孫玉俠，吳勉華，孫莎莎，謝美萍，姜澤群，李文婷（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029）

肝癌是全球普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一，據(jù)官方最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌是目前世界第六大最常被診斷的癌癥且已成為第三大癌癥死亡原因[1]。我國(guó)肝癌的形勢(shì)更加嚴(yán)峻，不僅發(fā)病率不斷上升，其死亡率更是僅次于肺癌排在第二，針對(duì)無(wú)轉(zhuǎn)移的肝癌患者目前常采用手術(shù)切除的方式治療，但對(duì)于中晚期患者則很難徹底手術(shù)切除，而采用放、化療方式往往給患者帶來(lái)極大痛苦[2]。中醫(yī)從“虛勞”立論，辨證論治，不僅可以延長(zhǎng)腫瘤患者的生存周期，而且可以大大改善其生活質(zhì)量[3]。臨床研究[4]表明，對(duì)于肝癌患者單純使用中醫(yī)藥治療已卓有成效，而使用中西醫(yī)結(jié)合治療則更是效果明顯。

消癌解毒方是在國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授“癌毒”病機(jī)理論指導(dǎo)下經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的有效抗癌復(fù)方，是由白花蛇舌草、僵蠶、蜈蚣、八月札、山慈姑、太子參、麥冬組成的中藥復(fù)方，其中白花蛇舌草清熱解毒為君藥；山慈菇、僵蠶、八月札、蜈蚣化痰祛瘀，解郁消癌為臣藥；佐以益氣養(yǎng)陰，扶正消癌的太子參和麥冬，全方配伍得當(dāng)，發(fā)揮扶正消癌的效果，在臨床治療肝癌上取得了良好療效[5]。根據(jù)癌毒理論，腫瘤以“癌毒”為特異性致病因子，夾雜痰、瘀、陰傷、氣耗等邪氣，患者表現(xiàn)出虛實(shí)夾雜、正氣虧虛癥狀，因此治療以消癌解毒為主同時(shí)兼顧化痰、祛瘀、補(bǔ)氣、養(yǎng)陰[6]。全國(guó)名中醫(yī)吳勉華教授團(tuán)隊(duì)對(duì)消癌解毒方的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究[7]，發(fā)現(xiàn)其既能通過(guò)直接殺傷癌細(xì)胞發(fā)揮抗癌解毒作用，又能通過(guò)增強(qiáng)免疫力抗腫瘤的方式起到扶正抗癌作用。

本研究致力于探索消癌解毒方抑制肝癌的體內(nèi)作用及其分子機(jī)制，并通過(guò)蛋白組學(xué)尋找該方治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)，豐富消癌解毒方防治惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和療效觀察指征，以期為腫瘤的臨床防治提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株C57-BL/6 小鼠，雄性，SPF 級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量（18±2）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20170005027692。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2018-0049，飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，濕度45%～50%，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：202004A004。肝癌H22細(xì)胞購(gòu)自上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物及試劑消癌解毒方由白花蛇舌草、山慈菇、僵蠶、蜈蚣、太子參、麥冬、八月札組成，中藥飲片均購(gòu)自南京百草堂中醫(yī)門(mén)診部，并經(jīng)南京百草堂中醫(yī)門(mén)診部執(zhí)業(yè)中藥師嚴(yán)建國(guó)鑒定為正品。順鉑注射液，購(gòu)自豪森藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20040812；胎牛血清、免封閉PAGE 凝膠快速制備試劑盒、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批號(hào)分別為：40130ES76、20326ES62、20124ES03、20109ES05；DMEM 高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自上海龍?zhí)锷锛夹g(shù)有限公司，批號(hào)：L110KJ；胰蛋白酶、PBS溶液，購(gòu)自上海源培生物科技有限公司，批號(hào)分別為：M430957、L210921；BCA 蛋白濃度測(cè)試盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0012；HE 染液，購(gòu)自福州飛凈生物科技有限公司，批號(hào)：PH0516；4%多聚甲醛固定液，購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)：21335405；TMT?Reagent-6Plex Multiplex Kit，購(gòu)自美國(guó)Thermo fisher公司，批號(hào)：90061；IL-6和TNF-α Elisa 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)分別為：GM1154、GM1151；兔一抗β-actin、STAT3、p-STAT3、c-Myc、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-9 抗體，購(gòu)自美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為：#4970、#2640、#9145、#5605、#3498、#2772、#9664、#9509；山羊抗兔IgG，購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司，批號(hào)：RS0002。

1.3 儀器Guava easyCyte 流式細(xì)胞儀，美國(guó)Merck Millipore 公司；Labsystems Mμltiskan MS 酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo Labsyste 公司；1200SL/6410BLCMS 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS），美國(guó)Thermo Scientific公司；MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀，德國(guó)Ultrafle Xtreme公司；ChemiDoc MP 多功能凝膠成像儀，美國(guó)BIORAD公司。

1.4 藥物制備按照標(biāo)準(zhǔn)配比稱(chēng)取各種藥材，加入10 倍量的純凈水，煎煮2 h，干凈雙層紗布過(guò)濾；然后加入8 倍量純凈水，二次煎煮1.5 h，合并兩次濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成終濃度為2 g·mL-1的藥液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5 模型復(fù)制[8]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22 細(xì)胞用PBS 處理，得到濃度約為1×107個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液。通過(guò)皮下注射200 μL 細(xì)胞懸浮液到每只小鼠的右腋窩中創(chuàng)建小鼠肝癌模型；正常組注射同等體積的生理鹽水。SPF環(huán)境下飼養(yǎng)1周，觀察其造模情況。當(dāng)小鼠腋下出現(xiàn)黃豆粒大小包塊，說(shuō)明造模成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 分組及給藥取造模成功小鼠，隨機(jī)分為模型組、消癌解毒方組、順鉑組和消癌解毒方聯(lián)合順鉑組，每組10只；另選10只健康小鼠作為正常組。模型組和正常組灌服生理鹽水，消癌解毒方組給予20 g·kg-1的消癌解毒方，順鉑組給予1 mg·kg-1的順鉑注射液，消癌解毒方聯(lián)合順鉑組給予相應(yīng)的消癌解毒方和順鉑注射液，每日1次，持續(xù)給藥11 d。

1.7 觀察小鼠狀態(tài)、計(jì)算抑瘤率和免疫系數(shù)給藥后觀察小鼠飲食、糞便、毛發(fā)和精神狀況，用電子天平分別測(cè)量小鼠初次給藥前和末次給藥后體質(zhì)量變化。給藥結(jié)束第二天取血后處死小鼠，完整剝離瘤體組織、胸腺和脾臟，用PBS沖洗干凈，稱(chēng)質(zhì)量并計(jì)算腫瘤抑瘤率和免疫指數(shù)。抑瘤率=模型組與給藥組瘤體平均質(zhì)量差值/模型組瘤體平均質(zhì)量×100%，胸腺（脾臟）系數(shù)=胸腺（脾臟）質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.8 瘤體組織HE 染色取出待測(cè)樣本，用PBS沖洗干凈，浸于適量4%多聚甲醛過(guò)夜；將其依次用由低到高乙醇溶液脫水，置于二甲苯中透明，浸蠟；用石蠟進(jìn)行包埋并切片得到厚度為3～5 μm 的切片，經(jīng)蓋玻片撈片后，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟；然后浸入由高到低濃度乙醇溶液各10 min，用蘇木精染色5 min，流水沖洗，經(jīng)5%鹽酸分化1 min 并沖洗干凈；用伊紅染色3 min，流水沖洗干凈后浸入由低到高梯度乙醇溶液脫水，經(jīng)二甲苯透明化，中性樹(shù)脂封片，在顯微鏡下觀察各組瘤體組織形態(tài)。

1.9 瘤組織凋亡的流式檢測(cè)取待測(cè)樣本，用無(wú)菌剪剪取1～2 mm 小塊若干，移入1.5 mL 離心管，用PBS 洗滌干凈；每管加入500 μL 0.25%胰酶消化液，37 ℃消化30 min，用含血清的培養(yǎng)基終止消化；以2 000 r·min-1離心3 min（離心半徑15 cm），棄上清，PBS洗滌兩次；用200目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾懸液，再次離心3 min，棄上清；PBS 洗滌干凈后嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.10 血清樣本制備給藥結(jié)束后，取小鼠全血，放入1.5 mL 離心管中，靜置，常溫3 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)2 次，離心半徑15 cm，得到待測(cè)上清；每管取10 μL，加入Elution Buffer，漩渦振蕩；加入DTT，水浴。加入IAM，避光靜置；加入預(yù)冷的丙酮，-20 ℃沉淀3 h；以6 900 r·min-1離心20 min，離心半徑15 cm，取沉淀；加入復(fù)溶buffer，終濃度為50%TEAB，0.1%SDS；超聲助溶，bradford 法進(jìn)行蛋白定量。

1.11 蛋白質(zhì)消化、肽段標(biāo)記和質(zhì)譜檢測(cè)取100 μg蛋白體積樣品，加入胰酶，37 ℃水浴。取1 μL消化后肽段，檢測(cè)消化效率，加入異丙醇，渦旋1 min離心。將混好的標(biāo)記試劑加入到肽段中，TMT 試劑標(biāo)記，隨后使用BioLC HPLC 柱子通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換的方法進(jìn)行匯集、分液，再以LC-MS/MS 方法進(jìn)行分析。使用Thermo 公司的儀器進(jìn)行色譜掃描分離和質(zhì)譜分析。將柱子在初始狀態(tài)下平衡10 min，得到分析樣本蛋白，按照常規(guī)方法在陽(yáng)離子模式下進(jìn)行掃描，所得數(shù)據(jù)由Maxquant（V 1.2.2.5）處理。

1.12 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和生物信息學(xué)分析使用Uniprot.proteome（Version 2012048）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中倍數(shù)變化和P值（t檢驗(yàn)）的切分分別設(shè)為1.5 和0.05。使用Ingenuity?Pathway Analysis（IPA）通路分析工具進(jìn)行此部分實(shí)驗(yàn)的生物信息學(xué)分析。

1.13 Elisa 試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-α 表達(dá)將采集的各組血液標(biāo)本，置于1.5 mL 離心管中，室溫放置2 h，于4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min（離心半徑15 cm），取上清。嚴(yán)格按照Elisa 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)IL-6和TNF-α含量。

1.14 Western Blot 法檢測(cè)STAT3、p-STAT3、c-Myc、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-9 蛋白表達(dá)用Ripa 裂解液提取蛋白后使用BCA 試劑盒檢測(cè)濃度。定量上樣，將樣品電泳至分離膠底部，轉(zhuǎn)膜后用5%BSA 溶液室溫封閉1.5 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min；4 ℃環(huán)境孵育一抗過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min；室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，每次15 min；按照1∶1配制顯影劑，經(jīng)曝光顯影后用ImageJ 軟件處理?xiàng)l帶，并計(jì)算目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間數(shù)據(jù)對(duì)比采用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠體質(zhì)量、腫瘤生長(zhǎng)和免疫指數(shù)的影響如圖1、表1所示，與模型組比較，各給藥組小鼠給藥前后體質(zhì)量基本一致，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其中各組腫瘤質(zhì)量均不超過(guò)其體質(zhì)量的10%，且體積不超過(guò)2 000 mm3，符合倫理規(guī)范，數(shù)據(jù)可用。與模型組比較，各給藥組腫瘤質(zhì)量明顯下降，抑瘤率明顯升高（P＜0.01）；順鉑組小鼠胸腺、脾臟系數(shù)明顯降低（P＜0.05），消癌解毒方組與消癌解毒方聯(lián)合順鉑組胸脾和脾臟系數(shù)均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。觀察小鼠生理狀態(tài)發(fā)現(xiàn)消癌解毒方組及消癌解毒方聯(lián)合順鉑組與單獨(dú)使用順鉑組小鼠相比飲食更佳，大便、毛發(fā)受到影響較小，精神更活躍。以上結(jié)果提示，消癌解毒方和消癌解毒方聯(lián)合順鉑組在抑制肝癌小鼠腫瘤增殖的同時(shí)可以促進(jìn)其免疫器官發(fā)育，提高其免疫功能。

表1 各組荷瘤小鼠抑瘤率及免疫指數(shù)（±s，n=7）Table 1 Tumor inhibition rate and immune index of H22-bearing mice in each group（±s，n=7）

表1 各組荷瘤小鼠抑瘤率及免疫指數(shù)（±s，n=7）Table 1 Tumor inhibition rate and immune index of H22-bearing mice in each group（±s，n=7）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

脾臟系數(shù)/（mg·g-1）4.54±0.09 6.27±0.76**4.40±0.51*5.39±0.21**組別模型組消癌解毒方組順鉑組消癌解毒方聯(lián)合順鉑組瘤質(zhì)量/g 2.49±0.29 1.48±0.21**1.15±0.23**0.81±0.15**抑瘤率/%40.59 53.84 67.32胸腺系數(shù)/（mg·g-1）2.14±0.05 2.39±0.34*1.72±0.19*2.36±0.17*

圖1 消癌解毒方與順鉑聯(lián)用對(duì)肝癌荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=7）Figure 1 Effects of Xiao’ai Jiedu Recipe combined with cisplatin on body mass of hepatoma-bearing mice（±s，n=7）

2.2 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠瘤體組織的影響如圖2所示，HE 染色后顯微鏡下觀察到模型組腫瘤細(xì)胞團(tuán)體積較大，細(xì)胞排列密集且無(wú)序，與周?chē)M織邊界不明確，瘤細(xì)胞病理性核分裂像較多，腫瘤組織壞死程度均較輕，有不同程度空泡。藥物干預(yù)后腫瘤細(xì)胞胞核異型、核質(zhì)比高，核仁不明顯，未見(jiàn)明顯核分裂相，細(xì)胞大面積壞死，細(xì)胞胞核固縮深染、碎裂并出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡；與模型組比，瘤組織壞死程度加大，分裂增殖程度減輕。

圖2 各組小鼠瘤體組織病理學(xué)觀察（HE 染色，×200）Figure 2 Observation of tumor histological morphology in each group（HE，×200）

2.3 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡的影響如圖3所示，與模型組比較，給藥組凋亡率明顯升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明給藥組能促進(jìn)肝癌小鼠細(xì)胞凋亡。

圖3 各組小鼠瘤體組織流式檢測(cè)結(jié)果（±s，n=7）Figure 3 Flow detection results of tumor tissue in each group（±s，n=7）

2.4 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠血清差異蛋白的影響如圖4、表2所示，同組差異蛋白相似度高，表明結(jié)果可重復(fù)且客觀有效；不同組之間蛋白差異明顯，表明用藥物干預(yù)后小鼠血清中蛋白出現(xiàn)不同程度的改變。消癌解毒方組與模型組比，血清中共鑒定出132 種差異蛋白，其中表達(dá)下調(diào)95 個(gè)蛋白，上調(diào)37 個(gè)蛋白（Fold change≥±1.5）。對(duì)差異蛋白進(jìn)一步分析，主要涉及炎癥因子、能量代謝、細(xì)胞凋亡酶、生長(zhǎng)因子等，以表達(dá)較明顯的部分蛋白為例，見(jiàn)表2。

表2 消癌解毒方組與模型組比血清部分差異蛋白Table 2 Some serum different proteins for comparison between Xiao’ai Jiedu Recipe and the model group

2.5 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠差異蛋白的亞網(wǎng)絡(luò)分析如圖5所示，為了進(jìn)一步了解差異蛋白之間關(guān)系，運(yùn)用IPA軟件對(duì)差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行富集度分析。根據(jù)Score 值，與模型組比，消癌解毒方組得到5個(gè)富集度最高的蛋白質(zhì)亞網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，主要涉及脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡和生存、細(xì)胞信號(hào)和互動(dòng)等方面。其中STAT3 信號(hào)通路被捕捉到參與炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。

2.6 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠差異蛋白上游調(diào)節(jié)因子的預(yù)測(cè)如表3、圖6所示，進(jìn)一步運(yùn)用IPA 軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行上游因子富集，有36 種上游因子被預(yù)測(cè)到激活或抑制，根據(jù)一致性得分、節(jié)點(diǎn)、目標(biāo)值篩選出最明顯的10 個(gè)上游因子分別是HNF4A、STAT3、EGF、AGT、FOS、IL-6、JNK、CD36、TNF、HIF1A。為進(jìn)一步篩選生物靶標(biāo)，以IL-6、STAT3作為上游因子篩選出受其調(diào)控的下游因子。

表3 預(yù)測(cè)消癌解毒方組與模型組差異蛋白活性狀態(tài)的上游調(diào)節(jié)因子Table 3 Upstream regulatory factors of activity state predicted form the comparation between Xiao’ai Jiedu Recipe and model group

圖6 消癌解毒方組與模型組差異蛋白質(zhì)以IL-6、STAT3 作為上游因子篩選出受其調(diào)控的下游因子Figure 6 Differential protein from Xiao’ai Jiedu Recipe group and model group through screening downstream factor regulated by IL-6，STAT3

2.7 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠外周血IL-6 和TNF-α的影響如表4所示，與正常組比較，模型組IL-6和TNF-α 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），表明各給藥組對(duì)小鼠炎癥因子IL-6和TNF-α具有一定的調(diào)節(jié)作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 各組小鼠外周血IL-6、TNF-α 含量（±s，n=7）Table 4 Contents of IL-6 and TNF-α in peripheral blood of mice in each group（±s，n=7）

表4 各組小鼠外周血IL-6、TNF-α 含量（±s，n=7）Table 4 Contents of IL-6 and TNF-α in peripheral blood of mice in each group（±s，n=7）

注：與正常組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01

TNF-α/（ng·L-1）390.56±30.09 561.03±43.52##502.29±21.50*502.31±23.79*451.95±19.84**組別正常組模型組消癌解毒方組順鉑組消癌解毒方聯(lián)合順鉑組IL-6/（ng·L-1）95.44±4.10 130.18±6.01##113.62±6.39**105.66±6.98**102.79±3.87**

2.8 消癌解毒方對(duì)H22 荷瘤小鼠瘤體組織STAT3、p-STAT3、c-Myc、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9 蛋白表達(dá)的影響如圖7所示，與模型組比較，治療后小鼠腫瘤組織中p-STAT3蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而STAT3 變化不明顯（P＞0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其下游基因Bax、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9 蛋白含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），c-Myc、Bcl-2 蛋白含量明顯下降（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 各組蛋白表達(dá)水平（±s，n=7）Figure 7 Protein expression levels in each group（±s，n=7）

3 討論

消癌解毒方是國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授經(jīng)過(guò)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)形成的腫瘤防治有效方。研究[9]發(fā)現(xiàn)消癌解毒方可以明顯抑制胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖。臨床數(shù)據(jù)[10]顯示消癌解毒方搭配化療可增強(qiáng)患者免疫功能，具有減毒增效作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)構(gòu)建的肝癌荷瘤模型小鼠用藥干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)消癌解毒方可以抑制肝癌增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，且消癌解毒方與順鉑聯(lián)用相對(duì)單獨(dú)用藥組效果更明顯，相對(duì)單獨(dú)使用化療藥組增加了免疫功能，且毒副作用更輕微。為了進(jìn)一步探究其抗肝癌的機(jī)制，我們引入了蛋白組學(xué)的概念。

蛋白組學(xué)是指一個(gè)細(xì)胞組織或基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白組學(xué)通過(guò)整體分析細(xì)胞內(nèi)生命過(guò)程中變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平、蛋白質(zhì)之間的相互作用等，獲知蛋白質(zhì)功能及其在生命過(guò)程中的作用[11]。分析蛋白組學(xué)有利于疾病早期診斷和治療。中醫(yī)藥是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，其最具特色的就是整體觀念和辨證論治，這與蛋白組學(xué)的研究思路不謀而合，利用蛋白組學(xué)方法有利于解讀中醫(yī)藥復(fù)雜理論的科學(xué)內(nèi)涵[12]。本實(shí)驗(yàn)以H22移植瘤小鼠外周血為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用比較蛋白組學(xué)定量、定性分析，以TMT 肽段標(biāo)記進(jìn)行分析檢測(cè)，探討消癌解毒方干預(yù)后差異蛋白表達(dá)變化，并進(jìn)一步分析差異蛋白間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)和上游調(diào)控因子變化，最后得到與“癌毒”相關(guān)的生物標(biāo)志物，以及消癌解毒方的抗癌分子靶標(biāo)。

細(xì)胞生長(zhǎng)不受控制，并不斷拮抗其凋亡信號(hào)，是腫瘤快速發(fā)展的主要機(jī)制，故抑制增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物的主要研究方向。IL-6/STAT3 信號(hào)通路在與腫瘤相關(guān)的疾病中發(fā)揮著很大作用，廣泛參與了腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡各組代謝調(diào)控[13]。IL-6是一種導(dǎo)致腫瘤發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵炎性因子，它的表達(dá)可以對(duì)STAT3的激活進(jìn)行調(diào)節(jié)[14]。IL-6通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面抗體來(lái)激活JAK2，使得磷酸化的STAT3蛋白產(chǎn)生效應(yīng)調(diào)控其下游基因的表達(dá)[15]。同時(shí)有研究[16]發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生，并且可以激活STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。c-Myc是STAT3通路上的關(guān)鍵下游基因之一，它通過(guò)促使細(xì)胞周期由靜止變成活躍來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，故而，抑制c-Myc蛋白的表達(dá)可以抑制腫瘤增殖[17]。細(xì)胞凋亡是由多種基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序的死亡，其中線粒體凋亡途徑通路上的Bcl-2 家族與Caspase 家族是促使細(xì)胞發(fā)生凋亡的兩個(gè)最重要的組成部分，STAT3信號(hào)的激活可以調(diào)節(jié)下游的Bax和Bcl-2參與腫瘤的異常凋亡[18]。Bcl-2是最主要的抗凋亡基因之一，Bax 則與其作用相反，Bax 的高表達(dá)有助于下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)[19]。Bcl-2 的表達(dá)量降低會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加，此作為激活Caspase-9表達(dá)的信號(hào)，進(jìn)一步激活Caspase-3的表達(dá)，開(kāi)始執(zhí)行細(xì)胞凋亡[20]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白組學(xué)分析得出消癌解毒方的抗腫瘤分子機(jī)制可能與IL-6、TNF、STAT3等有關(guān)；隨后對(duì)各組小鼠外周血進(jìn)行Elisa 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型組IL-6和TNF-α 因子的表達(dá)相對(duì)正常組明顯上升，而各加藥組IL-6 和TNF-α 因子的表達(dá)則相較于模型組明顯下調(diào)；對(duì)STAT3 和磷酸化的STAT3 蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，單獨(dú)或聯(lián)合使用消癌解毒方和順鉑時(shí)，p-STAT3 蛋白的表達(dá)均明顯降低。這反映了消癌解毒方聯(lián)合順鉑的抑癌作用與IL-6/TNF-α/STAT3 通路緊密相連。為了進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的機(jī)制，我們隨后對(duì)其下游基因的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示相較于模型組各給藥組均明顯下調(diào)了c-Myc 和Bcl-2 蛋白水平，Bax、Cleaved-Caspase-3 及Cleaved-Caspase-9 蛋白含量則明顯上調(diào)。上述實(shí)驗(yàn)均表明消癌解毒方聯(lián)合順鉑組效果均優(yōu)于單獨(dú)給藥組。

綜上所述，消癌解毒方可以抑制肝癌增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且增強(qiáng)免疫功能，消癌解毒方與順鉑聯(lián)用可以增加療效并減輕順鉑毒副作用。其抑癌機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控IL-6/TNF-α/STAT3 通路進(jìn)一步影響其下游基因c-Myc、Bcl-2 和Caspase 家族的蛋白水平。阻斷IL-6/TNF-α/STAT3 通路可以成為未來(lái)治療肝癌的新思路，這有待于我們進(jìn)一步探討。