑菌的原因．該項目的完成將為一種新型燙傷修復敷料的臨床應用提供前期數(shù)據(jù)，為廣大燙傷患者提供另一種性價比高的選擇．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑

微米介孔硅Aeroperl?300 Pharm，德國Evonik Industries AG；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.4，0.01 mol/L，批號：20220930），廈門江標檢測科技有限公司；姜黃素（純度≥98%，批號：D9053003），上海歷鼎生物技術有限公司；甘草酸（純度≥95%，批號：P1850507），上海泰坦科技股份有限公司；無水乙醇（AR，批號：G2222283），阿拉丁試劑有限公司；1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF，批號：J2209318），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4%多聚甲醛，武漢卡諾斯科技有限公司；小鼠白介素1β酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：202211），上海臻科生物科技有限公司；小鼠血管內皮生長因子（VEGF）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：202211），上海臻科生物科技有限公司；無菌生理鹽水（批號：F23IR207894），上海源葉生物科技有限公司．

1.1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，體重（18±2）g，6～8 w．購自中國上海斯萊克實驗動物有限責任公司．動物實驗均經(jīng)莆田學院實驗動物倫理委員會批準：倫審（2022）-013．

1.1.3 主要儀器設備

HTLD-4II-FF3020-NH型藍光持續(xù)點光源，深圳市海特奈德光電科技有限公司；U-3010型紫外分光光度計（UV），日本Hitachi公司；CF15RN型臺式高速冷凍離心機，日本Hitachi公司；HZQ-C型數(shù)顯恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造公司；AR124CN型電子天平，常州奧豪斯儀器有限公司；DZG-6050型真空干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；OMNI型超純水機，廈門銳思捷水純化技術有限公司；KZ-III-F型低溫組織研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；INFINITE F50型酶標儀，瑞士TECAN公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 制劑的制備及吸水性測試

42.58 mg姜黃素和341 mg甘草酸溶于3.41 mL二甲基亞砜（DMSO）中（Cur/DMSO=1︰88，w/w；Cur/GA=1︰8，w/w）得到藥液，用注射器滴加藥液于微米介孔硅Aeroperl?300 Pharm后即加即攪拌，確保載藥均勻．于60 ℃真空干燥12 h，得制劑Cur+GA@μmS，載藥量經(jīng)紫外分光光度計檢測計算為1.68%±0.12%[15]．分別將20 mg的載藥制劑或空白載體與100 μL超純水混合后，觀察樣品中水分隨著時間的吸收情況．

1.2.2 燙傷模型的建立及給藥

60只小鼠隨機平均分為空白組、空白藍光組、燙傷模型組、模型藍光組、Cur+GA@μmS組、Cur+GA@μmS藍光組、Cur原料藥組、Cur原料藥藍光組、未載藥μmS組、未載藥μmS藍光組．小鼠腹腔注射5%水合氯醛（0.01 mL/g）進行麻醉，背部中央2 cm×2 cm脫毛，生理鹽水清洗后采用無菌紗布擦拭．用酒精燈燒熱40 s的半徑1 cm圓形鐵片，在其背部燙出近圓形燙傷區(qū)，接觸時間為10 s．背部給予相應的制劑，每天1次，連續(xù)11天，姜黃素用量為10 mg/kg．涉及到藍光的組別，波長450 nm、光照功率為511 mW·cm-2的藍光在給藥30 min后，照射給藥處3 min，照射后避光靜置10 min．

1.2.3 燙傷藥效學檢測指標

1）體重和創(chuàng)面愈合率測量

第1天、第5天、第7天分別對各組燙傷創(chuàng)面的愈合、結痂和體重進行拍照觀察和測量．游標卡尺測量各組燙傷創(chuàng)面長寬，根據(jù)公式（1）計算創(chuàng)面面積，根據(jù)公式（2）計算創(chuàng)面愈合率．

式中：r1為短軸半徑，r2為長軸半徑．

2）創(chuàng)面組織病理切片

第12天，處死小鼠并剪下小鼠背部皮損部位，經(jīng)4%中性甲醛液固定過夜，處理好的組織用PBS（pH 7.2）清洗，洗去組織表面殘存的多聚甲醛固定液，然后用乙醇組織脫水，進一步將組織浸泡在純二甲苯中，組織變?yōu)橥该鳡顟B(tài)后取出放于液體石蠟中包埋，待石蠟充分凝固即可切片．切片用蘇木精-伊紅（HE）染色，完成后封片，在光學顯微鏡下觀察各組創(chuàng)面愈合情況．

3）創(chuàng)面處VEGF和肝臟中IL-1β測定

取各組小鼠背部皮膚或肝臟組織，剪成3 mm碎片，以1︰9（w/v）比例加入PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）．分別放入3個直徑為3 mm和2個直徑為4 mm的研磨專用鋼珠后，置于低溫組織研磨機按以下參數(shù)運行：4 ℃、運行頻率70 Hz、運行時間60 s、暫停時間30 s、運行次數(shù)4次．勻漿液繼續(xù)放入高速冷凍離心機按照21 100×g（4 ℃）離心20 min后，收集上清液，0.45 μm濾膜過濾去除雜質后進行酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）．即在96孔板中依次加標準品和小鼠皮膚上清液50 μL及酶標記檢測抗體100 μL；封板后置于37 ℃搖床孵育60 min；甩干后迅速加入250 μL洗滌液靜置30 s，重復如上操作5次并拍干板；在避光處依次加入50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B十字型震蕩，靜置15 min后加入終止液．立即通過酶標儀在450 nm波長處測量OD值．

1.2.4 制劑抗菌效果與機制研究

1）在體抗菌效果評價

燙傷模型小鼠處死前，用無菌生理鹽水1 mL沖洗燙傷創(chuàng)口，重復3次，收集3 mL沖洗液，于生物安全柜操作臺中取出10 μL接種于瓊脂平板，置于37 ℃恒溫箱內培養(yǎng)24 h．隨后肉眼觀察菌落分布情況．

2）藍光照射下制劑對活性氧檢測試劑吸光度變化的測定

在滴加一滴DMSO于待測制劑后，加入同超純水pH接近的PBS（pH 5.4）溶液，使其中姜黃素濃度為10 μg/mL．置于超濾離心管中（MW 1K），25 ℃、14 000×g離心15 min后取濾液，從中精密量取2 mL與等體積的0.064 mmol的DPBF混合，立即倒入直徑為1 cm的小燒杯，用光照功率大約為100 mW·cm-2的450 nm藍光照射90 s后立即置于DPBF的最大吸收波長410 nm處測定吸光度A．根據(jù)公式（3），計算吸光度降低率，用來推測各制劑在藍光照射下的活性氧產生情況．

式中：A0為空白介質與DPBF混合后的吸光度．

2 結果與分析

2.1 制劑吸水性測試

如圖1所示，未載藥μmS和Cur+GA@μmS分別與水混合后，在60 min內可吸收一半的水分，暗示該制劑作為敷料能吸收燙傷創(chuàng)面的滲出液、促進創(chuàng)面愈合[16]．

2.2 各組給藥后創(chuàng)面及體重變化

各給藥組涂于燙傷創(chuàng)面連續(xù)11天后的愈合情況如圖2所示．建模第1天，各組均出現(xiàn)水泡及紅腫現(xiàn)象．第5天全部測試組出現(xiàn)痂皮．第11天，燙傷模型組痂皮脫落，可見膿腫，暗示細菌感染；其它各組膿腫消失，說明給藥各組具有一定抗菌作用；但只有Cur+GA@μmS藍光組的創(chuàng)面愈合率和模型組有顯著性差異（圖3A）．給藥各組對于體重的變化，只有空白組和空白藍光組的體重呈增加趨勢，其它各組均呈下降趨勢（圖3B）．藍光照射雖能幫助對應組增加體重，但只有Cur+GA@μmS藍光組和Cur+GA@μmS組之間有顯著性差異（P<0.05）．原料藥及單純未載藥載體組是否照射藍光對體重影響不大（P>0.05）．

圖3 各組小鼠燙傷創(chuàng)面愈合率和體重變化

2.3 創(chuàng)面病理變化

燙傷會帶來蛋白質變性和凝固，毛細血管通透性增加誘發(fā)水腫．如圖4所示，燙傷模型組表皮損傷嚴重、結構不清晰、真皮全層膠原呈嗜酸性均質化改變[17]，真皮網(wǎng)狀層深部膠原纖維增生[18]、膠原蛋白空泡變形、纖維排列紊亂[19]、大量炎癥細胞浸潤，證實了通過本研究方法能獲得深Ⅱ度燙傷．而Cur+GA@μmS藍光組顯著減少了膠原蛋白空泡變形和炎癥細胞浸潤，恢復了表皮和真皮膠原纖維結構，說明該組已經(jīng)重建功能化皮膚．且Cur+GA@μmS藍光組相比Cur+GA@μmS組，表皮層厚度明顯較低，說明藍光促進了愈合過程，較早出現(xiàn)成熟的、較薄的上皮結構[1]．其余組別上皮組織恢復慢、炎癥細胞殘留多、真皮纖維排列松散．各組照射藍光后恢復效果更好，很可能是因為姜黃素在藍光照射下具有殺菌作用，使得燙傷后皮膚易感染的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等定植減少，利于恢復皮膚結構．該推測通過在體抗菌檢測進行驗證．

圖4 HE染色觀察小鼠創(chuàng)面組織病理變化（200×）

2.4 創(chuàng)面處VEGF和肝臟中IL-1β測試

如圖5A所示，Cur+GA@μmS組在藍光照射下同空白組有顯著性差異（P<0.05），但同模型組的VEGF無顯著性差異（P>0.05），可能是因為尚處于愈合前期，這和其它報道姜黃素制劑對燙傷創(chuàng)面處VEGF的影響一致[17]．

圖5 各組制劑對燙傷創(chuàng)面VEGF和肝臟IL-1β的影響

如圖5B所示，Cur+GA@μmS藍光組、Cur原料藥藍光組、空白組相比燙傷模型組均有顯著性降低（P<0.05），而Cur+GA@μmS藍光組的IL-1β含量又低于Cur+GA@μmS組、Cur原料藥藍光組和Cur原料藥組（P<0.05）．因此，Cur+GA@μmS藍光組被認為是加速燙傷創(chuàng)面愈合最顯著的一組，該推論也和上述傷口愈合率及病理切片結果一致．

2.5 在體抗菌效果評價

燙傷創(chuàng)面受到細菌感染后，會導致創(chuàng)面加深、愈合延遲，甚至威脅患者生命[16]．金黃色葡萄球菌作為燙傷創(chuàng)面較為常見的致病菌[10]，被本研究用于評價各制劑的在體抗菌效果．圖6證實在體條件下，Cur+GA@μmS藍光能有效殺菌．可能是因為姜黃素在藍光照射下能產生活性氧，進而對金黃色葡萄球菌產生殺菌作用[9]．而抑制細菌毒素可促進創(chuàng)面愈合[10]，這和傷口愈合率及病理切片結果一致．令人意外的是，未載藥的μmS對細菌也有一定抑制作用，為了驗證這是否也和活性氧有關，本研究進行了體外活性氧產生量的測定．

圖6 各組制劑的在體抗菌平板圖

2.6 藍光照射下制劑對活性氧檢測試劑吸光度變化的測定

本研究利用DPBF可捕獲活性氧[20]進而降低吸光度的原理[21]來推測各制劑產生活性氧的能力．如圖7所示，和其它檢測制劑相比，姜黃素原料藥（Cur RDP）在同等量藍光照射后，對DPBF的吸光度降低率最低（P<0.05），說明姜黃素僅以原料藥狀態(tài)存在時，活性氧的產生率最低．當Cur RDP和甘草酸物理混合后，吸光度降低率幾乎未增加．但當姜黃素載入μmS后，無論是否有甘草酸的參與，載藥制劑的吸光度降低率相比原料藥均顯著增加（P<0.05），說明載入μmS后活性氧產生能力大大增強，這可能是因為μmS表面和內部有大量硅醇基所致[22]．

圖7 各組制劑的吸光度降低率

3 分析與討論

毛細血管的重構是燙傷皮膚組織進行修復的關鍵環(huán)節(jié)，它的新生情況可通過血管內皮生長因子VEGF來表示．VEGF的增加可加速肉芽組織的形成，促進燙傷創(chuàng)面中晚期的愈合[19]，暗示皮膚修復的速度和質量[23]．燙傷后機體出現(xiàn)應激反應，大量分泌白介素IL-1β[10]，會引發(fā)后續(xù)的多器官功能不全綜合癥和全身炎癥反應綜合癥．本研究中，姜黃素和甘草酸載入微米介孔硅后，對VEGF的促進作用和對IL-1β的降低作用均不夠明顯，即自身促進傷口愈合效果并未與模型組自身恢復有顯著性差異，但是當照射藍光后，出現(xiàn)顯著性優(yōu)勢．且微米介孔硅便宜易得，表面自帶硅醇基，具有吸濕效果，適合應用在燙傷創(chuàng)面吸收滲出液．

4 結論

本研究以敷料對水的吸收程度，燙傷后各組小鼠創(chuàng)面愈合率、體重差、病理切片、創(chuàng)面處金黃色葡萄球菌生長情況和VEGF含量、肝臟中的IL-1β含量為評價指標，檢測共載姜黃素和甘草酸的微米介孔硅作為燙傷敷料的潛力．經(jīng)實驗驗證，該敷料具有一定吸水性能，符合燙傷敷料能吸收滲出液的要求；在藍光照射下能增加創(chuàng)面愈合率、有效殺菌、增強VEGF表達、降低肝臟中IL-1β表達，即使在維持體重方面和空白組具有一定差異，但藍光照射在其中已起到一定積極作用．因此，共載姜黃素和甘草酸的微米介孔硅在藍光協(xié)助下將是具有臨床應用潛力的燙傷創(chuàng)面敷料．