馬穎超，張凌晗，冷小敏，朱秀志，謝富華

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)教研室，江西 贛州 341000）

熱休克蛋白90（Heat shock protein90， HSP90）主要存在于真核和原核細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)最重要、含量最豐富的分子伴侶蛋白，在維持細(xì)胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定構(gòu)象與正常功能中起重要作用。天然藥物通過(guò)與HSP90 的調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合引起HSP90 構(gòu)象改變，并誘導(dǎo)底物蛋白的降解，從而發(fā)揮抑制作用，抑制HSP90 下調(diào)其下游蛋白并影響腫瘤進(jìn)程，使其成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本文對(duì)靶向HSP90 抗腫瘤天然藥物的分類、作用機(jī)制及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HSP90的生物學(xué)特性

1.1 HSP 的發(fā)現(xiàn)與分類熱休克蛋白（HSP）是生物體在受到物理、化學(xué)、生物、精神等刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)。HSP 蛋白是1962 年意大利科學(xué)家RITOSSA F M 發(fā)現(xiàn)的，他在研究果蠅唾液腺染色體時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)這些果蠅被無(wú)意中置于高溫下，染色體中會(huì)出現(xiàn)特征性膨脹［1］。因此，他推斷這種“膨脹”現(xiàn)象是由于熱應(yīng)激后基因激活導(dǎo)致特定蛋白質(zhì)的表達(dá)增加。1974 年，有人從果蠅幼蟲的唾液腺等部位分離到新的蛋白質(zhì)，并把它命名為“熱休克蛋白”［2］。根據(jù)同源程度和分子量的大小，熱休克蛋白共分為5 類，分別為大分子熱休克蛋白（100～110 KD）、HSP90（83～93 KD）、HSP70（66～78 KD）、HSP60（60 KD）以及小分子熱休克蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）（15～30 KD）。其中，人類的HSP90蛋白根據(jù)其細(xì)胞定位又可分為4種亞型：存在于胞漿中的HSP90α和HSP90β、存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP94）以及存在于線粒體基質(zhì)中的HSP75/腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白-1（Tumor necrosis factor receptor-associated protein1，TRAP-1）［3］。

1.2 HSP90的結(jié)構(gòu)HSP90 在細(xì)胞內(nèi)主要存在形式是同源二聚體，其中每個(gè)單體包括3 個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域：N 端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain， NTD）、C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain， CTD）和中間結(jié)構(gòu)域（Middle domain， MD）［4］，每個(gè)結(jié)構(gòu)域執(zhí)行特定的功能。NTD 與ATP 結(jié)合，也稱為核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。CTD 負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的二聚化，并含有特殊的序列MEEVD 或KDEL，其取決于HSP90 的亞型及其在細(xì)胞質(zhì)或雌激素受體（Estrogen receptor， ER）中的定位水平［5］。

1.3 HSP90的功能熱休克反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子是HSP90，是細(xì)胞內(nèi)最重要、含量最為豐富的分子伴侶蛋白，在維持細(xì)胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定構(gòu)象與正常功能中起著重要作用［6］。其功能是將新生的多肽鏈折疊成活性構(gòu)象，促進(jìn)聚集或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)糾正，還可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工。據(jù)報(bào)道，HSP90 在腫瘤細(xì)胞中具有較高的ATP 酶活性，其對(duì)腫瘤細(xì)胞中抑制劑的結(jié)合親和力是正常細(xì)胞的20～200 倍［7］。BIEBL M M 等［8］發(fā)現(xiàn)HSP90 具有穩(wěn)定致癌蛋白的獨(dú)特作用，可以作為癌癥治療的靶點(diǎn)。此外，研究結(jié)果表明，HSP90在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌等腫瘤中過(guò)表達(dá)，腫瘤的惡性程度和預(yù)后程度跟HSP90 的高表達(dá)有關(guān)，抑制HSP90可以下調(diào)下游蛋白、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和延緩腫瘤進(jìn)展［9-14］。

2 靶向HSP90的天然藥物及其抗腫瘤作用

由于具有多種生物活性和理想的治療效果，天然藥物已經(jīng)得到了越來(lái)越多的關(guān)注，在抗腫瘤藥物的研究中也占有相當(dāng)大的比例。這些藥物除了直接抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，還可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、抑制轉(zhuǎn)移等作用間接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。比如紫杉醇是靶向HSP90 的天然藥物，其通過(guò)阻滯細(xì)胞周期從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可通過(guò)抑制HSP90 伴侶功能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；魚藤素具有抗血管生成作用以及對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和多種癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用；水飛薊賓是HSP90-C末端抑制劑，可誘導(dǎo)幾種HSP90 依賴性客戶蛋白的降解。

2.1 靶向HSP90并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的天然藥物

2.1.1 紫杉醇紫杉醇（Taxol）是一種來(lái)源于紅豆杉科植物紅豆杉的根、樹(shù)葉以及樹(shù)皮的次生代謝物，分子式C47H51NO14。其可增加微管蛋白聚合、微管蛋白捆綁、細(xì)胞周期阻滯［15］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紫杉醇可誘導(dǎo)肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞凋亡［16-18］。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)親和純化紫杉醇可與HSP90 結(jié)合，從而產(chǎn)生刺激反應(yīng)［19-21］。這種刺激反應(yīng)不僅使惡性腫瘤對(duì)紫杉醇敏感，而且對(duì)神經(jīng)保護(hù)劑的開(kāi)發(fā)有指導(dǎo)作用。紫杉醇與HSP90 結(jié)合的位點(diǎn)尚未闡明，但有研究［22］表明，紫杉醇對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)的抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。紫杉醇誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡具有典型的特征，包括染色質(zhì)凝集、染色質(zhì)新月體形成、細(xì)胞核碎裂和凋亡小體形成等形態(tài)學(xué)改變，其還可降低SGC-7901細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22］。

紫杉醇是細(xì)胞阻斷劑，能夠誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡，它的抗癌效果與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力密切相關(guān)。紫杉醇對(duì)人絨癌細(xì)胞的主要作用靶點(diǎn)是微管系統(tǒng)。其能促進(jìn)微管聚合，抑制微管降解，使細(xì)胞分裂阻滯在G2/M 期。在同一濃度的紫杉醇作用下，細(xì)胞凋亡率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加［16］。紫杉醇具有抑制腫瘤發(fā)展和提高生存率的作用，但因溶解度差、骨髓毒性、過(guò)敏反應(yīng)和耐藥性等問(wèn)題制約了其臨床應(yīng)用，因此，紫杉醇常與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，以增強(qiáng)抗腫瘤作用，減少不良反應(yīng)。比如，ROUSSEL E 等［23］將紫杉醇和冬凌草甲素衍生物Geridonin 聯(lián)用，Geridonin 通過(guò)激活Caspase 級(jí)聯(lián)增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Geridonin 和紫杉醇協(xié)調(diào)凋亡的作用是通過(guò)線粒體途徑，通過(guò)上調(diào)凋亡蛋白的同時(shí)下調(diào)Bcl-2 家族的抗凋亡。其主要通過(guò)ROS 介導(dǎo)的PTEN/PI3K/Akt 途徑協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞增殖，ROS 的積累是紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。

2.1.2 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocatechin gallate， EGCG）是綠茶中的重要成分，分子式：C22H18O11。其是HSP90的一種新型抑制劑，具有抗炎作用，抑制促炎細(xì)胞因子活性。EGGC 可通過(guò)抑制HSP90 同型二聚體降低與癌癥相關(guān)的HSP90 客戶蛋白ErbB2、Raf-1、p-AKT、p-ERK 以及Bcl-2 等水平。其機(jī)制是通過(guò)其在HSP90的C末端ATP結(jié)合位點(diǎn)處或附近結(jié)合的能力，通過(guò)破壞ATP 結(jié)合，誘導(dǎo)不正常的構(gòu)象變化，并抑制HSP90伴侶功能［24］。

EGCG 可降低線粒體膜電位，支持G0/G1 期細(xì)胞周期阻滯，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。此外，EGCG誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡與Bcl-2 和NF-κB 表達(dá)顯著降低有關(guān)［25］。EGCG 也可以抑制食管癌生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡，降低Bcl-2 蛋白表達(dá)，增加Caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)。在25～400 μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，用不同濃度的EGCG 處理食管癌細(xì)胞Eca109 和Ec9706 細(xì)胞24 h和48 h 后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞存活率呈劑量和時(shí)間依賴性。用不同濃度的EGCG 處理24 h 后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)［26］。

2.1.3 魚藤素魚藤素（Deguelin）是從非洲植物Mundulea sericea（豆科植物）和其他植物中分離出來(lái)的魚藤類化合物［27］。其是一種HSP90 抑制劑，對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和多種癌細(xì)胞有較強(qiáng)的凋亡和抗血管生成作用，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性［28-29］。魚藤素可在不同類型的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，包括結(jié)腸癌、胃癌、白血病、乳腺癌和肝癌細(xì)胞［30-34］。最近研究［35］發(fā)現(xiàn)，魚藤素具有抗癌活性的部分原因是它與HSP90α 的ATP 口袋結(jié)合，導(dǎo)致許多HSP90 客戶蛋白的表達(dá)下降，包括突變的p53、細(xì)胞周期素依賴激酶4（CDK4）、絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）激酶1/2（MEK1/2）、AKT 和低氧因子（HIF）-1α，以及已知的魚藤素靶點(diǎn)如環(huán)氧化酶-2（COX-2）、壞死因子κB（NF-κB）和核孔蛋白98 kDa（NUP98）。魚藤素也是PI3K 和Akt 的天然抑制劑，可通過(guò)阻斷細(xì)胞周期的G2/M 期和增加癌前和惡性細(xì)胞的凋亡來(lái)抑制細(xì)胞增殖［36］。魚藤素已被證明可通過(guò)滅活A(yù)kt磷酸化誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［37］，在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、凋亡和血管生成的綜合過(guò)程中，因在誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞和防止腫瘤惡變方面起著關(guān)鍵作用。XU H等［38］推測(cè)，魚藤素可通過(guò)誘導(dǎo)ROS抑制下游的Akt通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。魚藤素還增加了Bax 活性，同時(shí)導(dǎo)致Caspase-3和Caspase-9 裂解和Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)肺SCC 細(xì)胞凋亡。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制主要表現(xiàn)為Bax上調(diào)、Bcl-2下調(diào)和Caspase-3激活。

2.1.4 水飛薊賓水飛薊賓（Silybin）是一種來(lái)自水飛薊的類黃酮，具有多種藥理活性，包括對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的抗增殖和凋亡活性。水飛薊賓被鑒定為HSP90-C 末端抑制劑，能夠誘導(dǎo)幾種HSP90 依賴性客戶蛋白，比如HER2、Raf-1 和Akt，以濃度依賴性方式降解，而自身水平保持恒定［39］。用不同濃度的水飛薊賓處理HepG2 細(xì)胞，促凋亡蛋白p53、Bax、APAF-1 和Caspase-3 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的水平。

大量證據(jù)表明，線粒體與凋亡細(xì)胞死亡有關(guān)，線粒體去極化和Cytc釋放間存在直接關(guān)系，APAF-1是一種130 kD 的蛋白質(zhì)，在線粒體控制細(xì)胞凋亡中起核心作用。水飛薊賓治療可引起肝癌細(xì)胞中APAF-1的表達(dá)，并與釋放的形成Cytc的凋亡體相互作用，從而激活Caspase-3，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［40］。用不同濃度水飛薊賓處理MDA-MB-231 和MCF-7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，p-JNK 表達(dá)增加，p-ERK1/2 和p-P38表達(dá)降低。證實(shí)水飛薊賓誘導(dǎo)MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡與MAPK 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。Western blot 結(jié)果表明，MDA-MB-231 和MCF-7 細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)減少［41］。WANG Y X 等［42］研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素能有效誘導(dǎo)胃癌MGC803 細(xì)胞凋亡，使MGC803 細(xì)胞阻滯于G2/M 期，同時(shí)在蛋白和mRNA 水平上降低p-STAT3 及其下游靶基因Mcl-1、Bcl-xl、Survivin 的蛋白表達(dá)。此外，水飛薊賓還引起Caspase-3 和Caspase-9 蛋白及mRNA 水平的增加。水飛薊素還可通過(guò)下調(diào)CDK1、CyclinB1、Survivin、Bcl-xl、Mcl-1和激活Caspase-3、Caspase-9，通過(guò)STAT3 途徑誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡并引起細(xì)胞周期阻滯。

2.2 干擾HSP90輔助伴侶的天然藥物研究表明，HSP90 與其底物蛋白之間的相互作用還需要一些輔助伴侶分子（Co-chaperones）的參與，如HSP70、HOP、CDC37和P23等。這些蛋白激酶在細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)中都起著重要的作用，其中，CDC37 的作用是獨(dú)一無(wú)二的，它可以特異性地介導(dǎo)多種蛋白激酶與HSP90的結(jié)合。

2.2.1 芹菜素芹菜素（Apigenin）是一種廣泛存在于芹菜、洋蔥、蘋果、橘子等蔬菜水果中的黃酮類化合物，其在芹菜根中最為豐富。芹菜素具有多種生物學(xué)作用，如抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓等［43］。研究表明，芹菜素作用于原代多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞24 h后，能促進(jìn)HSP90/CDC37 的多個(gè)底物蛋白（Raf-1/Scr 和Cdk4）發(fā)生降解，伴隨HSP90 功能抑制，細(xì)胞內(nèi)Caspase-8 和Caspase-3 活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western blot 結(jié)果顯示，芹菜素可降低Mcl-1、Bcl-2、Bcl-XL、XIAP 和Survivin 等多種抗凋亡蛋白的表達(dá)，PARP 前體表現(xiàn)出類似的減少，伴隨著其裂解片段水平的增加，這些數(shù)據(jù)表明芹菜素可誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡［44］。芹菜素能夠?qū)η傲邢侔┘?xì)胞系、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系及原代骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的影響，如抑制細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常的外周血單個(gè)核細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響，提示芹菜素具有潛在的臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。

2.2.2 雷公藤紅素雷公藤紅素（Celastrol，CSL）又名南蛇藤素或南蛇藤醇，是從雷公藤根皮中提取出的一種三萜單體，具有抗炎、治療神經(jīng)性退化疾病等多種藥理活性，分子式C29H38O4。從結(jié)構(gòu)上看，其芳香酮基上的C2 和C6 有很強(qiáng)的親核活性，從而具有抗腫瘤、抗微生物、抗氧化、細(xì)胞毒性和抗瘧疾等作用［45］。雷公藤紅素是一種新型的HSP90 抑制劑，能抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cdk2/4/6、Cyclin D1（均為HSP90 客戶蛋白），同時(shí)，雷公藤紅素能抑制HSP90 的ATP 酶活性，破壞HSP90-Cdc37-Cdks 復(fù)合物，使Cdk4、Cdk6、Cdc37 從HSP90 復(fù)合體中解離［46］。

XU L N 等［47］發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、使細(xì)胞周期停滯在G2/M 期，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）積聚，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。LIU X H 等［48］證實(shí)了雷公藤紅素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用，闡明了其通過(guò)調(diào)節(jié)ROS/JNK 和Akt/mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在G2/M期阻滯、凋亡。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在雷公藤紅素的作用下，早期和晚期凋亡細(xì)胞均呈劑量依賴性增加；Western blot 檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的中樞信號(hào)蛋白的表達(dá)證明，雷公藤紅素能顯著提高PARP 和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 蛋白水平，且呈時(shí)間和劑量依賴性［48］。

3 結(jié)論與展望

近些年，HSP90 成為腫瘤分子靶向治療的新靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)幾種作用于HSP90 的天然藥物的探討，我們發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)不同的作用機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，既可以通過(guò)抑制信號(hào)通路的方式，也可以通過(guò)與HSP90 的輔助伴侶分子結(jié)合的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。天然藥物既可以單獨(dú)作用于癌細(xì)胞，也可以與其他化合物聯(lián)用，可能會(huì)引起更好的藥效。隨著對(duì)HSP90 生物活性的研究，其作用機(jī)制更加明確，肯定可以發(fā)現(xiàn)毒性較低、對(duì)癌癥患者的治療更為有益的天然藥物或化合物。