陳靜文 陳少彬 魏潤葵 袁秋婷 何子毅(東莞市中心血站，廣東 東莞 523000)

我國血液篩查對HIV、HBV 和HCV 感染標志物的檢測策略為“應至少采用核酸和血清學試劑各進行1 次檢測[1]”，大多數(shù)血站采用的是2 遍血清學酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assays，ELISA)和1 遍核酸檢測(nucleic acid testing，NAT)的策略，較好地保障血液安全。 本站采用的是2 遍國產ELISA 試劑和1 遍進口PCR(6 混1)的檢測模式，在實際工作中，核酸檢測為反應性的項目主要為HBV DNA[2]，且絕大多數(shù)為首次獻血者，少數(shù)為重復獻血者。 首次獻血者在被檢出HBV DNA 陽性時則被屏蔽獻血，而少數(shù)的重復獻血者被檢出HBV DNA 后，我們發(fā)現(xiàn)其核酸檢測閾值循環(huán)數(shù)(threshold cycle，Ct)可能與前1 次獻血間隔時間或累積獻血次數(shù)有一定差異。 為了了解不同類型的HBsAg-/HBV DNA＋獻血者的檢測結果差異，進一步評估重復獻血者的核酸檢測殘余風險，我們對不同獻血次數(shù)、不同獻血間隔時間的獻血者HBV DNA 檢測Ct 值進行分析，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過血站信息系統(tǒng)獲取2019 年2 月—2022年1 月在本站參與無償獻血的270 283 名獻血者的核酸檢測結果(Ct 值)及其獻血時間等信息作為研究資料。

1.2 試劑與儀器 HBsAg 酶免檢測試劑(北京萬泰公司，批號:B20180728—B20211038；珠海麗珠公司，批號:20180814 08—2019122108；英科新創(chuàng)公司，批號:2020055110—202108 5125)；Roche Cobas TaqScreen MPX v2.0 核酸檢測試劑(羅氏診斷公司，批號:G16011，G11355，F(xiàn)07571，E31914，324291)。 所用試劑均為國家食品藥品檢定研究院鑒定為合格產品，且在有效期內使用。 Freedom evo 全自動加樣儀(TECAN 公司)，AE368 全自動酶免分析系統(tǒng)(深圳愛康公司)MICROLAB STAR IVD 加樣儀(漢密爾頓公司)，Cobas s201 全自動核酸檢測系統(tǒng)(羅氏診斷公司)，8420 型離心機(KUBOTA 公司)。

1.3 方法 在血站信息系統(tǒng)(啟奧9.0)查詢2019 年2 月—2022 年1 月獻血者的獻血次數(shù)和獻血時間，核酸檢測Ct 值(包括混檢和拆分的Ct 值)，并按獻血者累計獻血次數(shù)分為:初次獻血者組(A)及重復獻血者組(B)；重復獻血者組再按具體的獻血次數(shù)分為重復獻血2 次組(C1)、重復獻血≥3 次組(C2)；重復獻血者組再按首次核酸檢測反應性與前1 次獻血的時間的間隔時長分為:＜1 年組(D1)、1～3 年組(D2)、≥3 年組(D3)。

1.4 統(tǒng)計學分析 獻血者HBV DNA 檢測Ct 值采用M(QR)表示，HBV DNA 檢出率采用百分比(%)表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件繪制箱體圖，組間HBV DNA 檢出率比較采用卡方檢驗，組間Ct 值差異采用獨立樣本的Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同類型獻血者的HBV DNA 核酸檢測結果 見表1。

表1 不同類型獻血者的HBV DNA 檢出率比較 (n，%)

2.2 不同類型獻血者的HBV DNA 檢測Ct 值及其分布情況

各組Ct 值經正態(tài)性檢驗呈非正態(tài)分布，采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，見表2。

表2 各組核酸混檢與拆分的Ct 值情況[M(QR)]

2.3 各組Ct 值的分布情況 見圖1～3。

圖1 初次獻血者與重復獻血者的Ct 值分布情況

圖2 不同獻血次數(shù)獻血者的核酸拆分Ct 值分布情況

3 討論

近年來本市的無償獻血招募模式經過多番調整和實踐，現(xiàn)今以團體預約招募為主、街頭采血為輔，重復獻血者的結構比例也有所提升。 由于重復獻血者的血液安全性較高，各地血站也努力招募和鞏固重復獻血者隊伍，以期從源頭上保障血液安全。 然而，在血站實驗室的核酸檢測中，我們仍發(fā)現(xiàn)一定比例的HBsAg 無反應性的重復獻血者被檢出HBV DNA。 我國是HBV 高發(fā)地區(qū)，且有多種HBV 亞型，實驗室ELISA 等血清學檢測方法因試劑、檢測儀器、人員操作、感染人員條件復雜等因素，導致仍有部分感染情況復雜的獻血者漏檢，尤其是隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)，給臨床用血安全造成潛在風險[3-5]。 我們通過分析不同類型獻血者與其核酸HBV DNA 檢測混檢(6混1)與單檢(拆分)的Ct 值的相關性，探討本地區(qū)重復獻血者的乙型肝炎隱匿性感染風險，為實驗室優(yōu)化血液檢測策略提供參考依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)初次獻血者組的HBV DNA 檢出率明顯高于重復獻血者組(P＜0.05)，這與魏勝男等[6]報道的78 份HBV DNA 反應性標本的獻血者中60.3%(47/78)為重復獻血者的結果不同。 有研究分析了我國18 家地市級血站獻血者血液HBV 檢測相關數(shù)據(jù)情況，發(fā)現(xiàn)各地區(qū)血站的初次獻血者、重復獻血者HBsAg ELISA 不合格率呈現(xiàn)較大地區(qū)性差異[7]，原因可能與不同地區(qū)的HBV 流行率、血液篩查模式以及獻血者人群結構不同有關。 因此，各地區(qū)針對不同類型的重復獻血者開展HBV DNA 的感染風險評估對鞏固低危獻血者隊伍和優(yōu)化血液篩查策略具有重要意義。 從本研究重復獻血者組中檢出小部分OBI 獻血者，且其核酸單檢(拆分)Ct 值比初次獻血者組高，按照PCR 原理擴增的初始濃度與Ct 值的負相關以及混檢Ct 值越大，拆分陽性率相關性越差的關系推斷[8]，重復獻血者拆分Ct 值越高說明標本中所攜帶的HBV 載量可能越低。 圖1 可見拆分Ct 值分布較混檢Ct 值的寬，離群值也較混檢Ct 值的多，說明該OBI 獻血者的感染情況更加隱匿，檢測難度更大。 有研究報道HBsAg-/HBV DNA＋獻血者的病毒載量極低且病毒載量具有波動性，即便后續(xù)幾次檢測陰性也不能排除非感染狀態(tài)[9]，鄭欣等[10]通過10 年的長期隨訪追蹤隱匿性乙型肝炎病毒感染者的預后轉歸情況，發(fā)現(xiàn)42.5%的OBI 獻血者仍保持OBI 感染狀態(tài)，有7.5%的OBI 獻血者在多次復查中結果呈多次陰陽結果交替轉換的情況，以至于病毒核酸檢測出現(xiàn)漏檢機會。

由于重復獻血者定期參加獻血，在前1 次獻血時合格的獻血者再次獻血時，HBV 感染性指標轉陽，表明該獻血者是在獻血間隔期內的新感染者。 本研究分析不同獻血間隔時間的獻血者的核酸檢測Ct 值，發(fā)現(xiàn)初次獻血者組拆分Ct 值分別與間隔1 年內重復獻血者組、間隔≥3 年重復獻血者組比較，重復獻血間隔時間在1～3 年內混檢的Ct 值與拆分比較，均有差異(P＜0.05)。 說明Ct 值與不同獻血間隔時間可能存在一定的相關性。 獻血間隔時間短的獻血者可能比較注重自身健康及衛(wèi)生問題，防范病毒感染的警惕性較高，而間隔1～3 年的重復獻血者組較間隔1 年內在間隔時間上更長，其拆分Ct 值中位數(shù)較低，病毒拷貝量更大，此類人群可能在前次獻血成功并檢測正常后有放松防范的心態(tài)，等到再次獻血時正處于HBV 感染窗口期或乙型肝炎急性感染期[11]，因此，間隔1～3 年內重復獻血者組的血液可能比短期內經常獻血人群的風險大。 從本次的研究結果看，間隔≥3 年的重復獻血者在獻血人群中的數(shù)量雖然少，其感染HBV風險依然存在。 而從累計獻血次數(shù)分類的結果看，不同累計獻血次數(shù)的重復獻血者之間的拆分Ct 值差異無統(tǒng)計學意義，但重復≥3 次獻血者組的拆分Ct 值分布寬度比重復2 次獻血者組要大，且離群值更多，重復獻血次數(shù)越多才能被核酸檢測系統(tǒng)檢測識別出來的獻血者，其感染情況較獻血次數(shù)少的更為復雜和隱匿。 有報道高齡組獻血者OBI 感染率明顯高于低齡組，且衛(wèi)生知識普及度低，定期獻血的主動性不足、機體免疫力相對低，生活中易暴露，而低齡組出生時正處于乙肝疫苗接種普及時代[12]。 這可能也是獻血間隔時間長或獻血次數(shù)的增加，獻血者感染暴露的風險增大的另一個因素。 由于本次收集的獻血者信息量有限，尚未能區(qū)分比較間隔時間≥3 年的獻血者的感染風險，有待今后加大樣本量，豐富其結果分析。

無論是初次獻血者組還是重復獻血者組，均存在HBV DNA 漏檢的風險。 這取決于篩查試劑的靈敏度和血液標本的質量。 Candotti 等[13]報道了更低感染劑量的HBV 經輸血引起HBV 感染的病例。 若OBI 獻血者的HBV 載量在檢測試劑的最低檢測限上下，也有可能發(fā)生輸血感染風險。 李春祥等[14]采用提取體積6 mL 血漿PEG 沉降及超高速離心富集HBV 的方法，雖然該方法可有效提高極低病毒載量標本的陽性檢出率，但操作繁瑣，一般的實驗室難以開展。 此外，對于HBsAg ELISA 檢測存在弱反應性(高S/CO 值陰性標本)時需要特別關注不同核酸檢測模式的結果，其單檢模式的HBV DNA 陽性檢出率較混檢模式的高[15-16]，如若懷疑該標本可能存在血清學漏檢，可增加化學發(fā)光法作為補充試驗或直接對其進行核酸單檢。 因此，為防止OBI 獻血者的機會性漏檢，只有選擇更高靈敏度的檢測試劑，不斷優(yōu)化檢測模式，甚至采用更先進的新技術。

綜上所述，獻血者核酸檢測HBV DNA 的Ct 值與不同獻血次數(shù)、不同獻血間隔時間存在一定的相關性，開展不同類型重復性獻血者的核酸檢測殘余風險評估對鞏固低危獻血隊伍和保障源頭血液安全具有重要意義。 血站實驗室應定期開展針對實驗室檢測策略有效性的評估，以不斷提高檢測能力，確保血液安全。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。