余婭婭，朱燕娟，3，4，肖真真，馬長(zhǎng)菊，丁麗娜，雷塵靜，劉譯鴻，常雪松，陳亞棟，張海波，3，4，6（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 10120；2.廣東省中醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 10120；3.廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 10120；4.粵港澳中醫(yī)藥與免疫疾病研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 10120；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 10120；6.省部共建中醫(yī)濕證國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 10120）

肺癌是發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤之一[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是最主要的肺癌類型，占全部肺癌的80%。以吉非替尼為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是治療晚期EGFR 敏感突變NSCLC 的一線藥物。然而，20%～30% EGFR 敏感突變的NSCLC 患者因?yàn)榇嬖谠l(fā)耐藥而缺乏有效治療，且所有初治有效的患者也會(huì)在用藥10 個(gè)月左右發(fā)生獲得性耐藥，使得EGFR-TKIs 的臨床獲益受限[2]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）通路異常活化是除EGFR T790M突變之外，最常見(jiàn)的EGFR-TKIs 耐藥機(jī)制之一[3]。PTEN 缺失、PIK3CA 突變、MET 和ErbB2 擴(kuò)增等都是EGFR-TKIs耐藥的重要機(jī)制，均能促進(jìn)PI3K/AKT 通路的異?；罨痆4]。目前，PI3K/AKT通路異?；罨閷?dǎo)的EGFRTKIs耐藥尚缺乏有效的臨床治療方法[5]。因此，尋找能有效逆轉(zhuǎn)PI3K 通路異?；罨瘜?dǎo)致肺癌EGFR-TKIs耐藥的新方法具有重要的臨床意義。

中藥聯(lián)合EGFR-TKIs 應(yīng)用廣泛，然而并非所有中藥都適合與EGFR-TKIs 聯(lián)合使用。有研究[6]顯示，高麗參甚至?xí)铀貼SCLC 患者的EGFR-TKIs 耐藥。中藥與EGFR-TKIs 聯(lián)合需在中醫(yī)“理—法—方—藥”診療原則的指導(dǎo)下應(yīng)用。本課題組前期臨床觀察[7]數(shù)據(jù)顯示，EGFR 突變的NSCLC 患者初診時(shí)以寒證居多，EGFR-TKIs 治療后會(huì)發(fā)生由寒轉(zhuǎn)熱的證候改變，而發(fā)生耐藥時(shí)則以熱證為主。結(jié)合EGFRTKIs 治療后患者出現(xiàn)痤瘡樣皮疹、舌紅、口干、尿黃等“熱證”變化，提示EGFR-TKIs 具有類似中藥的“溫陽(yáng)”作用。本課題組前期研究[8]顯示，熱毒證與PIK3CA突變密切相關(guān)，是EGFR-TKIs治療的不良預(yù)后因素。PIK3CA 會(huì)導(dǎo)致PI3K 異常激活，在PI3K異?；罨閷?dǎo)的耐藥NSCLC 中，明確EGFR-TKIs 應(yīng)與哪類中藥聯(lián)合使用具有重要意義。

知母具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥的功效，以及抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等藥理作用[9]。干姜具有溫中散寒、回陽(yáng)通脈、溫肺化飲的功效，以及抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[10]。知母、干姜均是臨床抗癌治療的常用中藥。故本研究擬以知母、干姜分別作為清熱和溫陽(yáng)治則的代表中藥，聯(lián)合RGFR-TKIs 代表藥物吉非替尼，探索寒、熱不同藥性中藥對(duì)PI3K/AKT通路異常激活介導(dǎo)的耐藥肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝的影響。

腫瘤細(xì)胞的生存、增殖和分化依賴于與特定細(xì)胞外基質(zhì)成分的相互作用，細(xì)胞外基質(zhì)的作用在二維（2D）單層細(xì)胞培養(yǎng)中不能很好再現(xiàn)，而三維（3D）球體模型概括了體內(nèi)形態(tài)如細(xì)胞極化、細(xì)胞層組織、與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，更能反映體內(nèi)真實(shí)情況[12]。因此，本研究將選擇前期已成功構(gòu)建的PC-9-PIK3CA-Mutation（PC-9-PIK3CA-M，EGFR 19 外顯子突變合并PIK3CA 突變）-3D 細(xì)胞[11]和H1650（EGFR突變合并PTEN 缺失）-3D 細(xì)胞作為吉非替尼耐藥模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人非小細(xì)胞肺癌PC-9 細(xì)胞，由中山大學(xué)（廣州）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)提供；H1650 細(xì)胞株（貨號(hào)：CC0211），購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司。PC-9-PIK3CA-M 細(xì)胞培養(yǎng)：由本課題組通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式將PIK3CA E545K 突變基因轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞（EGFR 19 外顯子突變）構(gòu)建，細(xì)胞的吉非替尼耐藥性已得到了證實(shí)[11]。

1.2 藥物及試劑吉非替尼（批號(hào)：S1025），美國(guó)Selleck 公司；知母（批號(hào)：2008001）、干姜（批號(hào)2011001），佛山嶺南中藥飲片有限公司。DMEM/F12培養(yǎng)基（批號(hào)：2323289）、B27（批號(hào)：2301953）、0.25%胰酶（批號(hào)：2169109），美國(guó)Gibco 公司；表皮生長(zhǎng)因子（EGF，批號(hào)：1021AFC05）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，批號(hào)：0216571），美國(guó)PeproTech 公司；基質(zhì)膠（批號(hào)：0343001）、Cell Recovery Solution（批號(hào)：2161003），美國(guó)Corning 公司；嘌呤霉素（批號(hào)：QR12583），美國(guó)Mpbio 公司；Y-27632（批號(hào)：M1817-19），美國(guó)AbMole 公司；CellTiter- Glo?3D Cell Viability Assay（ 批號(hào)：0000514473），美國(guó)Promega公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒（批號(hào)：1271578），美國(guó)BD 公司；HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper，批號(hào)：7E581K1）、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（批號(hào)：027E2201CD），南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Mitochondrion Staining Kit（線粒體染色試劑，批號(hào)：239098）、Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit（熒光法胞內(nèi)總ROS檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：292084）、Fluorimetric Mitochondrial Superoxide Activity Assay Kit（熒光法線粒體超氧化物活性檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：2781782），美國(guó)AAT Bioquest公司。

1.3 主要儀器FreeZone 型真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO 公司；IC1000 型Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國(guó)Inno-Alliance Biotech公司；ECLIPSE Ti2-E型全自動(dòng)倒置顯微鏡，日本尼康公司；SYNERGY H1型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；Quanteon流式細(xì)胞分析儀，美國(guó)ACEA 公司；LSM710 型激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)蔡司公司。

1.4 中藥凍干粉制備分別取中藥知母、干姜105 g，各加入1 050 mL 純水浸泡30 min；煎煮至沸騰后轉(zhuǎn)文火煎煮45 min，收集藥液；再加入500 mL 純凈水，煎煮沸騰后轉(zhuǎn)文火煎煮45 min；合并2 次煎液，紗布過(guò)濾后濃縮至約100 mL；濃縮液在-80 ℃冰箱中冷凍過(guò)夜后，置于真空干燥儀中干燥；收集凍干粉并稱質(zhì)量，每42.4 mg 知母凍干粉含生藥1 g，每76.85 mg 干姜凍干粉含生藥1 g。用RPMI-1640 培養(yǎng)基配制濃度為100 mg·mL-1的中藥凍干粉母液，以0.22 μm針頭濾器過(guò)濾除菌，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞3D 培養(yǎng)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-9-PIK3CA-M 和H1650 細(xì)胞消化重懸后，按照細(xì)胞懸液∶基質(zhì)膠=1∶1的比例混合均勻；根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)方案配制不同細(xì)胞濃度和體積的膠滴，于37 ℃下將培養(yǎng)箱倒置30 min；待基質(zhì)膠固化后，加入3D 細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F12、20 ng·mL-1EGF、10 ng·mL-1bFGF、5 μmol·L-1Y-27632、1× B27）；在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，每2～3 d 更換1 次培養(yǎng)基。PC-9-PIK3CA-M 細(xì)胞用2.5 μg·mL-1嘌呤霉素維持培養(yǎng)。每天對(duì)3D 細(xì)胞進(jìn)行觀察，并分別在培養(yǎng)第4、5、7 天對(duì)NSCLC-3D細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.6 細(xì)胞分組NSCLC-3D 細(xì)胞直徑長(zhǎng)到50～100 μm后進(jìn)行分組：對(duì)照組、知母組、干姜組、吉非替尼組、吉非替尼+知母組、吉非替尼+干姜組。采用ATP 法檢測(cè)3D-細(xì)胞活性后，選擇吉非替尼和知母（或干姜）聯(lián)用的最佳聯(lián)合效應(yīng)濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 ATP 法檢測(cè)細(xì)胞活性（1）以每10 μL 基質(zhì)膠5×103個(gè)細(xì)胞的密度將PC-9-PIK3CA-M、H1650細(xì)胞鋪于384 孔板孔底；培養(yǎng)7 d 后給藥，分別給予0、10、20、40、80 μmol·L-1濃度的吉非替尼處理3D 細(xì)胞；24 h 后棄去培養(yǎng)基，用DMEM/F12 與CellTiter-Glo?3D細(xì)胞活性檢測(cè)試劑按1∶1比例配制ATP反應(yīng)液，每孔加入50 μL ATP反應(yīng)液，室溫下孵育30 min后，采用多功能酶標(biāo)儀讀取化學(xué)發(fā)光值；根據(jù)化學(xué)發(fā)光值計(jì)算：細(xì)胞活率（%）=實(shí)驗(yàn)組化學(xué)發(fā)光值/對(duì)照組化學(xué)發(fā)光值×100%；最后，計(jì)算出吉非替尼的IC50值。（2）分別按照“1.6”項(xiàng)下分組處理細(xì)胞，吉非替尼濃度選擇IC50值（或IC50值附近）濃度進(jìn)行干預(yù)，知母、干姜分別給予800、1 600、3 200、6 400 μg·mL-1濃度進(jìn)行干預(yù)；采用ATP 法檢測(cè)細(xì)胞活率，操作方法同前。

1.8 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況以每50 μL 基質(zhì)膠2.5×104個(gè)細(xì)胞的密度將PC-9-PIK3CA-M、H1650 細(xì)胞接種于24 孔板中；培養(yǎng)7 d后給藥，按照“1.6”項(xiàng)下分組進(jìn)行藥物干預(yù)；培養(yǎng)24 h 后棄上清，用Cell Recovery Solution 溶解基質(zhì)膠，收集3D 細(xì)胞團(tuán)；以不含EDTA 的胰酶將細(xì)胞團(tuán)消化成單細(xì)胞懸液后，用完全培養(yǎng)基終止消化；以1 000 r·min-1（離心半徑=16 cm）離心10 min，棄上清；PBS 清洗1 次后，重懸于300 μL Binding Buffer；每孔加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫下避光孵育15 min；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率（%，早期凋亡率+晚期凋亡率）。

1.9 ROS 熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞ROS 水平以每20 μL基質(zhì)膠1×104個(gè)細(xì)胞的密度將PC-9-PIK3CA-M、H1650 細(xì)胞接種于共聚焦8 孔細(xì)胞板中；培養(yǎng)7 d后，按照“1.6”項(xiàng)下分組進(jìn)行給藥干預(yù)；24 h 后棄上清，加入提前配制好的1×檢測(cè)混合液，每孔200 μL，室溫下避光孵育2 h；采用激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的FITC、TRITC、Cy5熒光通道拍照。其中以MitoliteTMDeep Red FX660 標(biāo)記線粒體、ROS BriteTM570 標(biāo)記胞內(nèi)ROS、MitoROSTM520 標(biāo)記線粒體超氧化物。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Q值法計(jì)算藥物之間的聯(lián)合效應(yīng)，當(dāng)Q＜1，表示藥物之間有拮抗作用；當(dāng)Q＝1，表示兩種藥物有相加作用；當(dāng)Q＞1，表示藥物之間有協(xié)同作用。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC-3D 細(xì)胞形成結(jié)果見(jiàn)圖1。分別在培養(yǎng)第4、5、7 天對(duì)NSCLC-3D 細(xì)胞進(jìn)行拍照，第7 天PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 細(xì)胞團(tuán)直徑長(zhǎng)至50～100 μm，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PC-9-PI3CA-M-3D 與H1650-3D 細(xì)胞形成Figure 1 Morphology of PC-9-PI3CA-M-3D and H1650-3D cells

2.2 吉非替尼聯(lián)合中藥（知母或干姜）對(duì)NSCLC-3D細(xì)胞活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。在PC-9-PIK3CA-M-3D和H1650-3D細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，10～80 μmol·L-1吉非替尼能顯著抑制細(xì)胞活力（P＜0.01）。PC-9-PIK3CA-M-3D細(xì)胞的吉非替尼IC50值為21.26 μmol·L-1，H1650-3D 細(xì)胞的吉非替尼IC50值為23.33 μmol·L-1，均在20 μmol·L-1左右，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇20 μmol·L-1吉非替尼分別與知母或干姜聯(lián)合使用。

圖2 吉非替尼聯(lián)合中藥對(duì)PC-9-PIK3CA-M-3D、H1650-3D 細(xì)胞活性的影響（±s，n=3）Figure 2 Effects of Gefitinib combined with Chinese medicinals on the cell viability of PC-9-PIK3CA-M-3D and H1650-3D cells（±s，n=3）

在PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 細(xì)胞中，與吉非替尼組比較，吉非替尼+知母能顯著抑制細(xì)胞活力（P＜0.01），且吉非替尼聯(lián)合知母的Q值均在1 以上，即知母與吉非替尼有協(xié)同作用，當(dāng)知母的濃度為3 200 μg·mL-1時(shí)，二者的協(xié)同效用最大。

在PC-9-PIK3CA-M-3D 細(xì)胞中，與吉非替尼組比較，吉非替尼+干姜能顯著促進(jìn)細(xì)胞活力（P＜0.05），當(dāng)干姜濃度≤3 200 μg·mL-1，吉非替尼聯(lián)合干姜的Q值均在1以下，即干姜與吉非替尼有拮抗作用，當(dāng)干姜的濃度為3 200 μg·mL-1時(shí)，二者的拮抗作用最明顯。

在H1650-3D細(xì)胞中，與吉非替尼組比較，吉非替尼+干姜能顯著促進(jìn)細(xì)胞活力（P＜0.01），吉非替尼聯(lián)合干姜的Q值均在1以下，即干姜與吉非替尼有拮抗作用，且當(dāng)干姜的濃度為3 200 μg·mL-1時(shí)，二者的拮抗作用最明顯。

結(jié)果表明，知母能協(xié)同促進(jìn)吉非替尼的抗腫瘤作用，而干姜?jiǎng)t拮抗吉非替尼的抗腫瘤作用。當(dāng)中藥凍干粉濃度為3 200 μg·mL-1，吉非替尼濃度為20 μmol·L-1時(shí)，協(xié)同或拮抗作用最明顯，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 吉非替尼聯(lián)合中藥（知母或干姜）對(duì)NSCLC-3D細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。在PC-9-PIK3CA-M-3D細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，吉非替尼對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響（P＞0.05），吉非替尼+知母能顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.01），而吉非替尼+干姜能顯著抑制細(xì)胞凋亡（P＜0.05）；與吉非替尼組比較，吉非替尼+知母能顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。

圖3 吉非替尼聯(lián)合中藥對(duì)PC-9-PIK3CA-M-3D、H1650-3D 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Figure 3 Effects of Gefitinib combined with Chinese medicinals on the cell apoptosis of PC-9-PIK3CA-M-3D and H1650-3D cells（±s，n=3）

在H1650-3D細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，吉非替尼和吉非替尼+干姜對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響（P＞0.05），吉非替尼+知母可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.01）；與吉非替尼組比較，吉非替尼+知母可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。

結(jié)果表明，在3D 細(xì)胞培養(yǎng)條件下，吉非替尼對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用并不顯著，而知母聯(lián)合吉非替尼能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。干姜在兩株細(xì)胞中則有不同表現(xiàn)，在PC-9-PIK3CA-M-3D 細(xì)胞中，干姜聯(lián)合吉非替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出抑制凋亡作用，而在H1650-3D細(xì)胞中，干姜聯(lián)合吉非替尼對(duì)凋亡的作用不明顯。

2.4 吉非替尼聯(lián)合中藥對(duì)NSCLC-3D 細(xì)胞ROS 水平的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。在PC-9-PIK3CA-M-3D 細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，吉非替尼組細(xì)胞線粒體ROS 水平明顯降低（P＜0.05）；在H1650-3D 細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，吉非替尼組細(xì)胞線粒體ROS 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

在PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，吉非替尼+知母組細(xì)胞粒體ROS水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），吉非替尼+干姜組細(xì)胞線粒體ROS水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與吉非替尼組比較，吉非替尼+知母組細(xì)胞線粒體ROS水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，知母聯(lián)合吉非替尼可以促進(jìn)NSCLC-3D 細(xì)胞線粒體ROS 水平升高，而干姜聯(lián)合吉非替尼則會(huì)抑制線粒體ROS水平。

3 討論

表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKIs）開(kāi)創(chuàng)了非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）分子靶向治療的先河，然而EGFR-TKIs 的耐藥問(wèn)題在很大程度上限制了患者的臨床獲益。T790M 突變是EGFR-TKIs 耐藥的最重要原因，其次PI3K/AKT通路異常激活是關(guān)鍵的耐藥機(jī)制之一。盡管該通路作為三大經(jīng)典信號(hào)通路之一，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響及調(diào)控機(jī)制已被廣泛研究，然而針對(duì)該通路誘導(dǎo)的耐藥問(wèn)題尚缺乏安全有效的治療方法[13]。西醫(yī)的研究策略主要集中在通路抑制劑的研發(fā)，包括PI3K 抑制劑、下游靶點(diǎn)AKT抑制劑和mTOR抑制劑，但目前上述新藥在肺癌領(lǐng)域的有效性和安全性方面仍面臨著較大挑戰(zhàn)[14-15]。本研究通過(guò)聯(lián)合清熱藥知母及溫陽(yáng)藥干姜干預(yù)發(fā)現(xiàn)，清熱中藥知母能顯著增強(qiáng)吉非替尼在3D 培養(yǎng)條件下對(duì)PC-9-PIK3CA-M 和H1650 細(xì)胞活力的抑制，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為逆轉(zhuǎn)PI3K/AKT通路異常激活介導(dǎo)的EGFR-TKIs 耐藥提供了一種新的治療策略，具有一定的臨床意義。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)[7]及相關(guān)研究[16]發(fā)現(xiàn)，EGFRTKIs 具有“溫陽(yáng)”屬性，PIK3CA 突變與中醫(yī)熱毒證密切相關(guān)，二者均是EGFR-TKIs 預(yù)后不良的因素。藥物各具偏性，“過(guò)用”亦能致病，具有“溫陽(yáng)”作用的EGFR-TKIs用于合并熱毒證的PIK3CA突變患者會(huì)發(fā)生耐藥。PI3K 異常激活是EGFR-TKIs 耐藥的重要機(jī)制之一，PIK3CA能夠促進(jìn)PI3K/AKT通路異常激活。因此，本課題組根據(jù)中醫(yī)“熱者寒之”的理論提出假設(shè)，清熱類藥物能逆轉(zhuǎn)PI3K/AKT通路異常激活介導(dǎo)的EGFR-TKIs 耐藥，并選用EGFR 敏感突變合并PTEN缺失或PIK3CA突變的NSCLC細(xì)胞結(jié)合3D培養(yǎng)技術(shù)，建立了PI3K異?；罨閷?dǎo)EGFR-TKIs 耐藥的細(xì)胞模型。知母是清熱滋陰類中藥，具有抗癌藥理作用，數(shù)據(jù)挖掘研究[17]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰清肺法是治療肺癌的常用法則，且知母使用頻率較高，故選擇知母作為清熱法的代表中藥。干姜是溫中散寒類中藥，同樣具有抗癌藥理作用[10]，故選擇干姜作為溫陽(yáng)法的代表中藥。本研究發(fā)現(xiàn)，清熱藥知母與吉非替尼有協(xié)同作用，而溫陽(yáng)藥干姜能拮抗吉非替尼的抗腫瘤作用，提示吉非替尼適合與清熱類中藥聯(lián)用來(lái)治療EGFR敏感突變合并PI3K/AKT通路異?；罨腘SCLC 患者。有研究者發(fā)現(xiàn)，清熱中藥苦參注射液能夠通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT/mTOR 通路，上調(diào)細(xì)胞自噬對(duì)吉非替尼增敏[18]；清熱中藥提取物如大黃素、澳洲茄邊堿、黃芩苷、紫草素等也具有抑制PI3K/AKT 磷酸化的作用[19]，進(jìn)一步提示清熱中藥與PIK/AKT通路的關(guān)系。

AKT 是PI3K 信號(hào)傳導(dǎo)的重要致癌效應(yīng)因子，磷酸化AKT 對(duì)活性氧（ROS）的調(diào)控起雙向作用，既可直接調(diào)節(jié)線粒體生物氧化和激活NADPH 氧化酶促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，也能調(diào)控Nrf2促進(jìn)ROS的清除[20]。在腫瘤細(xì)胞中，氧化還原代謝的重編程會(huì)導(dǎo)致ROS 的異常積累。由于ROS 在特定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布、濃度和持續(xù)時(shí)間不同，其在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和凋亡中發(fā)揮不同的作用[21]。ROS 在腫瘤進(jìn)展中具有雙重作用，包括ROS 依賴的惡性轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[21]。在明確清熱藥物知母能增強(qiáng)PI3K 通路異常介導(dǎo)的EGFR-TKIs 耐藥細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性之后，本研究初步探索了知母、干姜與吉非替尼聯(lián)用之后對(duì)胞質(zhì)ROS 和線粒體ROS 的影響。結(jié)果表明，在PC-9-PIK3CA-M-3D 和H1650-3D 細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，知母聯(lián)合吉非替尼能促進(jìn)線粒體ROS 水平升高，而干姜聯(lián)合吉非替尼能抑制線粒體ROS水平升高。

綜上所述，清熱藥知母可能通過(guò)上調(diào)線粒體ROS水平，進(jìn)而促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，逆轉(zhuǎn)PI3K/AKT通路異常活化介導(dǎo)的吉非替尼耐藥，而溫陽(yáng)藥干姜可能通過(guò)下調(diào)線粒體ROS 水平而部分拮抗吉非替尼的抗腫瘤作用。提示臨床對(duì)于EGFR敏感突變合并PI3K 通路異常的患者，EGFR-TKIs 應(yīng)該與清熱類中藥聯(lián)合應(yīng)用，以增加EGFR-TKIs 敏感性，延緩甚至逆轉(zhuǎn)耐藥，從而提高患者療效。然而知母、干姜僅僅是個(gè)別具有代表性的單味中藥，其他清熱類中藥或復(fù)方是否也對(duì)PI3K激活介導(dǎo)的EGFR-TKIs耐藥起到增敏甚至延緩、逆轉(zhuǎn)耐藥作用，需要進(jìn)一步探索。