王 煒 郭玲慧 張 岱 任偉宏（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由細(xì)胞主動分泌的納米級膜囊泡，根據(jù)大小、生物學(xué)特征及形成機制的不同，通常將EVs分為微囊泡、外泌體和凋亡小體。目前認(rèn)為外泌體是細(xì)胞在正?；虿±項l件下分泌的直徑為40～180 nm 的雙層脂質(zhì)囊泡［1］。它們由晚期內(nèi)體形成，并表達(dá)內(nèi)體通路的特定標(biāo)志物，例如四跨膜蛋白（CD63、CD9、CD81），但也表達(dá)HSP70 和Rab 家族蛋白、Tsg101 和Alix，這些標(biāo)志蛋白在其他類型的囊泡中檢測不到。四跨膜蛋白（CD63、CD81 和CD9）在過去的二十年中已被用作外泌體標(biāo)志物。最近的研究顯示，含有CD9/CD81 或CD63 標(biāo)記的EVs 產(chǎn)生方式存在差異［2］。帶有少量CD63標(biāo)記的EVs主要從質(zhì)膜出芽；而帶有大量CD63 和少量CD9 的EVs 在內(nèi)體隔室中形成并被分泌出細(xì)胞，這部分EVs稱為外泌體。

外泌體中含有各種生物分子，如蛋白質(zhì)、RNA（mRNA、miRNA 和其他非編碼RNA）、DNA（線粒體DNA 和病毒DNA 等）、脂質(zhì)、氨基酸和代謝物［3-4］。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以作為信息的傳遞者，將其攜帶的生物分子傳遞給鄰近或者遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著免疫抑制作用［5-8］。目前的研究多是針對免疫細(xì)胞，是否有正常組織細(xì)胞可以攝取腫瘤細(xì)胞來源外泌體以及免疫細(xì)胞攝取腫瘤來源外泌體的比例。而分析不同組織細(xì)胞攝取腫瘤外泌體的情況可以幫助理解腫瘤分泌的外泌體對機體各組織的影響范圍。

為了觀察不同細(xì)胞系攝取外泌體的能力，使用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合CD63（hCD63）分子示蹤外泌體。使用流式細(xì)胞術(shù)分析不同組織來源的細(xì)胞系對胃癌細(xì)胞來源外泌體的攝取情況。

1 材料與方法

1.1 材料 pLVX-puro質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒由本實驗室保存。RPMI1640、DMEM、胰蛋白酶、青鏈霉素、嘌呤霉素購自索萊寶公司；opti-MEM購自Gibco 公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；高保真DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DNA marker 購自TaKaRa 公司；聚乙烯亞 胺（Ethylene imine polymer，PEI）、聚凝胺和HEPES 鈉購 自Sigma 公司；Milipure 超濾管購自默克；NucleoBond Xtra Midi 試劑盒購自德國MN 公司；MGC803、GES-1 細(xì)胞購自湖南豐暉生物有限公司；HEK293T 細(xì)胞本實驗室保存；THP-1 細(xì)胞、A549 細(xì)胞及CACO-2 細(xì)胞由河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室饋贈。引物合成及基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR 方法，從GES-1 細(xì)胞中克隆hCD63 分子。設(shè)計hCD63 和mNeptune 的引物，融合蛋白N 端基因的3′端引物與C 端基因的5′端引物重疊20 bp 堿基，先分別使用各引物進(jìn)行擴(kuò)增25 個循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋500 倍后，使用融合基因的上游及下游引物進(jìn)行第二輪PCR合成融合基因；用限制性核酸內(nèi)切酶酶切融合基因和pLVX-Puro 慢病毒載體，瓊脂糖凝膠電泳純化酶切產(chǎn)物。T4 DNA連接酶連接融合基因和pLVX-Puro慢病毒載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞后挑取菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測序，檢測插入的基因是否完整和正確。hCD63 基因通過酶切連接入pLVX-AcGFP1 載體中，引物序列見表1。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建中使用的引物Tab.1 Primers used in plasmid construction

1.2.2 不同標(biāo)記方法的比較 采用瞬時轉(zhuǎn)染方法比較熒光蛋白與hCD63不同融合方式對熒光強度的影 響。pLVX-CD63/mNeptune-puro、pLVX-mNeptune/CD63-puro、pLVX-CD63-AcGFP1 質(zhì)粒使用PEI轉(zhuǎn)染HEK293T。轉(zhuǎn)染72 h 后采用倒置熒光顯微鏡觀察熒光信號并收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中含有紅色熒光信號細(xì)胞的比例及平均熒光強度。實驗重復(fù)2次，結(jié)果采用獨立樣本t檢驗分析。

1.2.3 慢病毒包裝濃縮 目前有兩種方式標(biāo)記hCD63 分子，一種是在hCD63 分子的氨基端標(biāo)記熒光蛋白，另一種是在hCD63 分子的羧基端標(biāo)記熒光蛋白［9-10］。為比較兩種方法的優(yōu)劣，使用mNeptune紅色熒光蛋白基因分別融合在hCD63 基因的氨基端和羧基端，構(gòu)建了兩種慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。此外使用AcGFP1 綠色熒光蛋白對hCD63 分子進(jìn)行標(biāo)記，并與紅色熒光標(biāo)記的hCD63 進(jìn)行比較。慢病毒顆粒的包裝采用修改的方法［11］。簡而言之，HEK293T細(xì)胞生長到60%融合時，使用25 mmol/L氯喹處理5 h后加入基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、psPAX2、pMD2.G（4∶3∶1）。轉(zhuǎn)染后分別在48 h 和72 h 收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清。含有慢病毒顆粒的上清液結(jié)合差速離心、過濾及超濾進(jìn)行感染顆粒的濃縮。使用ELISA 檢測P24，對濃縮后的感染顆粒濃度進(jìn)行估算［12］。

1.2.4 標(biāo)記細(xì)胞的篩選及鑒定 使用pLVXCD63-AcGFP1 包裝的慢病毒顆粒感染MGC-803 細(xì)胞，感染細(xì)胞4 d 后，加終濃度為10 μg/ml 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)重組hCD63-AcGFP1的MGC-803細(xì)胞系。嘌呤霉素篩選4 周后，交替使用有限稀釋法和克隆挑取法篩選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的MGC-803 細(xì)胞株。使用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號的定位。

1.2.5 標(biāo)記外泌體的制備及鑒定 外泌體采用饑餓培養(yǎng)及超速離心機制備［13］。使用RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)熒光標(biāo)記的MGC-803 細(xì)胞48 h 后收取上清。2 000 g 離心20 min 去除細(xì)胞，10 000 g 離心30 min除細(xì)胞碎片。并采用0.22 μm 一次性過濾器過濾，去除>200 nm 囊泡。用截留分子量為100 kD的超濾管進(jìn)行超濾，去除雜蛋白。濃縮后的外泌體使用超速離心機收集外泌體。并用透射電鏡觀察制備的外泌體形態(tài)。通過BCA 蛋白檢測試劑盒檢測外泌體濃度。將外泌體的濃度調(diào)整為4 mg/ml。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記外泌體的攝取 終濃度為500 μg/ml的標(biāo)記外泌體和2×105個不同組織來源細(xì)胞（HEK293T 人胚腎細(xì)胞、CACO-2 結(jié)腸癌細(xì)胞、GES-1人胃黏膜細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞和THP-1單核細(xì)胞系樣細(xì)胞）加入12孔板中孵育24 h后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光信號［14］?？瞻讓φ战M使用未標(biāo)記的外泌體進(jìn)行共孵育培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 hCD63 與熒光蛋白融合基因的構(gòu)建 使用重疊PCR 構(gòu)建融合基因，如圖1。Marker1 是DL2000；Marker2 是DL15000。圖1A 顯示在750 bp marker 旁有兩條帶，分別與hCD63 和mNeptune 基因大小近似；在1 000 bp 和2 000 bp marker 旁有一條帶與融合基因hCD63/mNeptune 大小近似。使用酶切連接方法將融合基因與pLVX-puro 連接。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證結(jié)果如圖1B。pLVX-CD63-AcGFP1-PURO 質(zhì)粒雙酶切結(jié)果如圖1C。融合基因Sanger 測序峰如圖2，hCD63 和mNeptune 基因以正確的讀碼框連接在一起。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Construction result of recombinant plasmid

圖2 融合基因測序結(jié)果Fig.2 Results of fusion gene sequencing

2.2 不同標(biāo)記方法的比較 質(zhì)粒pLVX-CD63/mNeptune-puro、pLVX-mNeptune/CD63-puro 轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞后的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，如圖3。圖3A顯示不同標(biāo)記方法使HEK293T 細(xì)胞攜帶熒光的細(xì)胞比例。hCD63分子羧基端標(biāo)記方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光攜帶比率為96.8%；氨基端標(biāo)記的熒光攜帶比率為88.5%。攜帶熒光信號細(xì)胞比例在兩種標(biāo)記方法中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。不同標(biāo)記方法在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光強度比較，如圖3B。hCD63 羧基端標(biāo)記和氨基標(biāo)記方法在細(xì)胞中產(chǎn)生的熒光信號存在差異。hCD63分子羧基端標(biāo)記的熒光蛋白發(fā)出的熒光信號在細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強度比氨基端標(biāo)記的強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。圖4B綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞在顯微鏡下的顯示的亮度比圖4A 紅色熒光強。綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞可以清晰顯示出細(xì)胞膜輪廓，紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞輪廓較為模糊。

圖3 細(xì)胞攜熒光強度的比較Fig.3 Comparison of cell fluorescence intensity

圖4 不同熒光顏色標(biāo)記hCD63在HEK293T細(xì)胞的比較Fig.4 Comparison of hCD63 labeled with different fluorescent colors in HEK293T cells

2.3 熒光標(biāo)記細(xì)胞的篩選結(jié)果 選擇綠色熒光蛋白AcGFP1 對hCD63 標(biāo)記。篩選得到的細(xì)胞克隆如圖5A所示。綠色熒光信號分布于細(xì)胞表面，在細(xì)胞與細(xì)胞連接處熒光信號增強。提示標(biāo)記的hCD63與天然分子一樣定位于細(xì)胞膜上。為進(jìn)一步確定熒光信號在細(xì)胞內(nèi)的定位，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖5B。綠色熒光信號主要聚集在細(xì)胞膜上，熒光蛋白的標(biāo)記沒有干擾hCD63 分子在細(xì)胞內(nèi)的點位。白色箭頭所示為即將從細(xì)胞膜上分離的細(xì)胞囊泡結(jié)構(gòu)。

圖5 綠色熒光標(biāo)記hCD63細(xì)胞株的篩選Fig.5 Screening of hCD63 cells labeled with green fluorescence

2.4 制備外泌體的鑒定 使用透射電鏡觀察制備的外泌體，如圖6 所示。在透射電子顯微鏡下觀察到呈典型茶托狀的外泌體，直徑大多為40～160 nm。熒光蛋白標(biāo)記不能改變外泌體的形狀。增加超濾管處理步驟后，電鏡照片背景中蛋白雜質(zhì)較少看見。

圖6 制備熒光標(biāo)記外泌體的電子顯微鏡觀察Fig.6 Electron microscope observation of preparation of fluorescently labeled exosomes

2.5 不同細(xì)胞株攝取外泌體分析 不同受體細(xì)胞攝取胃癌細(xì)胞來源外泌體的能力存在差異，如圖7。HEK293T 細(xì)胞攝取CD63 標(biāo)記外泌體比例為（0.038 0±0.005 6）% ；CACO-2 細(xì)胞為（0.260±0.021）%；GES-1 細(xì)胞為（0.260±0.028）%；A549 細(xì)胞為（1.10±0.11）%；THP-1 細(xì)胞為（5.76±0.66）%。CACO-2 細(xì)胞空白組與實驗組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其余各細(xì)胞株空白對照組與其實驗組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示CACO-2 細(xì)胞株不攝取MGC-803 細(xì)胞的外泌體。人單核細(xì)胞THP-1 攜帶綠色熒光的細(xì)胞百分比最高［（5.76±0.66）%］，提示外泌體更易被THP-1細(xì)胞攝取。

圖7 不同組織來源細(xì)胞攝取胃癌細(xì)胞外泌體的分析Fig.7 Analysis of exosomes uptake by gastric cancer cells from different tissue sources

3 討論

本研究以胃癌細(xì)胞MGC803來源的外泌體為研究對象，分析各種組織來源細(xì)胞對其的攝取情況。CD63 分子是外泌體上含量最多的標(biāo)記分子。為追蹤外泌體在細(xì)胞之間的傳遞，使用熒光蛋白對CD63分子進(jìn)行了標(biāo)記，從而進(jìn)一步對外泌體進(jìn)行標(biāo)記。比較了CD63 分子不同標(biāo)記方法對熒光強度的影響。熒光蛋白融合在CD63 分子的羧基端會產(chǎn)生最強的熒光信號。標(biāo)記外泌體與細(xì)胞共孵育后的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，不同組織來源的細(xì)胞株攝取外泌體存在差異。結(jié)腸腺癌細(xì)胞（CACO-2）不攝取MGC803 細(xì)胞來源外泌體，人胚腎細(xì)胞（HEK293T）、肺癌細(xì)胞（A549）、人胃黏膜細(xì)胞（GES-1）和單核細(xì)胞系樣細(xì)胞（THP-1）可以攝取MGC803 細(xì)胞來源的外泌體，但不同組織細(xì)胞攝取外泌體的比例存在較大差異，THP-1 細(xì)胞攝取外泌體的比例最大。提示MGC803 細(xì)胞來源外泌體更容易與免疫細(xì)胞結(jié)合。在攝取外泌體的4 種細(xì)胞株中，HEK293T 細(xì)胞、A549 細(xì)胞、GES-1 細(xì)胞分別來源于腎組織、肺組織及胃組織，均不具有分化能力。THP-1 是單核細(xì)胞系樣細(xì)胞，是具有分化潛能的細(xì)胞，可以被細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。細(xì)胞的分化能力是否會影響外泌體的攝取，或者外泌體是否更傾向于被幼稚細(xì)胞攝取，還需要進(jìn)一步去證明。胃癌組織來源的外泌體更容易進(jìn)入到單核細(xì)胞樣的THP-1 細(xì)胞系，也提示胃癌細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的影響大于對其他組織細(xì)胞的影響，與之前的報道結(jié)果一致［8］。

本研究比較了兩種CD63 標(biāo)記方法的差異，并確定了最優(yōu)的標(biāo)記方式。同時，使用示蹤技術(shù)證明了胃癌細(xì)胞來源外泌體對各種免疫細(xì)胞的影響。