尹彩萍, 白雪妍, Naeem ABBAS, 孫璐璐, 殷欣冉, 張應烙

(安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 合肥 230036)

抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用解決了細菌感染難以治療這一難題,大大降低了人類及動物因細菌感染而死亡的幾率,為人類的健康做出了巨大的貢獻。由于其卓越的治療效果,抗生素被廣泛應用于畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域,并且隨著人類對抗生素功能的不斷開發(fā),其應用范圍還在不斷增加(盧明等, 2019)。但由于抗生素的過度使用導致致病菌耐藥性不斷增強,使得可供人類使用的抗生素種類不斷減少(Bakeretal., 2018; Phametal., 2019; Berman and Krysan, 2020),人類很有可能陷入“無藥可用”的困境(Sepúlvedaetal., 2017)。開發(fā)新型抗菌藥物是解決致病菌耐藥性的一種有效解決途徑(Landmanetal., 2011),然而目前使用的抗生素主要來自土壤微生物(Fisheretal., 2022),由于重復的研究使得分離得到新型抗菌物質(zhì)的概率很小(Lietal., 2016),因此尋找新的抗生素來源刻不容緩。昆蟲共生放線菌作為一種特殊環(huán)境微生物,在與宿主的共進化過程中逐漸形成特殊的代謝通路(Jiangetal., 2017),是新型抗生素研發(fā)的寶貴資源(Li and Lou, 2018)。

黑翅土白蟻Odontotermesformosanus屬昆蟲綱(Insecta)等翅目(Isoptera)白蟻科(Termitidae)土白蟻屬Odontotermes。這種白蟻在農(nóng)作物、房屋建筑、檔案圖書等方面存在危害,威脅到人類的經(jīng)濟與生活(姜麗紅等, 2017; 嚴少輝等, 2021);它們一般生活在陰暗潮濕、封閉惡劣的環(huán)境中,其巢穴二氧化碳濃度較高,且常有各類寄生病原菌的威脅,但其自身卻不會被其中的諸多病菌感染,這說明黑翅土白蟻具有一套獨特的自我防御機制。已有研究表明昆蟲共生菌具有提高寄主抵御各種病害的能力(Ferrietal., 2017),因此黑翅土白蟻的防病機制可能與共生菌有關(guān)。本研究擬對黑翅土白蟻腸道放線菌進行分離鑒定,測定其對多種人類致病菌的抗菌活性,進一步追蹤分離活性菌株的抑菌成分并鑒定其化學結(jié)構(gòu),旨在發(fā)現(xiàn)新穎的抗菌先導化合物,為新型抗生素的研發(fā)以及解決致病菌耐藥性問題奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集:2017年2月,于浙江師范大學(29°00′17.37″N, 119°29′54.84″E)校園內(nèi)采集供試黑翅土白蟻O.formosanus工蟻。

1.1.2供試致病菌:金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、大腸桿菌Escherichiacoli、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis和白色念珠菌Candidaalbicans。

1.2 黑翅土白蟻共生放線菌的分離純化

將捕捉到的供試黑翅土白蟻工蟻轉(zhuǎn)移至實驗室內(nèi)保存。在經(jīng)過24 h的饑餓處理后并在無菌條件下,將黑翅土白蟻的表面用75%的酒精進行消毒處理2～3 min后,用無菌水洗滌3次,每次30 s。用無菌的鑷子,將蟲體的腸道解剖出來,并將腸道放入滅菌的研缽中,加入少量無菌水研磨,將研磨液按梯度依次稀釋為10-1, 10-2和10-3備用。各梯度稀釋液用移液槍吸取200 μL,涂布于高氏一號培養(yǎng)基上。置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)2～3 d。純化得到單菌落菌株接種到斜面試管,培養(yǎng)2～3 d后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黑翅土白蟻菌株發(fā)酵液的制取

將純菌株接種到高氏一號液體培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶內(nèi)裝有100 mL液體培養(yǎng)基)中,在搖床220 r/min 30 ℃下振蕩培養(yǎng)7 d。將所得發(fā)酵液用紗布(6～8層)粗過濾后,利用無菌濾膜(直徑0.22 μm)過濾除菌,并保存10 mL發(fā)酵液于已滅菌的離心管中備用。

1.4 抗菌活性測試

采用牛津杯法(Shangetal., 2014; Bernardinietal., 2018)測定發(fā)酵液對白色念珠菌和3種致病細菌的抑制活性。將4種供試菌在牛肉膏蛋白胨(NA)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后,將其培養(yǎng)液稀釋到 3.0×108cfu/mL,涂布到NA固體培養(yǎng)基上。將滅菌后的牛津杯放置于凝固的培養(yǎng)基上,每杯用移液槍吸取并加入100 μL待測發(fā)酵液。以高氏一號液體培養(yǎng)基作為陰性對照,硫酸慶大霉素和兩性霉素B分別作為抗細菌和酵母菌的陽性對照,每組對照重復3次。于37 ℃(細菌)或28 ℃(白色念珠菌)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,用十字交叉法測量抑菌圈的直徑。

1.5 黑翅土白蟻腸道放線菌的鑒定

1.5.1形態(tài)學特征鑒定:將純化好的菌株活化培養(yǎng)3 d后,利用插片法培養(yǎng)放線菌并用封口膜進行封口。30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察其菌落的外部形態(tài)特征。利用光學顯微鏡,觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、孢子絲和孢子,并對菌株進行初步鑒定。根據(jù)其形態(tài)學結(jié)構(gòu),通過鑒定手冊對其進行初步鑒定。

1.5.2分子生物學鑒定:菌株活化后,提取基因組DNA,參照張萍華等(2021)方法進行PCR擴增、測序。將最終所得序列,按相似性高低對目標菌株進行BLAST比對分析,選取不同相似度序列,采用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析,采取鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,同時進行1 000次自舉分析(bootstrap),分析所得的自舉值標記在各分支上,最終確定菌株的分類地位。

1.6 黑翅土白蟻腸道放線菌發(fā)酵液不同極性物質(zhì)的提取及抗菌活性測定

將目標菌株根據(jù)1.3節(jié)的方法制備發(fā)酵液,將制備好的發(fā)酵液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇4種溶劑萃取數(shù)次至萃取液上層無色,將得到的萃取液合并,減壓蒸餾得到不同極性溶劑濃縮粗提物,并對上述粗提物采用濾紙片法確定目標菌株的活性部位(Zhangetal., 2011)。將4種供試菌活化培養(yǎng)1 d后備用,在無菌條件下將其培養(yǎng)液稀釋到 3.0×108cfu/mL后,吸取200 μL涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上。將事先準備好的粗提物以及陽性對照物用丙酮(分析純)溶解,配制成6 mg/mL的溶液,并利用無菌濾膜(直徑0.22 μm)過濾除菌后備用。取事先滅好菌的5 mm濾紙片,每片濾紙片上滴5 μL液體,等丙酮揮干后,貼于已經(jīng)涂布好菌液的固體平板上。將平板倒置,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。每組實驗重復3次,采用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小。

1.7 目標菌株中活性化合物的分離鑒定及其抗菌活性測定

將目標菌株在高氏固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d后接種到高氏一號液體培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶中裝有50 mL液體培養(yǎng)基),在搖床220 r/min 30 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d,取30 mL培養(yǎng)液作為種子液轉(zhuǎn)移到高氏一號液體培養(yǎng)基(1 000 mL錐形瓶中裝有400 mL液體培養(yǎng)基)中,在搖床220 r/min 30 ℃下振蕩培養(yǎng)7 d。 重復上述步驟直到積累到足夠生物量的培養(yǎng)液。

用紗布過濾培養(yǎng)液作為上清液,在室溫下用乙酸乙酯萃取上清液,將萃取后的上清液在真空中蒸發(fā)得到大量發(fā)酵液的粗浸膏。獲得的萃取物先進行硅膠薄層層析(thin layer chromatography, TLC),選擇合適的柱層析洗脫體系,本研究選用CH2Cl2和CH3OH混合溶液體系。粗分選用200～300目硅膠粉裝填硅膠柱。上樣時盡量使樣品在硅膠柱表面分布均勻,用CH2Cl2∶CH3OH體系進行梯度(100∶0, 100∶1, 100∶2, 100∶4, 100∶8和100∶16, v/v)洗脫,200 mL/餾分減壓濃縮干后,用少量CH2Cl2/CH3OH混合溶劑溶解,并進行薄層層析點板,經(jīng)254和365 nm 紫外燈、 5%硫酸乙醇和碘顯色等顯色分析,合并相同組分。較純組分經(jīng)LH-20交聯(lián)葡聚糖色譜柱,以甲醇為洗脫液進行柱層析,硅膠薄層層析點板驗證化合物純度。采用氫核磁共振譜、碳核磁共振譜、質(zhì)譜等多種波譜學技術(shù)測定活性化合物的具體結(jié)構(gòu)。采用濾紙片法和最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)測定單體化合物的抗菌活性(Thomfordetal., 2018)。

2 結(jié)果

2.1 目標菌株的篩選與鑒定

從黑翅土白蟻腸道中共分離純化得到62株腸道放線菌,采用牛津杯法對菌株發(fā)酵液進行抗菌活性測試,結(jié)果表明菌株BYC-18發(fā)酵液對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制效果,抑菌圈直徑分別為(9.2±0.2), (9.3±1.1), (10.3±0.3) 和(11.1±1.0) mm。

根據(jù)目標菌株BYC-18的菌落、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及孢子絲形態(tài)特征(菌落形態(tài)見圖1),通過伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊中所描述的放線菌培養(yǎng)特征進行比較,初步鑒定BYC-18菌株均為鏈霉菌屬Streptomyces的放線菌。進一步提取BYC-18菌株的16S rRNA進行測序并進行比對,發(fā)現(xiàn)BYC-18的序列與鏈霉菌屬S.griseoaurantiacus的16S rRNA序列相似性達98.81%,兩者在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支(圖2),因此,將菌株BYC-18鑒定為鏈霉菌屬菌株Streptomycessp.。

圖1 BYC-18的菌落形態(tài)Fig. 1 Colonial morphology of BYC-18

圖2 采用鄰接法基于16S rRNA序列構(gòu)建的鏈霉菌BYC-18系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Streptomyces BYC-18 constructed with neighbor-joining method based on 16S rRNA sequence每個分支點上的數(shù)字為引導值的支持百分率;標尺代表0.2%的序列差異。The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap. The scale bar indicates 0.002 sequence divergence.

2.2 放線菌BYC-18發(fā)酵液不同極性溶劑萃取物的抗菌活性

黑翅土白蟻腸道放線菌BYC-18發(fā)酵液不同極性溶劑萃取物對4種供試菌抗菌活性測定結(jié)果見表1,從表中可看出BYC-18發(fā)酵液的乙酸乙酯相萃取物對4種供試菌均有抑菌活性,對金黃色葡萄球菌的抑制作用最好,抑菌圈直徑達到(11.1±0.2) mm,其他極性溶劑萃取物活性較差或無活性,因此,目標菌株BYC-18發(fā)酵液的抗菌活性物質(zhì)主要存在于中等極性的乙酸乙酯部位。

表1 BYC-18不同極性溶劑萃取物對白色念珠菌和3種致病細菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 Inhibition zone diameters (mm) of different polar solvent extracts of BYC-18on Candida albicans and three pathogenic bacteria

2.3 放線菌BYC-18活性化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

對BYC-18通過硅膠柱和凝膠柱層析分離,從黑翅土白蟻共生放線菌BYC-18的發(fā)酵液的乙酸乙酯相粗提物中得到1個單體化合物BYC-18-1,TLC分析表明BYC-18-1的比移值為0.41(展開劑CH2Cl2∶MeOH=20∶1)(圖3)。

圖3 BYC-18-1的薄層層析(TLC)(展開劑CH2Cl2∶MeOH=20∶1)Fig. 3 Thin-layer chromatography (TLC) chromatogram of BYC-18-1 (developing solvent CH2Cl2∶MeOH=20∶1)

進一步測得BYC-18-1核磁共振氫譜和碳譜如圖4和圖5所示,單體化合物BYC-18-1是紫色粉末,ESI-MSm/z537[M+H]+,推測其分子式為C27H20O12。 該化合物的波譜數(shù)據(jù)如下:1H NMR(600 MHz, CDC13) δ:12.84 (1H, s, H-8′), 11.06 (1H, s, H-10), 7.46 (1H, s, H-6), 6.94 (1H, s, H-5), 6.76 (1H, s, H-6′), 4.03 (6H, s, 5′-OCH3, 7′-OCH3), 3.98 (3H, s, 7-OCH3), 3.67(1H, d,J=18.9 Hz, H-3′), 3.45 (1H, m, H-4), 3.34 (1H, d,J=18.9 Hz, H-3′), 2.94 (1H, m, H-4), 2.50 (1H, m, H-3), 2.30 (1H, m, H-3);13C NMR (150 MHz, CDC13) δ:181.9 (C-9′), 179.2 (C-4′), 164.9 (C-9), 160.4 (7-COOCH3), 179.2 (C-5′), 155.4 (C-7′), 154.9 (C-9′a), 150.5 (C-10), 149.6 (C-8′), 141.2 (C-7), 141.2 (C-10a), 131.5 (C-4a), 127.4 (C-5a), 127.4 (C-3′a), 118.2 (C -5), 113.5 (C-6), 111.1 (C-2), 114.8 (C-8′a), 110.6 (C-4′a), 106.6 (C-9a), 103.7 (C-6′), 57.1 (7′-OCH3), 56.4 (5(-OCH3), 52.9 (7-OOCH3), 40.1 (C-3′), 29.6 (C-3), 22.2 (C-4)。與尚寧寧等(2017)記載的數(shù)據(jù)對比,確定單體化合物BYC-18-1為β-玉紅霉素(β-rubromycin),其具體化學結(jié)構(gòu)如圖6所示。

圖4 BYC-18-1的氫譜Fig. 4 Hydrogen spectrum of BYC-18-1

圖5 BYC-18-1的碳譜Fig. 5 Carbon spectrum of BYC-18-1

圖6 BYC-18-1的化學結(jié)構(gòu)Fig. 6 Chemical structure of BYC-18-1

2.4 β-玉紅霉素的抗菌活性

β-玉紅霉素的抗菌活性結(jié)果如表2所示。從表中可看出,當供試樣品濃度為30 μg/6 mm濾紙片時,β-玉紅霉素對4種供試菌均有不同程度的抑制作用,特別是對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用,其抑菌圈直徑達到(13.2±0.4) mm,與陽性對照藥物硫酸慶大霉素的抑菌活性[抑菌圈直徑(16.6±0.2) mm]相當;β-玉紅霉素對大腸桿菌也表現(xiàn)出較強的抗菌活性[抑菌圈直徑(9.5±0.4) mm],但比陽性對照硫酸慶大霉素抑制效果[抑菌圈直徑(15.2±0.4) mm]稍弱;對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均表現(xiàn)出較弱的抑菌效果,抑菌圈直徑均小于8 mm。最低抑菌濃度(MIC)活性測試表明β-玉紅霉素對金黃色葡萄球菌的MIC為25.0 μg/mL,比陽性對照差。

表2 β-玉紅霉素對白色念珠菌和3種致病細菌的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activities of BYC-18-1 against Candida albicans and three pathogenic bacteria

抑菌圈直徑測定中供試濃度為30 μg/6 mm濾紙片;硫酸慶大霉素和兩性霉素B分別為3種致病細菌和白色念珠菌的陽性對照;丙酮為3種致病細菌和白色念珠菌的陰性對照。表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。The concentration in inhibition zone diameter test was 30 μg/6 mm filter paper. Gentamicin sulfate and amphotericin B were positive controls for three pathogenic bacteria andC.albicans, and acetone was the negative control for three pathogenic bacteria andC.albicans. Data in the table were mean±SE. MIC: 最低抑菌濃度Minimum inhibitory concentration.

3 討論與結(jié)論

許多研究者將不同昆蟲腸道微生物作為新的抗菌物質(zhì)重要來源之一。李銘輝等(2023)從藥用昆蟲喙尾琵琶甲Blapsrynchopetera腸道中分離得到1株鏈霉菌Streptomycessp.,該菌株乙酸乙酯萃取物對多種病原菌均有抑菌活性,隨后又進一步分離純化其活性成分。同許多昆蟲一樣,黑翅土白蟻腸道中有存在著具有抗菌活性的微生物幫助宿主抵御外來病原菌的入侵。本研究中篩選出的BYC-18發(fā)酵液對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑制效果,抑菌圈直徑均大于9 mm,因此,黑翅土白蟻腸道放線菌BYC-18具有作為微生物源殺菌劑值得進一步研究的價值。

經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定,BYC-18為鏈霉屬Streptomycessp.放線菌,進一步發(fā)現(xiàn)其抗菌活性物質(zhì)主要存在于中等極性的乙酸乙酯相(表1)。在活性跟蹤指導下,經(jīng)凝膠柱層析等多種色譜方法,從目標菌株BYC-18發(fā)酵液的乙酸乙酯相粗提物中分離得到1個單體化合物BYC-18-1(β-玉紅霉素)(圖6),目前已有報道該化合物對多種植物病原真菌的生長均有抑制作用(尚寧寧等, 2017)。本研究發(fā)現(xiàn):當供試濃度為30 μg/6 mm濾紙片時,化合物β-玉紅霉素對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑制活性(表2)。對金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌活性,其抑菌圈直徑達到13.2 mm,與陽性對照藥物硫酸慶大霉素的抑菌活性(抑菌圈直徑16.6 mm)相當;對大腸桿菌也表現(xiàn)出較強的抗菌活性(9.5 mm),但比陽性對照硫酸慶大霉素的抑制效果(抑菌圈直徑15.2 mm)稍弱(表2)。因此β-玉紅霉素可能是放線菌BYC-18的主要抑菌物質(zhì)。單體化合物BYC-18-1作為抗菌先導化合物具有進一步的開發(fā)潛力,至于單體化合物β-玉紅霉素的安全性和活性作用機理,以及其他單體化合物分離鑒定等有待進一步的研究探討。