左琴琴 張良子 吳大洲 張泳 褚曉月 張薇薇 王紅 毛娟 徐華(陜西省血液中心，陜西 西安 710061)

截止2023 年3 月，國際輸血協(xié)會(International Society of Blood Transfusion，ISBT)公布了45 個血型系統(tǒng)，共360 個抗原，ABO 血型系統(tǒng)作為第1 個被發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng)，在臨床輸血醫(yī)學中有著非常重要的作用[1]，因此ABO 血型的準確定型對于紅細胞的相容性輸血來說具有重要的臨床意義[2-3]。目前，ABO 血型的血清學鑒定依然沒有更好的替代方案，基因分型檢測的只是能否表達相應酶的先決條件，有基因并不代表相應的抗原一定能夠表達[4-7]，因為無論是合成A 抗原的N-乙酰-D-半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶還是合成B 抗原的半乳糖轉(zhuǎn)移酶，只有在H 底物存在且酶促反應條件具備的情況下才有可能正常表達相應的A、B 抗原，因此，對無可替代的血清學實驗技術(shù)有必要做更加深入細致的研究。 本文就單克隆定型試劑及人源抗-A/B 在吸收放散試驗中的應用進行對比評價，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象及標本來源 2015 年9 月—2023 年3 月期間西安地區(qū)的無償獻血者標本，29 名獻血者均為漢族，排除了重復獻血者。 獻血者ABO 血型微孔板法初次篩查均顯示正反定型不符，且同時使用了單克隆抗-A/B 及人源抗-A/B 進行吸收放散試驗，最終確定了ABO 血型。 2022 年7 月至8月期間檢測了西安地區(qū)512 名A 型及504 名B 型無償獻血者抗-A/B 效價。

1.2 試劑與儀器 正定型抗-AB 試劑(Rapid Labs Ltd，英國，BG-AB 10，批號:AB 0520-30)；抗-A/B 試劑(試劑1:上海血液生物，批號:20211218；試劑2:長春博德生物，批號:20220301；試劑3:Rapid Labs Ltd，英國，BC-A 10 和BC-B 10，批號:600144-B 2 和610168-H 2；)；反定型ABO 試劑紅細胞(上海血液生物，批號:20235306)；人源抗-A/B，O 型紅細胞(實驗室自制)；DL 2000， 2X GC Buffer， LATaq酶，dNTP，6× Loading Buffer ( TaKaRa， 日 本， 批 號: AJG1333AA，AK7160A， AL14425A， AKF2422A， A6601A)；血液基因組DNA 提取試劑盒(Roche，德國，批號:11796828001)；臺式離心機(KA-2200 型，日本久保田)；臺式高速離心機(FL-3010，徽科方領)；臺式低速離心機(FL-1008，徽科方領)；全自動紅細胞洗滌離心機(MC 450，日本日立)；PCR 儀(Sensoquest Labcyle，德國)；水浴箱(GFL，德國)。

1.3 方法

1.3.1 血清學試驗 按照文獻方法[8-9]，采用試管法同時使用3 個廠家的單克隆試劑進行ABO 血型血清學正反定型試驗；吸收放散試驗使用試劑1(上海血液生物)及人源抗-A/B 血清，按照文獻方法[10]同時進行。

1.3.2 獻血者人群中抗-A/B 效價檢測 按照文獻方法[9]，采用試管法將血清倍比稀釋后檢測西安地區(qū)B/A 型獻血者人群中抗-A/B 的效價，最終以肉眼可見凝集強度1＋的最高稀釋度的倒數(shù)表示。

1.3.3 DNA 制備 按照Roche DNA 提取試劑盒說明書，從5 mL EDTA-K2抗凝外周血標本中提取基因組DNA，用于標本的ABO 基因檢測。

1.3.4 基因分型方法 ABO 基因Exon 6，7 特異性擴增測序所有樣本，按照文獻方法[11]進行操作，無法確定樣本ABO基因型時對Exon1-7 同時擴增確定其基因型。 試驗中使用擴增引物[11]的合成及擴增產(chǎn)物的測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司西安測序部完成。

1.3.5 統(tǒng)計分析 使用SPSS 22.0 軟件，用描述性統(tǒng)計方法分析獻血者人群中抗-A/B 效價的分布。

2 結(jié)果

2.1 西安地區(qū)獻血者人群中抗-A/B 效價分布 獻血人群中人源抗-A 效價95%置信區(qū)間上限為59.29，眾數(shù)為64；人源抗-B 效價95%置信區(qū)間上限為62.10，眾數(shù)為128。 故本研究吸收放散試驗中所使用的人源抗體選擇4～6 人份且效價為64 的獻血者血漿進行試驗(表1)。

表1 人源抗-A/B 在獻血者人群中的效價分布

2.2 單克隆試劑與人源抗-A/B 特異性的比較 3 種單克隆抗-A/B 定型試劑與人源抗-A/B 對A、B、O 和AB 4 種表型(各型數(shù)量n＝3)紅細胞在4℃10 min、室溫、37℃10 min 條件下反應的特異性見表2(3 種單克隆試劑結(jié)果一致)，試驗中人源抗-A/B 的效價均為64，4 種血型表型對應的基因型分別為ABO*A1.01/O.01.01，ABO*B.01/O.01.01，ABO*O.01.01/O.01.和ABO*A1.01/B.01。 在此試驗中，3 種單克隆抗-A/B 定型試劑與各標本在4℃10 min、室溫、37℃10 min條件下反應強度均為4＋，而人源抗-A/B 與各標本在4℃10 min 及室溫條件下反應強度均為4＋，但在37℃10 min 反應后強度變?nèi)鯙?＋s。

表2 單克隆試劑與人源抗-A/B 特異性的比較

2.3 單克隆試劑與人源抗-A/B 親和力的比較 3 種單克隆抗-A/B 定型試劑、效價稀釋到64 的3 種單克隆定型試劑及人源抗-A/B 與A1/B 細胞反應的抗體效價、出現(xiàn)凝集時間及凝集強度的檢測結(jié)果見表3，人源抗-A/B 選擇效價64 的獻血者(n＝3)。 人源抗體出現(xiàn)凝集的時間為40 s，與效價稀釋到64 的單克隆定型試劑相比，出現(xiàn)凝集的時間較長，凝集強度也較弱(1＋)。

2.4 ABO 血型鑒定中人源抗體在吸收放散試驗的應用 對29 例ABO 正反定型不符的標本，采用試管法分別進行正、反定型的檢測，使用3 個廠家的單克隆抗-A/B 定型試劑同時進行正定型的檢測。 吸收放散試驗使用試劑1(上海血液生物)及人源抗-A/B 血清同時進行；各標本基因測序結(jié)果以ABO*A1.01 等位基因(GenBank No:NG_006669.1)為參考序列進行比對，結(jié)果見表4。 3 號標本(ABO*AEL.02/O.01.01)單克隆抗體及人源抗體均未檢出A 抗原；2 號(ABO*AEL.02/O.01.01)，16 號(ABO*BEL.03/O.01.01)及25 號標本(ABO*A1.02/BEL.11)單克隆抗體檢出A/B 抗原，而人源抗體均未檢出A/B 抗原；29 號標本(ABO*A1.02/A1.02)單克隆抗體檢出B 抗原，而人源抗體未檢出，此種結(jié)果出現(xiàn)的原因可能為單克隆抗體間的交叉反應性引起。 29 個標本中未發(fā)現(xiàn)人源抗體檢出A/B 抗原，單克隆抗體未檢出A/B 抗原。

表4 單克隆試劑及人源抗-A/B 檢出能力的比較

3 討論

ABO 血型系統(tǒng)為臨床輸血醫(yī)學中最為重要的血型系統(tǒng)，ABO 血型正反定型的準確性是紅細胞相容性輸血的基本前提。 ABO 血型系統(tǒng)中A 和B 抗原是在H 抗原的基礎上通過糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用形成的，通過其與抗-A/B 反應的凝集強度加以區(qū)分和鑒別[12]。

吸收放散試驗是鑒定ABO 弱表現(xiàn)型(亞型)的重要的血清學試驗[13]，故ABO 血型血清學的鑒定中就需要注意吸收放散試驗的使用以及試驗中吸收用抗體的選擇。 本研究對29 例ABO 正反定型不符并且需要通過吸收放散試驗確定ABO 血型的標本進行研究，比較分析了3 種單克隆定型試劑及人源抗-A/B 的特異性、親和力以及在吸收放散試驗中對弱抗原的檢出能力。 從試驗表現(xiàn)看，人源抗-A/B 在37℃反應的凝集強度較低，同時與效價稀釋到64 的單克隆定型試劑＋對應紅細胞反應相比較，出現(xiàn)凝集的時間較長，凝集強度也較弱，親和力較低，其原因可能是人源抗體針對特定表位的抗體濃度低。 吸收放散試驗中，3 號標本單克隆試劑及人源抗體均未檢出A 抗原；2，16 及25 號標本單克隆試劑檢出A/B 抗原，而人源抗體均未檢出A/B 抗原；其余標本單克隆試劑及人源抗體均同時檢出A/B 抗原，但是人源抗體的凝集強度相對較弱。 29 個標本中未發(fā)現(xiàn)單克隆抗體未檢出A/B 抗原，而人源抗體檢出A/B 抗原的情況。

單克隆抗體是采用雜交瘤技術(shù)由1 個僅識別1 種抗原表位的B 細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，其特異性強，純度高[14]。 通常，鑒定A/B 抗原的市售抗體均為針對某一抗原表位的單克隆抗體，具有親和力和敏感性好的優(yōu)點。 但是，單克隆抗體也存在一定的缺陷，當標本抗原上缺失單克隆抗體對應的表位時，就可能產(chǎn)生陰性的反應結(jié)果[15]。 由于ABO 抗原的復雜性，在ABO 弱表現(xiàn)型(亞型)的鑒定中，就會出現(xiàn)某一廠家血型定型試劑鑒定結(jié)果陰性，而另一廠家血型定型試劑結(jié)果陽性的問題，我們曾報道了不同廠家血型單克隆定型試劑在ABO 弱表現(xiàn)型(亞型)鑒定結(jié)果的差異性[15]。此外，如果當單克隆抗體針對的A 抗原的某些表位和B 抗原共有時，針對A 抗原的抗體也會和B 抗原發(fā)生反應，反之亦會出現(xiàn)，這種現(xiàn)象即為抗體的交叉反應性，在某些情況下可以造成結(jié)果的誤判[13]，如本研究中的29 號標本(ABO*A1.02/A1.02)經(jīng)單克隆抗體進行吸收放散試驗后，檢測出紅細胞上存在B 抗原，而人源抗體未檢出。 鑒于此，人源抗-A/B作為多克隆抗體，理論上可覆蓋較多的A/B 抗原表位，能捕捉到ABO 弱表現(xiàn)型(亞型)上的表位，但人源抗-A/B 也存在較大的缺陷，主要是抗體濃度低、親和力低，同樣會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，因此在鑒定ABO 弱表現(xiàn)型(亞型)的試驗中，更多應用于吸收放散等敏感性較高的血清學試驗。

綜上所述，ABO 血型鑒定中，單克隆抗-A/B 和人源抗-A/B 抗體在吸收放散試驗中有不同的反應特性和結(jié)果。 需要提示的是，在血清學試驗中，只有依據(jù)各種方法、試劑的特點，合理選擇使用的試劑，同時合理采用相應的方法學，才能得出準確的結(jié)果，確保輸血安全。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。