王 會, 鄭朝中, 陳玉梁, 王 飛,*, 王雷雨,章啟慧, 黃俊魁, 趙浚丞

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 湛江 524001; 2. 江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院, 南昌 330045;3. 四川揚運生物科技集團有限公司, 成都 610000)

目前國內(nèi)畜禽養(yǎng)殖業(yè)呈規(guī)?；⒓s化發(fā)展態(tài)勢(趙彥嶺, 2017)。獸用抗生素常作為抗菌藥物和生長促進劑被用于畜禽養(yǎng)殖過程中,但抗生素的過度使用會造成細菌耐藥性和環(huán)境污染等一系列問題(Wangetal., 2019)。作為廣譜性抗生素,四環(huán)素類抗生素涵蓋金霉素、四環(huán)素、土霉素、地美環(huán)素及其衍生物等被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)(于曉雯等, 2021)。其中,金霉素在促進畜禽類生長和預防疾病方面效果顯著,是畜禽養(yǎng)殖業(yè)的首選抗生素。金霉素在發(fā)酵生產(chǎn)過程中殘余的固體廢棄物統(tǒng)稱為金霉素菌渣(chlortetracycline residue),據(jù)統(tǒng)計,生產(chǎn)1噸金霉素平均產(chǎn)生40噸濕菌渣(陳冠益等, 2021)。菌渣中含有豐富的菌體蛋白(含量在20%～50%)及C, P和S等元素,但也含有大量菌絲體、發(fā)酵代謝產(chǎn)物、培養(yǎng)基降解物和金霉素殘留等(鄒書娟等, 2018)。由于金霉素菌渣有機物含量高,常用作畜禽飼料添加,但金霉素進入動物體內(nèi)僅少部分被吸收利用,大部分以原形或代謝產(chǎn)物的形式被排出,導致畜禽糞便中金霉素的殘留量較高。80%以上的畜禽糞便未經(jīng)分解就被直接施用田間,破壞了土壤微生物的平衡。因此菌渣飼料化應用仍具有一定的風險。國內(nèi)外處理抗生素菌渣主要有高溫焚燒(孫秀艷, 2017)、堆肥化處理(Renetal., 2019)、厭氧消化處理(蔣明燁等,2017)、化學處理(Wangetal., 2022)、微生物處理(Zhongetal., 2014)等方法,上述處理方法各有優(yōu)缺點,如高溫焚燒因菌渣含水量高,脫水、熱解過程耗能高、設備要求高,而且產(chǎn)生的廢氣易造成二次污染;物理填埋菌渣因腐化、液化產(chǎn)生的滲濾液,易造成水污染和土壤污染; 厭氧消化因其反應模式對設備和設施較高,工藝較為繁瑣,成本高,不利于應用推廣;化學氧化則因能耗大,成本高,易造成副產(chǎn)物二次污染不適宜廣泛應用。微生物處理效果較為明顯,而且不易產(chǎn)生二次污染,但對高產(chǎn)菌種選育、高效酶解功能要求較高,技術成熟度有待提高。因此,尋求科學有效的抗生素菌渣無害化處理技術是我國抗生素生產(chǎn)企業(yè)迫切需要解決的問題。

生物轉(zhuǎn)化技術是指通過植物離體細胞或器官、動物細胞、微生物及其細胞器,以及游離酶對外源性化合物進行結構修飾的生化反應。其中,資源昆蟲黑水虻Hermetiaillucens通過新陳代謝轉(zhuǎn)化餐廚垃圾、畜禽糞便等有機廢棄物的處理模式成為行業(yè)發(fā)展重點(紀佳雨等, 2021),也為金霉素菌渣降解處理提供新的思路。黑水虻處理農(nóng)業(yè)有機廢棄物具有轉(zhuǎn)化速度快、轉(zhuǎn)化效率高、處理成本低、無二次污染等優(yōu)點,且產(chǎn)生的副產(chǎn)物應用潛力大,因此,該模式受到了國內(nèi)外學者的廣泛關注。目前,關于黑水虻的研究主要集中在生物學生長特性(El-Dakaretal., 2021; Pliantiangtametal., 2021)、生物轉(zhuǎn)化機制(Meneguzetal., 2018)、飼料化應用(Wang and Shelomi, 2017)等方面,而對基料中抗生素、重金屬、農(nóng)藥等有害物質(zhì)的降解機制或積累效應的研究報道較少。比較分析磺化木質(zhì)素,纖維素、幾丁質(zhì)、啤酒糟(富含蛋白質(zhì))、葵花油等有機廢物的混合物飼養(yǎng)黑水虻,表明黑水虻幼體生長以及抗菌肽基因表達受飼養(yǎng)基質(zhì)影響(Vogeletal., 2018)。Kar等(2021)的研究表明,在豬飼料中通過黑水虻蟲粉替代100%豆粕能夠使生長豬的血漿中的有益活性物質(zhì)L-α-氨基丁酸和牛磺酸含量顯著上升。黑水虻幼蟲對霉菌毒素、農(nóng)藥(Purschkeetal., 2017)和黃曲霉毒素(Boschetal., 2017)具有一定的降解作用。金霉素菌渣中富含豐富的蛋白、油脂等營養(yǎng)成分(陳冠益等, 2021),但殘留金霉素限制了其資源化利用,鑒于黑水虻幼蟲可高效轉(zhuǎn)化有機廢棄物中的蛋白質(zhì)和油脂等營養(yǎng)成分,因此開展黑水虻對金霉素菌渣的生物轉(zhuǎn)化研究,對黑水虻幼蟲生物學價值開發(fā)和金霉素菌渣的無害化利用研究均具有重要意義。

本研究以黑水虻為研究對象,通過生物轉(zhuǎn)化技術降解金霉素菌渣,考察幼蟲周期性生長特性、金霉素降解率,系統(tǒng)評價金霉素菌渣對幼蟲生長特性的影響機制,以及黑水虻對金霉素的降解調(diào)控機制,從而揭示黑水虻生物轉(zhuǎn)化法對金霉素菌渣的降解作用,為我國抗生素生產(chǎn)企業(yè)提供科學有效的菌渣無害化處理新思路。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及飼養(yǎng)

黑水虻蟲卵由四川揚運生物科技集團有限公司提供。選取同一天收集的黑水虻卵,按0.5 g每組,隨機分21組,分別置于40目篩網(wǎng)孵化架上,篩網(wǎng)下為黑水虻蟲卵孵化盒,盒重為100 g(干重),含水量為80%的麥麩孵化料,依據(jù)實驗室前期最適宜養(yǎng)殖條件,將孵化盒置于恒溫恒濕實驗室(溫度28 ℃,相對濕度70%)進行孵化培育。

幼蟲培育至3日齡后,將其轉(zhuǎn)入含不同配比的麥麩和金霉素菌渣養(yǎng)殖料(表1)中(金霉素菌渣與麥麩營養(yǎng)成分如表2),置于溫度25 ℃,相對濕度40%環(huán)境中進行飼養(yǎng)。每個處理分別設置3個平行,如表1所示。養(yǎng)殖處理期間,每日定時進行一次翻料處理,從第5天開始,每隔1 d記錄幼蟲體長和體重。7日齡開始每隔1 d收集一次黑水虻幼蟲及養(yǎng)殖殘料,存于-80 ℃冰箱備用。飼養(yǎng)幼蟲至開始出現(xiàn)預蛹,實驗結束,用8目篩網(wǎng)對各處理組蟲料分離,對幼蟲進行24 h饑餓處理并清洗,將幼蟲與養(yǎng)殖殘料置于-80 ℃冰箱備用。

表1 混合養(yǎng)殖料中麥麩與金霉素菌渣不同質(zhì)量配比Table 1 Different mass ratios of wheat bran to chlortetracycline residue in the mixed diets

表2 金霉素菌渣與麥麩營養(yǎng)成分分析Table 2 Analysis of nutritional components of chlortetracycline residue and wheat bran

1.2 供試儀器和試劑

1.2.1儀器:高效液相色譜儀(型號為LC-20A),配有紫外檢測器(型號為SPD-M20 A);自動進樣器(型號為SIL-20A)購自Shimadzu公司;分析天平(型號為Auy220)購自湛江科銘科技有限公司;HLB Pro SPE固相萃取小柱購自CNW公司;低溫離心機(型號為3- 30K)購自Sigma公司;烘箱(型號為EDS-7-118)購自Thermo公司;旋渦混勻器(型號為IKA MS3)購自上海川翔生物科技有限公司;高速多功能粉碎機(型號為700Y),購自武義海納電器有限公司。

1.2.2試劑:金霉素菌渣由浦城正大生化有限公司提供;麥麩購自湛江市霞山區(qū)農(nóng)貿(mào)市場;金霉素標準品(純度≥99.5%)購自上海安譜璀世標準技術服務有限公司;無水草酸、一水合檸檬酸、乙二胺酸四乙酸二鈉、十二水合磷酸氫二鈉均為國藥集團分析純;甲醇和乙腈為色譜純,均購自Fisher公司。

1.3 幼蟲體長和體重測量

測量時,用鑷子隨機挑取每個處理組中的50頭幼蟲,置于培養(yǎng)皿中,洗凈幼蟲表面附著物,吸干水分后,采用游標卡尺和分析天平分別測量幼蟲體長與體重。

1.4 樣品前處理

每個處理組停止實驗后,將幼蟲和養(yǎng)殖殘料置于60 ℃烘箱中進行48 h多次翻動干燥,高速多功能粉碎機粉碎過40目。稱取粉碎幼蟲樣品2.0 g,置于50 mL離心管中,加入20 mL Mcllvaine緩沖液,渦旋震蕩5 min,低于15 ℃ 10 000 r/min離心5 min;移取上清液,在剩余殘渣中分別加入15 mL Mcllvaine緩沖液重復提取兩次,合并上清液,并定容至50 mL混勻。將提取液用快速濾紙過濾,收集濾液,吸取10 mL濾液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化,用3 mL甲醇洗脫,0.22 μm濾膜過濾后上機。

1.5 金霉素含量檢測

采用高效液相色譜儀檢測黑水虻幼蟲及養(yǎng)殖殘渣中金霉素含量,色譜條件為:色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:A為草酸水溶液(0.01 mol/L),B為甲醇∶乙腈(1∶1);檢測波長:365 nm;柱溫箱溫度:30 ℃;柱流量:1.0 mL/min;進樣量10 μL。流動相梯度洗脫見表3。用色譜級甲醇配制金霉素濃度分別為1, 5, 10, 50和100 mg/L的標準溶液,在高效液相色譜儀上進行測定后,分析金霉素溶液濃度對應峰面積標準曲線,在檢測濃度梯度內(nèi),線性關系良好,符合標準定量要求。標準曲線回歸方程為y=38 122x-36 561,相關系數(shù)R2=0.9977。

表3 流動相梯度洗脫Table 3 Mobile phase gradient elution

上述檢測條件,測得金霉素初始含量為346.78 μg/g。

1.6 金霉素菌渣的降解率測定

根據(jù)測定不同處理組幼蟲及養(yǎng)殖殘料中金霉素含量,采用下述公式計算各處理組金霉素菌渣降解率:

M養(yǎng)殖料: 養(yǎng)殖料中金霉素含量;M幼蟲: 幼蟲體內(nèi)金霉素含量;M殘料: 養(yǎng)殖殘料的金霉素含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計及作圖用GraphPad Prism 8.00(GraphPad Software,美國)進行,采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件,用單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行差異性分析,P<0.05表明兩者之間差異顯著。

2 結果

2.1 不同金霉素菌渣含量的養(yǎng)殖料對黑水虻幼蟲體重的影響

圖1表示金霉素菌渣含量對黑水虻幼蟲體重變化的影響。依次向黑水虻3日齡幼蟲中添加不同比例的麥麩和金霉素菌渣養(yǎng)殖料,由于純菌渣中金霉素含量過高,從而導致添加后麥麩與金霉素菌渣 0∶1混合養(yǎng)殖料飼養(yǎng)的黑水虻幼蟲逐漸出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,直至5日齡時幼蟲全部死亡,因此,未設計純金霉素菌渣進行下一階段實驗。

圖1 混合養(yǎng)殖料中金霉素菌渣含量對黑水虻幼蟲體重變化的影響Fig. 1 Influence of the content of chlortetracycline residue in the mixed diet on the change of body weight of Hermetia illucens larvae1∶0, 1∶1, 2∶1, 5∶1, 10∶1, 20∶1: 麥麩與金霉素菌渣不同質(zhì)量比Different mass ratios of wheat bran to chlortetracycline residue. 下圖同。The same for the following figures. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤; 柱上不同小寫字母表示麥麩與金霉素菌渣不同質(zhì)量配比混合養(yǎng)殖料飼養(yǎng)的同日齡幼蟲的參數(shù)差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析)。下圖同。Data in the figure are mean±SE. Different small letters above bars represent significant difference in the same parameter of the same day-old larvae reared with the mixed diets of wheat bran and chlortetracycline residue in different mass ratios (P<0.05, one-way ANOVA). The same for the following figures.

從圖1可以看出,麥麩與金霉素菌渣不同質(zhì)量配比混合養(yǎng)殖料飼養(yǎng)的3日齡幼蟲體重無顯著差異(P>0.05)(圖1)。7日齡時,20∶1和5∶1質(zhì)量配比組幼蟲體重無顯著性差異(P>0.05),但增加至11日齡時,20∶1質(zhì)量配比幼蟲體重增長較快,與其他組具有顯著性差異(P<0.05), 2∶1, 5∶1和10∶1質(zhì)量配比組無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。隨著幼蟲日齡達到11日時,部分幼蟲進入預蛹階段,開始排空腸道為預蛹做準備,進食量減少,體內(nèi)營養(yǎng)累計減少,故11日齡后體重降低。麥麩與金霉素菌渣5∶1, 10∶1和20∶1質(zhì)量配比混合養(yǎng)殖料飼養(yǎng)的5, 7, 9, 11和13日齡幼蟲體重高于對照組(1∶0質(zhì)量配比組,純麥麩飼養(yǎng)組),而麥麩與金霉素菌渣1∶1和2∶1質(zhì)量配比混合養(yǎng)殖料飼養(yǎng)的5, 7和9日齡幼蟲體重顯著低于對照組(P<0.05)(圖1)。因此,當麥麩與金霉素菌渣質(zhì)量比高于5∶1時,7-13日齡體重相對于純麥麩飼養(yǎng)組具有不同程度增加(圖1)。

2.2 不同金霉素菌渣含量的養(yǎng)殖料對黑水虻幼蟲體長的影響

不同金霉素菌渣含量的養(yǎng)殖料對黑水虻幼蟲體長的影響如圖2所示。結果表明,麥麩與金霉素菌渣不同質(zhì)量配比混合養(yǎng)殖料飼養(yǎng)的不同日齡黑水虻幼蟲體長變化呈現(xiàn)和體重變化基本一致的趨勢。3日齡幼蟲體長在各質(zhì)量配比菌渣組之間無顯著差異(P>0.05),隨著處理時間的推移,各質(zhì)量配比組的體長增加,至13日齡時各質(zhì)量配比菌渣組體長開始減少(圖2)。同時,純麥麩組(1∶0質(zhì)量配比組,對照組)中5, 7和9日齡幼蟲體長顯著高于麥麩與金霉素菌渣1∶1和2∶1質(zhì)量配比組(P<0.05);9日齡后體長增長速率變緩,增長速率由9日齡的46.11%降低為11日齡的3.67%,但菌渣組幼蟲體長仍緩慢增長。13日齡時,各組幼蟲體長開始減少,20∶1菌渣組幼蟲體長顯著高于其他各組的(P<0.05)。結果表明底物金霉素含量對低齡幼蟲生長特性影響更加顯著,這是由于其對環(huán)境適應性造成的。

圖2 混合養(yǎng)殖料中金霉素菌渣含量對黑水虻幼蟲體長變化的影響Fig. 2 Influence of the content of chlortetracycline residue in the mixed diet on the change of body length of Hermetia illucens larvae

2.3 黑水虻對金霉素的降解效果

采用高效液相色譜儀檢測菌渣干燥后金霉素含量為346.78 μg/g。在相同條件下測定不同日齡黑水虻幼蟲及養(yǎng)殖殘料中金霉素含量,通過1.6節(jié)公式計算金霉素降解率。由于黑水虻幼蟲對金霉素的耐受能力與濃度密切相關,在高濃度下存活率降低,這與實驗結果相一致,純菌渣組中黑水虻5日齡幼蟲全部死亡。因此,重點研究麥麩與金霉素菌渣5∶1, 10∶1和20∶1質(zhì)量配比組對金霉素的降解效果。表4為高效液相色譜儀檢測的3日齡幼蟲養(yǎng)殖料中的金霉素初始含量以及不同日齡幼蟲中與不同日齡幼蟲養(yǎng)殖殘料中的金霉素含量。麥麩與金霉素菌渣20∶1質(zhì)量配比組低濃度金霉素初始含量條件下,幼蟲中金霉素含量逐漸增加,至11日齡時達到穩(wěn)定狀態(tài)。但濃度較高時,麥麩與金霉素菌渣5∶1和10∶1質(zhì)量配比組黑水虻幼蟲中金霉素含量先降低,后升高至穩(wěn)定狀態(tài)。另一方面,不同質(zhì)量配比組養(yǎng)殖殘料中金霉素含量均隨日齡增加逐漸降低。

表4 黑水虻幼蟲及養(yǎng)殖殘料中金霉素含量Table 4 Chlortetracycline contents in larvae and diet residues of Hermetia illucens

由圖3可以看出,金霉素的降解率隨日齡增加均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,在9日齡達到峰值。這是由于受黑水虻幼蟲進食速度和新陳代謝規(guī)律影響,從7日齡到9日齡各組金霉素降解率顯著升高(P<0.05),但隨著日齡的推移,黑水虻新陳代謝過程逐漸變慢,降解能力也逐漸降低。麥麩與金霉素菌渣5∶1質(zhì)量配比組7, 9, 11和13日齡黑水虻幼蟲對金霉素的降解率分別為39.21%, 68.94%, 66.53%和68.26%,顯著高于麥麩與金霉素菌渣10∶1和20∶1質(zhì)量配比組的(P<0.05)(圖3),表明金霉素含量對于黑水虻幼蟲降解金霉素具有顯著影響(P<0.05),隨著金霉素含量的增加,抗性菌富集導致其降解率升高,這與真菌毒素在黑水虻幼蟲體內(nèi)的潛在積累研究結果一致。

圖3 不同質(zhì)量配比麥麩與金霉素菌渣混合養(yǎng)殖料飼養(yǎng)的不同日齡黑水虻幼蟲對金霉素的降解率Fig. 3 Degradation rates of chlortetracycline by different day-old larvae of Hermetia illucens reared with the mixed diets of wheat bran and chlortetracycline residue in different mass ratios

3 討論與結論

本研究通過黑水虻降解金霉素菌渣,系統(tǒng)研究了金霉素含量對黑水虻幼蟲生長特性以及降解率的影響。結果表明,在5-11日齡生長階段體重和體長與日齡呈正相關(圖1, 2),此階段為幼蟲快速成長期,該階段黑水虻幼蟲取食量及對基質(zhì)中的營養(yǎng)吸收能力逐漸增加,幼蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)積累量增加,各組蟲重與蟲長隨日齡增加呈增長趨勢,這與體重、體長與攝入的營養(yǎng)成分的積累量呈正相關的結論(黃友良和歐玲利, 2019)相一致。同時,金霉素作為一種抗生素,自身抑菌作用能夠抑制低日齡黑水虻幼蟲腸道微生物繁殖與生長,從而影響黑水虻幼蟲消化吸收有機質(zhì)能力。黑水虻可以根據(jù)環(huán)境變化而進行自我調(diào)節(jié)與適應,在不同環(huán)境下逐漸適應,進而轉(zhuǎn)化利用養(yǎng)殖料中的營養(yǎng),獲得幼蟲自身的生長發(fā)育(Brunoetal., 2019)。因此隨著幼蟲生長,體內(nèi)腸道微生物逐漸適應了對金霉素產(chǎn)生一定的耐藥性,從而促進了幼蟲對有機質(zhì)的吸收和代謝能力(Bertinettietal., 2019)。但金霉素菌渣相對含量對黑水虻幼蟲生長特性、生長周期及預蛹均存在影響。相對于高齡幼蟲,金霉素對低齡幼蟲的生理毒性作用更大,這與幼蟲對于抗生素的耐受程度有關。在低齡幼蟲階段,體長與體重受到的抑制作用隨濃度的升高而增加,但到了高齡幼蟲階段,這種抑制作用逐漸消失(沈媛等, 2012)。當黑水虻幼蟲超過13日齡時,部分幼蟲進入預蛹階段,體內(nèi)營養(yǎng)累計減少導致13日齡各組幼蟲的蟲長和蟲重減少(黃友良和歐玲利, 2019)。

當黑水虻幼蟲參與有機質(zhì)轉(zhuǎn)化過程時,抗生素的降解效率與有機質(zhì)的消化呈正相關,表明抗生素降解是隨著有機質(zhì)消化吸收在黑水虻幼蟲腸道中同時進行(Kogut and Arsenault, 2016; Varottoetal., 2017)。Cai等(2018b)由于受黑水虻幼蟲進食速度和新陳代謝規(guī)律的影響,黑水虻對金霉素的降解率隨著日齡的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。黑水虻幼蟲對金霉素的降解率受金霉素濃度的影響明顯,高濃度的金霉素提高了黑水虻幼蟲的降解率,這是由于隨著金霉素濃度的增加,抗性菌富集導致其降解率升高(圖3)。這與真菌毒素在黑水虻幼蟲體內(nèi)的潛在積累研究結果一致。在飼料中加入黃曲霉毒素、嘔吐毒素、赭曲毒霉毒素、玉米赤霉烯酮毒素以及上述毒素的混合物,黑水虻取食飼料后,僅在黑水虻幼蟲中檢測到比飼料中低幾個數(shù)量級的含量,表明黑水虻幼蟲對上述4種真菌毒素進行不同程度的代謝(Caietal., 2018a)。另一方面,相比于傳統(tǒng)降解方式,黑水虻生物轉(zhuǎn)化方法效率更高。牛糞中金霉素在不同厭氧消化溫度(22, 38和55 ℃)下經(jīng)28 d厭氧消化,去除率分別為3%, 8%和27%(Inceetal., 2013)。本研究中麥麩與金霉素菌渣5∶1質(zhì)量配比組在7-13日齡對金霉素的降解率分別達到39.21%, 68.94%, 66.53%和68.26%(圖3),遠高于傳統(tǒng)厭氧發(fā)酵,為黑水虻生物學價值開發(fā)和金霉素菌渣無害化處理提供了新的思路。