黃 璐，吳有斌，倪毅然，劉夢(mèng)媛，吳江鋒，4，張艷瓊

三峽大學(xué) 1腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 3器官纖維化與靶向治療研究所，湖北宜昌 443002 三峽大學(xué)人民醫(yī)院 4器官纖維化與靶向治療研究所 5病理科，湖北宜昌 443099 6宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北宜昌 443000

肝纖維化是一種由多種病因引起的肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織過度沉積的病理狀態(tài)，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間過程和必然階段。目前，肝活檢雖作為評(píng)價(jià)肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但有創(chuàng)性、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用，因此，尋找靈敏度及特異度高的肝纖維化無創(chuàng)生物標(biāo)志物成為目前研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有研究表明，在細(xì)胞內(nèi)合成并加工的成熟體微RNA(microRNAs，miRNAs)可分泌并穩(wěn)定存在于血清中，且多種miRNAs可通過調(diào)節(jié)肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，干預(yù)肝纖維化發(fā)展進(jìn)程[1]。本文就miRNAs在肝纖維化中的作用機(jī)制作一綜述，以期為肝纖維化的診斷及分子靶向治療提供借鑒。

1 miRNAs

miRNAs是一類天然的、進(jìn)化保守的、短鏈非編碼微RNA(約19～23個(gè)核苷酸)，其在細(xì)胞增殖、代謝、分化、周期調(diào)控和凋亡等多種生理及病理過程中發(fā)揮重要作用[2]，此外，miRNAs也是豐富的基因表達(dá)調(diào)控元件，在動(dòng)物基因組中，miRNAs的編碼基因約占1%～5%，調(diào)控著20%～30%的基因表達(dá)[3]。

miRNAs能夠在細(xì)胞核內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)中合成。在細(xì)胞核內(nèi)，miRNAs通過RNA聚合酶Ⅱ被轉(zhuǎn)錄為pri-miRNAs的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，再由RNase Ⅲ酶(Drosha)和雙鏈RNA結(jié)合蛋白(Pasha/DGCR8)組成的復(fù)合物直接作用，產(chǎn)生前體miRNAs(pre-miRNAs)，或直接切割為成熟miRNAs的3′端(miRNAs-3p)。pre-miRNAs經(jīng)核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin 5(Exp5)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在核糖核酸酶(Dicer)和反應(yīng)性RNA結(jié)合蛋白2(trans-activation-responsive RNA-Binding Protein 2，TARBP2)的作用下，先切割為雙鏈miRNAs，后加工為成熟miRNAs(miRNAs-5p和miRNAs-3p)。成熟miRNAs能夠與AGO2蛋白結(jié)合，形成沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，進(jìn)而介導(dǎo)miRNAs表達(dá)和RNA干擾導(dǎo)致的基因沉默[7-8]。

2 抑制肝纖維化的miRNAs

2.1 miR-23/27/24

miR-23/27/24由miR-23a/27a/24-2和miR-23b/27b/24-1組成，分別由人體19p13.12和9q22.32染色體上的基因編碼。Li 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-23b通過靶向下調(diào)酰基輔酶A硫酯酶4(acyl-coA thioesterase 4，Acot4)表達(dá)，抑制乙酰輔酶A降解，減少游離脂肪酸，從而改善非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)引起的肝纖維化，而miR-24通過靶向下調(diào)Menin蛋白表達(dá)，減弱轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β的促肝纖維化信號(hào)；在膽管上皮細(xì)胞系和硬化性膽管炎小鼠模型中，miR-24通過下調(diào)Menin、COL1A1和TGF-β1等促肝纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制肝纖維化進(jìn)展，抑制miR-24則會(huì)加重肝纖維化。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，miR-23b下調(diào)TGF-β2表達(dá)、miR-27b下調(diào)整合素亞基α2和α5(integrin subunit alpha 2/5，Itgα2/5)表達(dá)、而miR-23b及miR-27b下調(diào)Gremlin1表達(dá)、miR-27b及miR-24-1下調(diào)酪氨酸氧化酶(lysyl oxidase，LOX)表達(dá)，均可抑制 TGF-β 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化，而HSCs的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，該機(jī)制在miR-23b/27b/24-1改善四氯化碳(CCl4)導(dǎo)致的肝纖維化小鼠模型中得到驗(yàn)證，因此，miR-23/27/24可能成為肝纖維化治療的新靶點(diǎn)。然而，在慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者的血清中，miR-23b的水平與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)呈負(fù)相關(guān)[10]。因此，血清中的miR-23b/27b/24-1是否可用來評(píng)估肝細(xì)胞損傷、HSCs活化和肝纖維化程度，尚需進(jìn)一步研究。

2.2 miR-29

miR-29家族由miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2和miR-29c組成，miR-29a/b-1由人體7q32.3染色體上的基因編碼，miR-29c/b-2由人體1q32.2染色體上的基因編碼[11]。miR-29在HSCs中高表達(dá)，但在肝纖維化患者及動(dòng)物模型中表達(dá)量降低[12]。Yu等[13]研究表明，在促纖維化信號(hào)TGF-β 和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)-BB刺激HSCs活化的過程中，細(xì)胞自噬作用增強(qiáng)，促進(jìn)了胞質(zhì)內(nèi)miR-29a/b/c以微泡內(nèi)容物形式排出，miR-29a/b/c減少，抗纖維化作用減弱，在CHC患者及CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，血清miR-29a/b/c表達(dá)水平升高，且與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，miR-29a/b/c可抑制HSCs表達(dá)COL1A1，COL4A5 和 COL5A3等膠原纖維，減輕TAA和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化程度[14]，提示miR-29可作為肝纖維化的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

2.3 miR-122

miR-122由人體18q21.31染色體上的基因編碼，是小鼠及人肝臟組織中表達(dá)最豐富的miRNAs，分別占比70%和52%，而在其他組織中的表達(dá)水平極低[15]。miR-122在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用，研究表明，敲除miR-122基因或注射miR-122拮抗劑會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)[16-17]。miR-122在HSCs中通過下調(diào)促肝纖維化的脯氨酰4-羥化酶亞基α-1(prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-1，P4HA-1)及纖連蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)表達(dá)，使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)發(fā)生降解[18-19]。最新研究報(bào)道，miR-122可通過下調(diào)非受體酪氨酸激酶Abelson超家族成員c-Abl表達(dá)，抑制HSCs活化[20]。鑒于miR-122可在肝臟中特異性表達(dá)以及通過多靶點(diǎn)抑制HSCs活化和肝纖維化，目前已成為治療肝纖維化的研究熱點(diǎn)。一項(xiàng)針對(duì)CHC患者的研究顯示，在診斷早期肝纖維化方面，與AST/血小板比值(AST/platelet ratio index，APRI)、FIB-4指數(shù)、Forns纖維化指數(shù)等肝纖維化血清學(xué)診斷相比，血清中升高的miR-122更具優(yōu)勢(shì)[21]；通過注射過表達(dá)miR-122的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及其分泌物，肝纖維化程度得以緩解[22-23]。

3 促進(jìn)肝纖維化的miRNAs

3.1 miR-34

miR-34由miR-34a、miR-34b和miR-34c組成，miR-34a由人體1p36.22染色體上的基因編碼，而miR-34b/c的編碼基因位于11q23.1染色體上。miR-34a可通過抑制乙酰基輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員1(acyl-CoA synthetase long-chain family member 1，ACSL1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxi-some proliferative activated receptor γ，PPARγ)、去乙?；?(sirtuin 1，SIRT1)及TGF-β誘導(dǎo)因子同源異構(gòu)體2(TGF-β induced factor homeobox 2，TGIF2)等多個(gè)靶點(diǎn)促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。

靜息HSCs的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量富含維生素A的脂肪滴(貯脂細(xì)胞)，ACSL1可促進(jìn)脂質(zhì)生成并在HSCs內(nèi)貯存，進(jìn)而維持HSCs的靜息狀態(tài)，抑制HSCs活化。然而，過表達(dá)的miR-34a 下調(diào)ACSL1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ECM的分泌，活化HSCs[24]。PPARγ在靜息HSCs中表達(dá)豐富，其與核內(nèi)受體結(jié)合后，能夠抑制HSCs增殖并誘導(dǎo)HSCs凋亡[25]。SIRT1可使p53去乙酰化，阻止其與Smad3形成復(fù)合物，抑制TGF-β信號(hào)通路中促肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制HSCs活化和肝纖維化。SIRT1激活劑白藜蘆醇及其類似物紫檀芪通過解除miR-34a對(duì)SIRT1的抑制作用，在多種肝纖維化模型中顯示出良好的抗纖維化效果。TGIF2既可抑制Smad2/3磷酸化，也可抑制TGF-β-Smad2/3信號(hào)靶基因的表達(dá)。研究表明，在肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中，miR-34a可通過下調(diào)TGIF2，促進(jìn)TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路發(fā)揮促肝纖維化作用[26-27]。

CHC患者血清中miR-34a的表達(dá)量與肝纖維化程度呈正相關(guān)，與生存率呈負(fù)相關(guān)，且miR-34a抑制劑已在多種動(dòng)物模型中證實(shí)能夠改善肝纖維化[26，28]。一項(xiàng)針對(duì)脂質(zhì)體miR-34a 類似物的研究顯示其可抑制肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展[29]。因此，miR-34a有望作為CHC、原發(fā)性膽汁性膽管炎和NASH等多種肝臟疾病的無創(chuàng)性肝纖維化生物標(biāo)志物及抗肝纖維化藥物應(yīng)用于臨床。

3.2 miR-199

miR-199由miR-199a1、miR-199a2和miR-199b組成，其編碼基因分別位于人體19p13.2、1q24.3和9q34.11染色體上。其中，miR-199a2經(jīng)剪切形成的miR-199a-5p和miR-199a-3p在多種肝纖維化模型及HCC伴肝纖維化患者的血清中表達(dá)上調(diào)，且與纖維化程度呈正相關(guān)[30-31]。小窩蛋白1(caveolin-1，CAV1)可通過介導(dǎo)胞吞作用，內(nèi)化TGF-β受體和抑制Smad2磷酸化而抑制TGF-β信號(hào)通路，進(jìn)而抑制HSCs活化及肝纖維化[32]。CAV2可與CAV1共表達(dá)形成復(fù)合物共同發(fā)揮作用，miR-199a-5p能夠通過種子序列“CCAGUGU”靶向抑制CAV1。研究表明，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p類似物可顯著下調(diào)CAV1表達(dá)，并促進(jìn)HSCs活化[30]；同時(shí)，miR-199a-3p可通過種子序列“CAGUAGU”抑制CAV2表達(dá)，miR-199a-3p拮抗劑能夠顯著減輕CCL4模型小鼠肝纖維化程度[33]。

3.3 miR-221/222

miR-221/222由人體Xp11.3染色體上的基因編碼。miR-221與miR-222的表達(dá)產(chǎn)物具有相同的種子序列“GCUACAU”，高度相似的作用靶點(diǎn)和生物學(xué)效應(yīng)。miR-221/222在HCC合并肝硬化、由HCC和NASH引起的肝纖維化患者肝組織中表達(dá)上調(diào)[34-35]。與靜息HSCs相比，活化的HSCs中miR-221/222水平顯著升高。研究證實(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-222前體不僅能夠顯著上調(diào)人HSCs細(xì)胞系(LX-2)中COL1A1膠原纖維的mRNA水平，同時(shí)也可下調(diào)抗肝纖維化基因基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1和MMP-9的表達(dá)[35]。通過分析啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，miR-221/222受核因子κB 及c-Jun促肝纖維化轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[36]。

研究表明，miR-221/222可通過轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)多個(gè)抗肝纖維化基因表達(dá)，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN)1B/C作為miR-221/222的靶點(diǎn)，具有抑制HSCs增殖，進(jìn)而抑制肝纖維化的作用[35]。細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)1作為miR-221/222的靶點(diǎn)，可抑制促肝纖維化因子CCL2表達(dá)。研究表明，在肝細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中敲除SOCS1可減輕CCl4模型小鼠肝纖維化程度[37-38]；組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP)3作為miR-221/222的靶點(diǎn)，可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，抑制ECM降解，從而促進(jìn)肝纖維化[39]；此外，受miR-221/222靶向負(fù)調(diào)控的促肝纖維化基因還包括PTEN和E-cadherin[40]等。

4 雙向調(diào)節(jié)肝纖維化的miRNAs

miR-155的編碼基因位于人體21q21.3染色體上，其表達(dá)產(chǎn)物種子序列為“UAAUGCU”。miR-155在巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)水平較高，在其他肝細(xì)胞類型中表達(dá)程度有限，但其對(duì)于肝纖維化仍發(fā)揮重要的調(diào)控作用，且與肝臟原發(fā)病類型、作用靶點(diǎn)和細(xì)胞類型密切相關(guān)。例如，miR-155靶向參與調(diào)控Treg細(xì)胞分化中含SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇5-磷酸酶(SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase，SHIP1)。在由刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)介導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠模型中，敲除miR-155可顯著減少輔助T淋巴細(xì)胞向肝臟募集及產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而加重肝損傷及肝纖維化[41]。相反，在酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化小鼠模型中，巨噬細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)而下調(diào)PPARα促進(jìn)肝纖維化，而敲除miR-155則可顯著減輕模型小鼠肝纖維化程度[42]及改善由高脂高糖飲食所引起的肝纖維化[43]。血管緊張素受體(angiotensin type receptor，AGTR)1和T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)4均為miR-155的作用靶點(diǎn)，AGTR1通過胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(extracellular signal-regulated kinase 1，ELK1)信號(hào)通路促進(jìn)HSCs活化，而TCF4促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesen-chymal transition，EMT)及HSCs活化，HSCs經(jīng)TGF-β1刺激活化后，miR-155表達(dá)水平降低，而過表達(dá)miR-155作用于TCF4和AGTR1抑制HSCs的活化，并誘導(dǎo)HSCs凋亡[44]。由于miR-155在不同病因引起的肝纖維化中的作用機(jī)制不同，miR-155能否成為治療肝纖維化的靶點(diǎn)仍有待研究，但已有研究報(bào)道，miR-155血清水平與肝硬化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示其可能是潛在的肝纖維化血清診斷標(biāo)志物[45]。

上述肝纖維化相關(guān)miRNAs的染色體定位、種子序列、作用靶點(diǎn)、效應(yīng)細(xì)胞類型、相關(guān)疾病(模型)、表達(dá)水平等見圖1、表1。

表1 肝纖維化相關(guān)miRNAs

圖1 肝纖維化相關(guān)miRNAs作用靶點(diǎn)

5 小結(jié)與展望

據(jù)國(guó)內(nèi)最新指南報(bào)道，2019年我國(guó)慢性乙型肝炎患者人數(shù)為(2000～3000)萬，由慢性乙型肝炎發(fā)展為肝硬化的年發(fā)生率為2%～10%。盡管由慢性肝炎等引起肝纖維化嚴(yán)重危害人類生命健康，但臨床上肝纖維化的治療策略仍以治療原發(fā)病為主，保肝護(hù)肝為輔，缺乏特異性干預(yù)肝纖維化進(jìn)程的藥物[52]。

目前，使用miRNAs治療肝纖維化的研究均處于臨床前研究階段，仍無基于miRNAs或其拮抗序列的核酸藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，且診斷與評(píng)估肝纖維化的主要手段仍為肝活檢[53]。此外，也包括血清生物標(biāo)志物的測(cè)定、瞬時(shí)彈性成像和磁共振成像等無創(chuàng)性診斷方法[54]。研究顯示，血清miRNAs可用于無創(chuàng)診斷肝纖維化，或評(píng)估肝纖維化分級(jí)、分期和預(yù)后，多種肝纖維化模型和患者血清miR-29、miR-122、miR-34、miR-199和miR-155水平均上調(diào)，且與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示miRNAs可作為肝纖維化無創(chuàng)性血清標(biāo)志物。

根據(jù)肝纖維化過程中miRNAs的調(diào)節(jié)機(jī)制，可將基于miRNAs的核酸類藥物分為兩類：miRNAs抑制劑(miRNAs互補(bǔ)核酸序列)和miRNAs補(bǔ)充劑(miRNAs類似物)，但血清穩(wěn)定性不足、穿膜效率低及缺乏細(xì)胞靶向性限制了該類藥物的臨床應(yīng)用。隨著核酸類藥物結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)的發(fā)展，核酸藥物的血清穩(wěn)定性極大提升，如采用-F、-NH2或-OMe取代核糖2′位的-OH及磷酸骨架的硫代化修飾等[55]。此外，mRNA遞送載體脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticle，LNP)的應(yīng)用，為miRNAs在血清中的穩(wěn)定運(yùn)輸提供了條件。隨著細(xì)胞膜靶標(biāo)的深入研究，各種靶向遞送技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如將核酸藥物與N-乙酰半乳糖胺偶聯(lián)，通過唾液酸糖蛋白受體可將miRNAs靶向遞送至肝細(xì)胞內(nèi)[56]。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與HSCs的活化及肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的去窗孔化密切相關(guān)。目前筆者正在針對(duì)這兩類細(xì)胞進(jìn)行核酸適配體的相關(guān)研究，擬靶向遞送miRNAs，并提高其穿膜效率，通過遞送工具將miRNAs遞送至細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核后發(fā)揮作用，其中涉及miRNAs與遞送工具的切割分離，可根據(jù)miRNAs在體內(nèi)合成的相關(guān)特征進(jìn)行設(shè)計(jì)達(dá)到分離載體和外援miRNAs的作用，以期為肝纖維化的分子靶向治療提供新的策略。