張文強 肖 航 熊少斌 李可可 胡君霞 許越淇 嚴(yán)詔琦 劉良徛

喉源性咳嗽是著名耳鼻喉專家干祖望所提出的以“咽癢作咳”為主要特征的陣發(fā)性痙攣咳嗽[1]。其臨床表現(xiàn)為咽癢即咳、少痰或無痰，遇寒冷空氣、刺激性氣味時加重[2]。近年來因為氣候和環(huán)境的改變，該病發(fā)病率逐漸上升[3]。西藥治療方案主要以抗生素和激素為主，不僅療效不佳，且易導(dǎo)致抗生素的耐藥，近年來的臨床報告顯示，中醫(yī)藥治療喉源性咳嗽效果顯著，且不良反應(yīng)小[4]。劉良徛教授常以銀翹馬勃散加減治療各類咳嗽，并取得良好的臨床療效[5]。黃明儒等[6]發(fā)現(xiàn)銀翹馬勃散聯(lián)合穴位貼敷治療喉源性咳嗽能夠有效緩解患者的癥狀，臨床療效顯著。但目前關(guān)于喉源性咳嗽的病因仍不十分明確，還未形成系統(tǒng)和規(guī)范的認(rèn)識[7]，同時，對藥物治療喉源性咳嗽的作用機制也鮮有挖掘。

銀翹馬勃散出自清代吳鞠通的《溫病條辨》，該方具有清熱、解毒、利咽、除濕的功效。該方組成為金銀花、連翹、馬勃、牛蒡子、射干。方中金銀花、連翹清熱解毒、輕宣散邪；牛蒡子疏散風(fēng)熱、解毒利咽散結(jié)；射干解毒、消痰、利咽；馬勃清肺利咽、止血。諸藥配伍使上焦郁熱得除，肺氣得宣，咳嗽得治?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究中，金銀花含有萜類化合物、黃酮類化合物等有效成分，具有消炎抗菌、降血脂、抗內(nèi)毒素、抗氧化等作用[8]。連翹含有連翹苷、連翹酯苷等有效成分，具有抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化等作用[9]。牛蒡子含有木脂素類、揮發(fā)油、脂肪油類、帖類等有效成分，具有抗菌、抗病毒、擴張血管、抗腫瘤、降血糖等作用[10]。射干含有鳶尾苷、射干醇等有效成分，具有抗炎、抗病原微生物、抗?jié)兊茸饔肹11]。馬勃含有甾體化合物、萜類化合物、酰胺類化合物等有效成分，具有抗炎、止咳、止血、抗腫瘤等作用[12]。這提示銀翹馬勃散治療喉源性咳嗽有確切的依據(jù)。但是中藥復(fù)方含有眾多化合物成分，并作用于多種細胞靶標(biāo)，故難以用常規(guī)方法分析其協(xié)同作用機制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘銀翹馬勃散的有效成分及靶點，分析藥物與疾病復(fù)雜和多層次的交互網(wǎng)絡(luò)，并進行可視化網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，進而闡明銀翹馬勃散治療喉源性咳嗽的潛在分子機制，為診療、新藥開發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分和潛在作用靶點的篩選和獲取以銀翹馬勃散中金銀花、連翹、牛蒡子、射干、馬勃五味中藥為關(guān)鍵詞，分別錄入TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php），并從中得到相關(guān)化學(xué)成分，將口服生物利用度（Oral Bioavailabili-ty，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，從而得到其活性成分，并以此挖掘其潛在作用靶點。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），將得到的作用靶點進行匹配，并進行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理，以便后續(xù)和疾病基因配對。

1.2 疾病靶點的獲取以“l(fā)aryngeal cough”為關(guān)鍵詞，在數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www.genecards.org/）中檢索，得到有關(guān)喉源性咳嗽的靶點信息。

1.3 藥物-疾病共同靶點的獲取分別將“1.1”中獲得的基因標(biāo)準(zhǔn)化靶點與“1.2”中獲得的喉源性咳嗽疾病的靶點，在Venny 2.1 平臺錄入，取其交集，并繪制韋恩圖，最終得到銀翹馬勃散與喉源性咳嗽的共同靶點及數(shù)量。

1.4 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將“1.3”中所得到的共同靶點與“1.1”中獲得的活性成分進行篩選匹配，將獲得的數(shù)據(jù)與共同靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點（node）代表藥物、成分和靶點；邊（edge）代表藥物、有效成分和靶點之間的相互作用關(guān)系。利用該軟件中的“Network Analyzer”功能進行數(shù)據(jù)分析并記錄，以便后續(xù)分析。

1.5 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點的獲取將“1.3”所獲得的共同靶點導(dǎo)入STRING 在線分析平臺（https：//www.string-db.org/），物種類別選擇“Homo sapiens”，并分析獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，根據(jù)Between值大小進行排序篩選，得到藥物治療疾病的核心靶點。

1.6 GO 富集分析、KEGG 通路富集分析將“1.5”得到的核心靶點導(dǎo)入Metascape 在線分析工具（https：//metascape.org/），并將物種類別設(shè)置為“H.sapiens（26）”，分別進行（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路、GO Molecular Functions、GO Biological Processes、GO Cellular Components 富集分析，將得到的數(shù)據(jù)按照Score分值進行篩選，選取符合條件的前10 條KEGG 通路、前13 條生物過程（Biological Processes，BP）、前7 條細胞組成（Cellular Component，CC）、前10 條 分 子 功 能（Molecular Function，MF），并進行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀翹馬勃散活性成分及靶點獲取通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，共檢索出活性成分76 個，其中金銀花23 個、連翹23個、牛蒡子8個、射干17個、馬勃5個。去除重復(fù)和無靶點對應(yīng)的成分后，一共得到33個活性成分；共獲取藥物有效成分潛在作用靶點215個。見表1。

表1 銀翹馬勃散活性成分

2.2 喉源性咳嗽基因靶點獲取通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫共獲得喉源性咳嗽相關(guān)基因靶點1399個。

2.3 藥物-疾病共同靶點獲取分別將篩選后的藥物和疾病基因靶點在Venny 2.1平臺錄入，取其交集，并繪制韋恩圖，最終得到共同基因靶點112 個。見圖1。

圖1 藥物-疾病共同靶點韋恩圖

2.4 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將藥物、活性成分、共同靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建三者網(wǎng)絡(luò)圖。其中黃色元素代表銀翹馬勃散的5 種藥物；棕色元素代表藥物和疾病112 個共同靶點；紫色元素代表銀翹馬勃散中22 種活性成分（11 種活性成分靶點和疾病靶點無交集，予以刪除），單個元素大小代表相互關(guān)系程度，越大說明該成分在銀翹馬勃散中發(fā)揮的作用越明顯。結(jié)果明顯發(fā)現(xiàn)銀翹馬勃散中的木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）、漢 黃 芩 素（wogonin）、柱 頭 甾 醇（Stigmasterol）代表值相對較大。其中，木犀草素見于金銀花、連翹、射干中；槲皮素見于金銀花、連翹中；山柰酚見于金銀花、連翹、牛蒡子中；β-谷甾醇見于金銀花、連翹、牛蒡子、馬勃中；β-胡蘿卜素見于金銀花、牛蒡子中；漢黃芩素見于連翹中；柱頭甾醇見于金銀花中。結(jié)果表明這些成分具有相互協(xié)同治療喉源性咳嗽的作用，同時也說明中藥復(fù)方是通過多成分、多靶點起到治療喉源性咳嗽的作用。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病相互作用圖

2.5 靶點基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將112 個共同基因錄入STRING 在線分析平臺，將物種設(shè)置為人類（Homosapiens），并分析得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點數(shù)112，邊數(shù)2151，平均節(jié)點度38.4，每條邊代表蛋白間的相互作用關(guān)系。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，根據(jù)Between值進行排序篩選，得到核心靶點分別為AKT1（蛋白激酶B）、TP53（腫瘤抑制基因）、TNF（腫瘤壞死因子）、ESR1（雌激素受體α）、MYC（原癌基因）、EGFR（表皮生長因子受體）、IL6（白介素6）、CAV1（小窩蛋白-1），預(yù)測在治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是這些核心靶點。見圖3、圖4。

圖3 銀翹馬勃散“成分-靶點”蛋白互作PPI圖

圖4 “成分-疾病”核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO 富集分析將上述得到的核心靶點錄入Metascape 平臺進行通路信號分析，并通過生物信息學(xué)平臺對結(jié)果進行可視化分析。共選取與研究有關(guān)的前13 條生物過程（Biological Processes，BP），如：血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生（vascular endothelial growth factor production）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄響應(yīng)缺氧的陽性調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter in response to hypoxia）、乳腺肺泡發(fā)育（mammary gland alveolus development）、陽性調(diào)節(jié)發(fā)熱（positive regulation of fever generation）、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性（regulation of nitric-oxide synthase activity）等；前7 條 細 胞 組 成（Cellular Component，CC），如：轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物（transcription repressor complex）、膜筏（membrane raft）、血小板α 粒腔（platelet alpha granule lumen）等；前10 條分子功能（Molecular Function，MF），如：一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、細胞因子受體 結(jié) 合（cytokine receptor binding）、ATP 酶 結(jié) 合（ATPase binding）、生長因子受體結(jié)合（growth factor receptor binding）等。見表2、圖5。

圖5 GO富集分析結(jié)果網(wǎng)絡(luò)圖

表2 銀翹馬勃散治療喉源性咳嗽的GO分析

2.7 KEGG 通路富集分析將上述核心靶點錄入Metascape 平臺進行通路信號分析，并通過生物信息學(xué)平臺對結(jié)果進行可視化分析。篩選出符合研究的前10 條關(guān)鍵通路：癌癥通路（Pathways in cancer）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、C 型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、RIG-I 樣受體信號通路（IRIG-I-like receptor signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、甲型流感（Influenza A）、神經(jīng)變性的途徑 - 多種疾?。≒athways of neurodegeneration -multiple diseases）、NOD 樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）。其中，與喉源性咳嗽相關(guān)的通路可能是C 型凝集素受體信號通路、TNF 信號通路、RIG-I樣受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、IL-17 信號通路等。見表3、圖6。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共篩選到銀翹馬勃散中藥物活性成分作用靶點215個，喉源性咳嗽相關(guān)基因靶點1399個，最終獲得疾病與藥物共同基因靶點112個。從藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖分析可知，該網(wǎng)絡(luò)圖一共有節(jié)點139個，邊362條，其中金銀花占12條，連翹9 條，射干5 條，牛蒡子4 條，馬勃2 條。金銀花的degree值位居首位，表明金銀花在該方治療喉源性咳嗽中占主導(dǎo)地位，連翹、射干次之；牛蒡子、馬勃起到輔佐作用。同時發(fā)現(xiàn)銀翹馬勃散中主要活性成分為：木犀草素、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、漢黃芩素、柱頭甾醇等。木犀草素是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗過敏和免疫增強功能，能減輕哮喘氣道炎癥和超敏反應(yīng)[13]。Pio C 等[14]發(fā)現(xiàn)木犀草素、IL-37和IL-38都是具有不同信號通路的抗炎分子，并認(rèn)為木犀草素與這些抗炎細胞因子聯(lián)合用于炎癥具有相關(guān)性。槲皮素是一種黃酮類化合物[15]，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎等作用[16]。Jingwen等[17]發(fā)現(xiàn)其可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮抗炎作用。山柰酚是一種黃酮醇類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗凋亡等活性，在正常情況下，能夠提高脾淋巴細胞活力，促進淋巴細胞增殖，加強機體的免疫應(yīng)答[18]。陳丹等[19]發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠有效減輕小鼠急慢性炎癥性疼痛，改善足底造模部位炎癥情況，減輕炎性因子的聚集情況，使造模后小鼠對機械刺激和熱刺激的敏感性降低。β-谷甾醇是一種具有天然生物活性的甾體化合物，具有抵抗細菌入侵、消炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤等作用[20]。賈菊芳等[21]發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能夠改善OVA 誘導(dǎo)的過敏性哮喘大鼠氣道炎癥和氧化損傷，其作用機制可能與β-谷甾醇對Th17/Treg 免疫失衡及氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)。β-胡蘿卜素是常見類胡蘿卜素之一，具有抗氧化、清除自由基、保護血管、抗腫瘤、增強免疫功能及保護神經(jīng)系統(tǒng)等作用[22]。漢黃芩素是一種天然黃酮類化合物，可通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt、p53、核因子κB （NF-κB）等多種細胞信號通路發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、抗病毒、神經(jīng)保護和抗焦慮作用[23]。柱頭甾醇可增強一氧化氮的產(chǎn)生，并作為潛在的抗氧化劑和增強免疫力的藥物發(fā)揮治療作用[24]。Opoku等[25]發(fā)現(xiàn)柱頭甾醇對卵蛋白誘導(dǎo)的氣道炎癥損傷具有明顯的抑制作用。此外，該方核心成分多為黃酮類化合物，如：槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等。這表明該類天然化合物在治療喉源性咳嗽中可能發(fā)揮主要作用。黃酮類化合物廣泛存在于中草藥中，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗血栓等常見的藥理活性和多靶標(biāo)協(xié)同的特點[26]。該類化合物對改善氣道重塑是否也具有明顯的藥理活性作用有待進一步研究。盧秋生等[27]從中藥復(fù)方中提取的天然黃酮類化合物在卷煙實驗中可降低煙氣對咽部的刺激。

銀翹馬勃散治療喉源性咳嗽核心靶點為AKT1、TP53、TNF、ESR1、MYC、EGFR、IL6（白介素6）、CAV1。Akt 有3 種亞型，分別是 Akt1、Akt2、Akt3，由3 個不同的基因進行編碼，這3種亞型具有高度的同源性，在多種組織中廣泛表達[28]。AKT1 可通過阻斷PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以抑制杯狀細胞增生引起的黏液高分泌，從而減少氣道高反應(yīng)，并阻止氣道結(jié)構(gòu)改變[29]。TNF-α 是一種細胞因子，是氣道炎癥產(chǎn)生的重要啟動因子之一[30]。TP53、TNF α 誘導(dǎo)氣道平滑肌產(chǎn)生力增強，并可介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣道炎性反應(yīng)加重，誘發(fā)高氣道反應(yīng)[31]。ESR1 是一種雌激素受體。程力等[32]發(fā)現(xiàn)雌激素可能通過氣道黏膜中的肥大細胞ESR1受體表達的變化參與女性患者哮喘發(fā)病的過程。C-MYC 是存在于正常細胞中能編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的一類基因，在支氣管上皮細胞和內(nèi)皮細胞均有部分表達，阻斷其表達則可控制患者氣道重塑的癥狀[33]。EGFR 是一種表皮生長因子受體，是氣道上皮細胞功能的調(diào)控者[34]。香煙可使氣道上皮杯狀細胞顯著增生，研究表明，可通過EGFR-酪氨酸激酶抑制劑來防止[35]。IL6是一種具有多種生物學(xué)功能的前炎癥因子，可出現(xiàn)在人氣道上皮細胞損傷和炎癥反應(yīng)時，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細胞的增殖分化等過程中均有重要的作用[36]。CAV1在氣道上皮細胞、內(nèi)皮細胞等結(jié)構(gòu)細胞中均有所表達，通過抑制CAV1 的表達可以降低LPS 誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌，這為治療慢性氣道炎癥性疾病提供了一個可能有現(xiàn)實意義的治療靶點[37]。高健等[38]發(fā)現(xiàn)CAV1與FOXM1可能通過互相影響，反向刺激，在氣道重塑和呼吸道炎癥中發(fā)揮重要作用。

GO富集分析主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄響應(yīng)缺氧的陽性調(diào)控、血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生、乳腺肺泡發(fā)育、陽性調(diào)節(jié)發(fā)熱、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性等生物過程；細胞組成如：轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物、膜筏、血小板α粒腔等；分子功能如：一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、細胞因子受體結(jié)合、ATP酶結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，銀翹馬勃散治療喉源性咳嗽的靶點主要在C 型凝集素受體信號通路、TNF 信號通路、RIG-Ⅰ樣受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路、IL-17 信號通路上富集。C 型凝集素受體主要在樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞表面表達，其可促進免疫細胞分泌 IL-6、TNF-α 等多種促炎細胞因子，并啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答[39]。TNF信號通路近年來研究顯示，腫瘤壞死因子-α（ TNF-α）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路異常激活與哮喘氣道黏液高分泌有密切的關(guān)系，通過抑制TNF-α/NF-κB 信號通路可緩解氣道黏液高分泌[40]。Toll 樣受體是一種固有免疫病原模式識別受體，激活其信號傳導(dǎo)通路會加重氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性，引起炎癥因子釋放[41]。內(nèi)源性和外源性配體激活Toll受體可以破壞“黏膜穩(wěn)態(tài)”狀態(tài)與“黏膜損傷”狀態(tài)之間的平衡，從而導(dǎo)致黏膜炎癥和屏障破壞[42]。NOD樣受體信號通路在宿主抵御感染的第一道防線中起著至關(guān)重要的作用，其配備識別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，可直接激活免疫細胞[43]。RIG-Ⅰ樣受體是細胞質(zhì)中的一類 RNA 解旋酶，屬于固有免疫的模式識別受體，其在Ⅰ型干擾素、促炎細胞因子產(chǎn)生等方面起到重要作用[44]。IL-17是一種促炎細胞因子，在機體的防御、組織修復(fù)、炎癥性疾病的發(fā)病和癌癥的過程中有著重要作用，其受體信號通路在炎癥和癌癥中對真菌和細菌以及病理條件下有正常保護作用[45]。IL-17A 可作用在氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞、氣道成纖維細胞上，并均有助于氣道重塑的發(fā)生[46]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘銀翹馬勃散治療喉源性咳嗽的潛在作用機制發(fā)現(xiàn)，銀翹馬勃散是通過多成分、多靶點、多通路參與治療喉源性咳嗽，這為臨床治療提供了更多研究基礎(chǔ)。