廖 維,宋 嬌,韓 麗,張定堃

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137

色胺酮(見圖1),化學(xué)名為吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(分子式C15H8N2O2),常溫下呈黃色針狀結(jié)晶。色胺酮屬于吲哚喹唑啉類生物堿,是傳統(tǒng)抗病毒中藥板藍(lán)根和解熱中藥青黛及其藥用植物馬藍(lán)、菘藍(lán)、蓼藍(lán)等的主要成分之一,某些微生物的代謝產(chǎn)物中也能檢測(cè)到[1-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明色胺酮具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒、保護(hù)心血管等多種藥理活性[5]。色胺酮在腫瘤治療、細(xì)菌感染、炎癥損傷、病毒侵害等方面展現(xiàn)出的較高藥用價(jià)值,使之成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)與小鼠毒性試驗(yàn)均證實(shí)其安全性較好[6-8]。本綜述對(duì)色胺酮的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)梳理,綜合分析了色胺酮的來源、藥理作用、藥動(dòng)學(xué)特征、毒性等方面的研究進(jìn)展情況,旨在為色胺酮作用機(jī)制的深入研究提供更多最新、最全面的信息,最終為臨床上色胺酮類藥物的開發(fā)提供新的思路。

圖1 色胺酮的兩種構(gòu)型Fig.1 Two conformations of tryptanthrin

1 色胺酮的來源

1.1 天然植物來源及其生物合成前體

色胺酮的發(fā)現(xiàn)不同于一般天然產(chǎn)物。大多天然產(chǎn)物是先從植物中分離出來,而后對(duì)其進(jìn)行藥理與合成方面的研究。而色胺酮的人工合成比發(fā)現(xiàn)它是一種天然產(chǎn)物早了半個(gè)世紀(jì),但產(chǎn)率極低,致使這個(gè)具有良好藥理活性的小分子化合物在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)無人問津[9]。1997年,Masayuki等[10,11]從兩種蘭科植物Calanthediscolor和C.liukiuensis中分離出了一種糖苷(calanthoside)并發(fā)現(xiàn)其酶水解的主要產(chǎn)物是色胺酮。除菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)等藥用植物外(色胺酮含量分別為0.003%、0.006%、0.001%)[3,4],中藥青黛中也含有色胺酮(0.01%～0.006 5%)[1,2]。此外,色胺酮的含量受產(chǎn)地、采收時(shí)間及處理方式等因素的影響。以中國(guó)福建省為例,12批不同產(chǎn)地的馬藍(lán)中,產(chǎn)于南靖和溪的馬藍(lán)莖、葉中色胺酮總含量最高(244.56 μg/g)[12]。對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期板藍(lán)(Baphicacanthuscusia)中色胺酮的含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)色胺酮的含量變化趨勢(shì)不太穩(wěn)定,整體看來十月份是其采收的最佳時(shí)期[13]。Oberthür等[14]檢測(cè)了不同方法處理后菘藍(lán)中色胺酮的含量,發(fā)現(xiàn)40 ℃烘干葉片中色胺酮含量最高(0.18%～0.33%),冷凍干燥葉片中的含量最低(0.034%～0.055%),其次是室溫干燥葉片(0.06%～0.207%),而經(jīng)發(fā)酵的葉片中色胺酮的含量低于檢測(cè)限。提示色胺酮的產(chǎn)生是一個(gè)后熟過程,干燥和高溫可能促進(jìn)了色胺酮的形成,且該過程是非酶催化的,因?yàn)楹娓蓵?huì)使酶失活而無催化作用。隨后,有研究人員分別用烘干、陰干、凍干三種方法對(duì)馬藍(lán)進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)陰干法處理的馬藍(lán)根、莖、葉中色胺酮含量相對(duì)最高,凍干法處理的色胺酮含量最低[15]。其原因可能是,相對(duì)烘干法和凍干法,陰干法干燥溫度適中,干燥時(shí)間較長(zhǎng),在藥材未完全干透之前有利于色胺酮的后熟,致使其含量升高。

隨后,有學(xué)者探尋了色胺酮在植物體內(nèi)的生物合成前體。分析色胺酮的結(jié)構(gòu),其可能是由靛紅與鄰氨基苯甲酸經(jīng)脫水縮合而成。為此Wang等[9,16]選取了藥用植物菘藍(lán)作為研究對(duì)象,來驗(yàn)證猜測(cè)的正確性。成分檢測(cè)發(fā)現(xiàn),新鮮菘藍(lán)葉片中不含色胺酮,但有靛紅,葉片經(jīng)烘干、晾干或研磨處理后靛紅消失,色胺酮生成。前體追加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,追加靛紅或鄰氨基苯甲酸或者兩者都加均能大幅度提高色胺酮的含量,表明色胺酮與靛紅及鄰氨基苯甲酸存在生源關(guān)系。結(jié)合色胺酮和靛紅分布實(shí)驗(yàn),可以證實(shí)靛紅和鄰氨基苯甲酸是色胺酮的合成前體,同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了色胺酮的形成是化學(xué)催化而非酶催化。此外,關(guān)于植物中莽草酸酯和L-Trp生物合成途徑的現(xiàn)有知識(shí),以及色胺酮的逆生物合成分析表明,鄰氨基苯甲酸和N-甲酰苯胺酸也可能是色胺酮的主要生物合成前體。2018年,Pedras等[17]基于同位素標(biāo)記化合物中氘的引入,通過HPLC-DAD-ESI-MS對(duì)青黛葉片提取物進(jìn)行分析,并使用ESI-MS光譜的峰值強(qiáng)度確定了各代謝物中摻入同位素的百分比。該同位素標(biāo)記化合物并入色胺酮的總體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鄰氨基苯甲酸和N-甲酰氨基苯甲酸是色胺酮主要的生物合成前體(見圖2)。

圖2 色胺酮的生物合成Fig.2 The biosynthesis of tryptanthrin

1.2 微生物途徑

除植物來源外,還能通過微生物發(fā)酵的方法獲得色胺酮。1971年,Schindler等[18]首次從過量L-色胺酸培養(yǎng)的解脂假絲酵母代謝產(chǎn)物中分離出了色胺酮。此外,擔(dān)子菌屬裂褶菌的發(fā)酵液、海洋微生物和大型生物中也能分離得到色胺酮及其衍生物[19]。有學(xué)者利用HPLC-DAD和LC-MS結(jié)合的方法,從海洋鏈霉菌Streptomycessp.B9173次級(jí)代謝產(chǎn)物中成功分離出了色胺酮[20]。隨后,Utkina等[21]從假儉魚中也分離得到色胺酮的衍生物ophiuroidine 1,這是首個(gè)在海洋無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的吲哚喹唑啉生物堿的例子,光譜數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為4,8,9-三羥基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮。微生物代謝產(chǎn)物中色胺酮的發(fā)現(xiàn),可為色胺酮的合成生物學(xué)和代謝工程的研究提供新思路,以建立一個(gè)強(qiáng)有力的生物合成途徑,來滿足日益增長(zhǎng)的需求。但目前天然產(chǎn)物在微生物宿主中的生物合成仍面臨挑戰(zhàn),還需進(jìn)一步研究,發(fā)展更新穎的合成生物學(xué)技術(shù),進(jìn)一步提升色胺酮生物合成的綜合效率。

1.3 人工合成

色胺酮在植物和微生物中含量極低,目前市場(chǎng)上主要通過人工合成獲得色胺酮,眾多合成方法如下[22-28](見圖3)。最初是通過靛紅自身反應(yīng)得到色胺酮。陰極還原、高錳酸鉀水溶液處理或POCl3處理靛紅均能得到色胺酮,但存在產(chǎn)率低、反應(yīng)條件不夠溫和等問題[22]?，F(xiàn)最常用的方法是以靛紅和靛紅酸酐為初始底物合成色胺酮。靛紅和靛紅酸酐可在三乙胺的作用下,直接發(fā)生親核進(jìn)攻和分子內(nèi)的縮合脫水反應(yīng),以更簡(jiǎn)潔的步驟得到色胺酮[24]。為提高實(shí)用性,Wang等[25]開發(fā)了一種新的色胺酮合成路徑,先將靛紅氧化成靛紅酸酐,再將靛紅酸酐與靛紅在堿性條件下得到目標(biāo)產(chǎn)物,實(shí)現(xiàn)了無需催化劑參與、原子利用率高的合成目標(biāo),大大降低了反應(yīng)成本,具有潛在應(yīng)用價(jià)值。此外,以鄰氨基苯甲酸為底物,在二氯亞砜、羥胺和水等作用下,與靛紅發(fā)生環(huán)化也能得到色胺酮,產(chǎn)率可達(dá)85%[26]。隨后,Jia等[28]以靛紅和脒鹽作為底物,在室溫條件下,發(fā)展了一例TBHP/K3PO4協(xié)同促進(jìn)的氧化環(huán)化策略,可用于合成喹唑啉酮類衍生物。相同的條件下,在缺少脒鹽底物時(shí),靛紅極易發(fā)生自聚得到天然產(chǎn)物色胺酮,這為色胺酮的綠色合成提供了一條極具利用價(jià)值的新途徑。

圖3 色胺酮的合成途徑Fig.3 The synthetic pathway of tryptanthrin

2 藥理作用

2.1 抗腫瘤作用

色胺酮類化合物是一種芳香烴受體激動(dòng)劑,也是一種有效的IDO-1抑制劑,有成為抗腫瘤藥物的潛力[29]。天然產(chǎn)物色胺酮低毒性、強(qiáng)抗腫瘤活性的特點(diǎn)使之成為新藥開發(fā)研究的熱點(diǎn)之一,其抗腫瘤的作用機(jī)制也不斷被發(fā)現(xiàn)(見圖4)。

圖4 色胺酮的抗腫瘤作用Fig.4 The antitumor effects of tryptanthrin

2.1.1 白血病

青黛,在中國(guó)被廣泛用于白血病的治療,色胺酮作為青黛的活性成分也被證實(shí)具有抗白血病的作用。研究表明,色胺酮在體外對(duì)多種人類白血病細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用,低濃度的色胺酮(0.5 μg/mL)可誘導(dǎo)人類白血病細(xì)胞U-937分化為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞,HL-60細(xì)胞分化為骨髓細(xì)胞/單核細(xì)胞,并增強(qiáng)CD11b的表達(dá);高濃度的色胺酮(10 μg/mL)則可能通過caspase-3/Fas抗原途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。色胺酮在體外對(duì)人白血病細(xì)胞株K562也具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用,且呈一定的濃度(3.12～50 mg/L)和時(shí)間(24～72 h)依賴性。相關(guān)分子機(jī)制可能是,一方面通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax基因及蛋白的表達(dá)、降低線粒體跨膜電位、促使Cyt-c釋放至胞漿,刺激下游分子caspase-3的活化引起K562細(xì)胞發(fā)生凋亡;另一方面通過抑制融合基因bcr/abl及蛋白的表達(dá),抑制K562細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),K562-SCID小鼠口服色胺酮(50 mg/kg)后病理癥狀得到明顯改善,髓組織中異型細(xì)胞明顯減少,脾臟淤血癥狀減輕,肝臟、肺、腎臟組織中淋巴細(xì)胞明顯減少,表明色胺酮對(duì)白血病具有治療作用[31,32]。在同系BALB/c小鼠體內(nèi),腹腔注射色胺酮(0.08、0.16 mg/kg)后,小鼠粒單核細(xì)胞白血病WEHI-3B JCS細(xì)胞的生長(zhǎng)得到顯著抑制,其作用機(jī)制可能與引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞分化有關(guān)[33]。

在人類和小鼠白血病細(xì)胞系如HL-60、U-937、K-562和WEHI-3B JCS,均證明色胺酮具有類似的抗增殖作用,表明其對(duì)白血病細(xì)胞的抗增殖作用不是物種或細(xì)胞系特異性的。提示色胺酮具有成為一種新的、有效的預(yù)防或治療白血病的先導(dǎo)化合物的潛力。

2.1.2 肝癌

色胺酮不僅能減緩氧化應(yīng)激給肝臟帶來的危害,對(duì)肝癌細(xì)胞也有抑制作用?，F(xiàn)普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激是人體一種最基本的保護(hù)機(jī)制,但過度的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷,引起高血壓、糖尿病、心血管等疾病。過度氧化應(yīng)激是肝臟發(fā)病的病理生理基礎(chǔ),可通過減少氧化應(yīng)激或提高肝臟的抗氧化能力減少氧化應(yīng)激帶來的危害。Moon等[34]發(fā)現(xiàn)色胺酮能有效抑制叔丁基過氧化氫(tBHP)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,使人肝細(xì)胞源性HepG2細(xì)胞免受氧化損傷和凋亡,包括活性氧(ROS)的產(chǎn)生、線粒體膜電位(MMP)的改變和細(xì)胞死亡,這種抑制可能與通過ERK/Nrf2途徑上調(diào)HO-1和GCLC蛋白表達(dá)有關(guān)。色胺酮還可抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)發(fā)揮抗肝癌的作用。HGF在腫瘤的侵襲、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面起著重要作用,與健康人相比肝癌患者體內(nèi)HGF的表達(dá)明顯增加。具體而言,色胺酮對(duì)表皮成纖維細(xì)胞中的多種HGF誘導(dǎo)劑具有強(qiáng)烈的抑制作用,如乙酸肉豆蔻佛波醇酯(PMA)、表皮生長(zhǎng)因素(EGF)、血小板生長(zhǎng)因素(PDGF)和基本的纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因素(bFGF)。與此同時(shí),色胺酮可有效抑制EGF、PDGF和bFGF誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖,且無毒副作用。但色胺酮不能減弱因PMA誘導(dǎo)引起的MAPK磷酸化作用,表明色胺酮抑制HGF的產(chǎn)生可能是通過MAPK活化的下游過程來實(shí)現(xiàn)的[9]。Liang等[35]在篩選抗腫瘤藥物過程中發(fā)現(xiàn),色胺酮呈劑量依賴性(3～50 mg/mL)抑制人肝癌細(xì)胞BEL 7402的體外增長(zhǎng),當(dāng)濃度為50 mg/L時(shí)抑制率可達(dá)88.02%。進(jìn)一步用半數(shù)抑制濃度(8.2 μg/mL)的色胺酮培養(yǎng)1、3、5天后,BEL-7402細(xì)胞端粒酶活性A值分別為0.381、0.276和0,而未經(jīng)藥物處理的肝癌細(xì)胞A值為1.60,表明色胺酮能抑制BEL-7402細(xì)胞的端粒酶活性,且抑制效果隨色胺酮作用時(shí)間增加而增加。此外,集落形成實(shí)驗(yàn)也表明色胺酮具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。上述研究表明,色胺酮在肝癌的預(yù)防、治療與康復(fù)全過程均能發(fā)揮功效,且毒性較低,具有開發(fā)成抗肝癌新藥的前景。但上述研究均為細(xì)胞實(shí)驗(yàn),目前還缺乏體內(nèi)試驗(yàn)來證明色胺酮抗肝癌的有效性和安全性,因此還需要對(duì)色胺酮進(jìn)行深入地研究,以充分發(fā)揮其抗腫瘤活性。

2.1.3 乳腺癌

乳腺癌是全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,其術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率極高,化療也易出現(xiàn)不同程度的副作用,如神經(jīng)毒性、肝腎功能損傷、胃腸道反應(yīng)等。因此從中藥中尋找療效好、毒副作用低的乳腺癌術(shù)后和放化療輔助藥物,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。色胺酮能上調(diào)E-cadherin蛋白水平、下調(diào)MMP-2和Snail在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá),從而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,還能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)化。4T1乳腺癌小鼠灌胃色胺酮(25、50、100 mg/kg)后,食欲更好,肢體運(yùn)動(dòng)范圍更大,腫瘤生長(zhǎng)得到顯著抑制,且不會(huì)引起體重和臟器系數(shù)的波動(dòng)(P>0.05)。相關(guān)的藥理機(jī)制是下調(diào)小鼠腫瘤組織中NOS1、COX-2和NF-κB P65蛋白的表達(dá),上調(diào)小鼠血清中IL-2和TNF-α,并恢復(fù)小鼠血清IL-10水平[56]。進(jìn)一步的Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示色胺酮可能通過調(diào)節(jié)與炎癥相關(guān)的蛋白發(fā)揮抗小鼠體內(nèi)4T1乳腺癌的作用,與之密切相關(guān)的差異表達(dá)蛋白包括上調(diào)CD14、PTGS2,泛素蛋白連接酶E3和下調(diào)CD44、HSPA1A、MIF、NF-κB、RPS6KA4、HMGB1[36,37]。MAPK途徑在乳腺癌的增殖、生長(zhǎng)和化療耐藥中起著重要作用,參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。為考察色胺酮能否通過MAPK信號(hào)通路對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響,Zhou等[38]將色胺酮與MAPK抑制劑PD98059、SB203580和SP600125聯(lián)合使用對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行處理。結(jié)果顯示,單獨(dú)給予色胺酮處理后MCF-7細(xì)胞活力明顯下降,細(xì)胞中p-ERK、p-p38 MAPK和p-JNK蛋白表達(dá)均有增加的趨勢(shì);而聯(lián)合給予色胺酮和不同濃度的MAPK通路抑制劑后,細(xì)胞的增殖活力均有不同程度的上升,細(xì)胞中p-ERK表達(dá)有所下降,p-p38 MAPK和p-JNK表達(dá)變化不明顯。提示色胺酮對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用可能與MAPK信號(hào)通路激活有關(guān),與ERK以及JNK通路的關(guān)系尤為密切。此外,Yu等[39]驚喜地發(fā)現(xiàn)色胺酮具有下調(diào)多藥耐藥性(MDR)的功能,通過下調(diào)MDR1基因的表達(dá),發(fā)揮逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥株耐藥性的作用。相對(duì)于人體內(nèi)其他細(xì)胞而言,癌細(xì)胞生長(zhǎng)同樣需要適應(yīng)的環(huán)境,于是Zeng等[36]將目光投向癌癥與人體微環(huán)境之間的聯(lián)系—腫瘤微環(huán)境。結(jié)果表明,在體內(nèi)和體外,色胺酮均能通過調(diào)節(jié)腫瘤炎癥微環(huán)境發(fā)揮抗乳腺癌作用。

綜上所述,色胺酮能從多個(gè)方面抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,主要機(jī)制是:抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)凋亡,調(diào)節(jié)腫瘤炎癥微環(huán)境等。此外,色胺酮還表現(xiàn)出較好的MDR逆轉(zhuǎn)作用,且安全性較好。鑒于此,可考慮將色胺酮與臨床常用的某些一線化療藥物聯(lián)用,增強(qiáng)療效的同時(shí)克服耐藥。

2.1.4 皮膚癌

皮膚癌可分為基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤三大類,多發(fā)于臉頰、鼻部、眼瞼皮膚等長(zhǎng)期暴露于陽光的部位。其中黑色素瘤僅占皮膚癌總體的2%,但其惡性程度高,侵襲、遷移能力強(qiáng),傳統(tǒng)的放化療治療效果不理想。早在1985年便有報(bào)道稱色胺酮對(duì)黑色素瘤細(xì)胞株B16有抑制作用[40]。Jayesh等[41]也發(fā)現(xiàn)從藥用植物Wrightiatinctoria(Roxb.) R.Br.葉子中分離出來的半純化組分DW-F5在體外和體內(nèi)均能阻斷黑色素瘤生長(zhǎng)。光譜分析表明,DW-F5由色胺酮、一種芳香化合物和一種未經(jīng)鑒定的脂肪族成分組成。此外,Shankar等[42]還研究了色胺酮對(duì)非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)的作用,并用瑞士白化小鼠皮膚癌變模型對(duì)色胺酮的功效進(jìn)行評(píng)估。在小鼠模型中,色胺酮(0.5、1 mg)成功地使腫瘤發(fā)病率、大小和多樣性大幅度減少。經(jīng)色胺酮處理后,小鼠毛囊細(xì)胞增殖和擴(kuò)張受阻,表皮細(xì)胞中炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤(rùn)減少,β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1和c-Myc表達(dá)降低,但未觀察到小鼠皮膚或腫瘤中細(xì)胞凋亡水平的顯著變化。其機(jī)理是通過抑制炎癥和阻止毛囊細(xì)胞中的β-catenin和相關(guān)信號(hào)通路來抑制皮膚癌的發(fā)生,從而阻止其擴(kuò)張和隨后的腫瘤發(fā)展。

2.1.5 腸癌、食管癌

色胺酮對(duì)一些較為常見的消化道惡性腫瘤如腸癌和食管癌也有一定的治療效果。Koya等[43]研究了口服色胺酮對(duì)azoxymethy(AOM)誘發(fā)的F344大鼠腸腫瘤的影響。結(jié)果顯示色胺酮組(50 mg/kg BW)小腸腫瘤發(fā)生率低于AOM對(duì)照組(5% versus 26%),表明色胺酮能降低腸道腫瘤的發(fā)生率,對(duì)腸癌有預(yù)防作用。順氯氨鉑(cDDP)是食管癌后期化療的主要藥物,但其耐藥性的產(chǎn)生極大地影響了化療效果。Huang等[44]發(fā)現(xiàn)色胺酮(16 mg/L)能增強(qiáng)順鉑對(duì)癌細(xì)胞的敏感度,抑制MDR1和GST-pi基因的表達(dá)逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞順鉑耐藥株Eca109/cDDP的耐藥性,表明色胺酮一種潛在的食管癌術(shù)后化療輔助藥物。

2.1.6 神經(jīng)母細(xì)胞瘤

神經(jīng)母細(xì)胞瘤主要起源于腎上腺,是兒童期最常見的顱外實(shí)體瘤,約占所有兒童癌癥的10%。傳統(tǒng)的放化療會(huì)有殘留病變、局部復(fù)發(fā)以及不良反應(yīng)出現(xiàn)的可能,因此對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療仍是兒科腫瘤學(xué)面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)[45]。為尋找更安全有效的藥物,研究人員用N-myc擴(kuò)增技術(shù)研究了色胺酮在體外對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞LA-N-1細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響。結(jié)果表明色胺酮對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有劑量(0～30 μmol/L)和時(shí)間(24、48、72 h)依賴性。其機(jī)制可能是誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期;增強(qiáng)乙酰膽堿酯酶活性和誘導(dǎo)LA-N-1細(xì)胞向神經(jīng)元分化;降低LA-N-1細(xì)胞中N-myc的表達(dá)[46]。

2.2 抗炎

自古以來菘藍(lán)便有治療刀傷、潰爛、蛇咬、痔瘡等炎癥的記載,現(xiàn)多用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮炎、哮喘、結(jié)腸炎等疾病[47]。作為菘藍(lán)的活性成分,色胺酮的抗炎作用也不容忽視(見圖5)。體外實(shí)驗(yàn)證明,色胺酮能抑制與炎癥相關(guān)的因子如NO、PGE2、PG、LTs的合成影響炎癥的反應(yīng)進(jìn)程[48,49]。此外,色胺酮(1～10 mmol/L)還能抑制肥大細(xì)胞的增殖,有用于治療肥大細(xì)胞介導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎的潛能。其作用機(jī)制是:抑制胸腺基質(zhì)淋巴生成素刺激的HMC-1細(xì)胞中Ki67、MDM2和IL-13的表達(dá);增加HMC-1細(xì)胞中PARP和caspase3的表達(dá);降低TSLP誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生和IL-7Ra/TSLPR mRNA表達(dá)[50]。另一細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),色胺酮(10 mmol/L)可抑制LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1b、iNOS、NO、COX-2和PGE2)的過度生成和TLR4和MyD88蛋白的表達(dá),發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥的作用,這與色胺酮促使NF-κB通路失活,抑制p38 MAPK途徑的激活有關(guān)[6,51]。

圖5 色胺酮的抗炎作用Fig.5 The anti-inflammatory effect of tryptanthrin

2.3 抗菌

抗生素的濫用導(dǎo)致多重耐藥、泛耐藥菌株不斷增加,可供臨床選擇的抗生素越來越局限。研發(fā)新型抗生素的周期較長(zhǎng),故從天然植物中挖掘毒副作用小的活性成分逐漸成為現(xiàn)代抗菌藥物研究的熱點(diǎn)。色胺酮是菘藍(lán)根抗菌作用的有效成分,且在體內(nèi)外均有一定的抗菌作用。在體外,色胺酮能夠呈劑量依賴性抑制幽門螺桿菌(1.0～10 μg/mL),濃度為10 μg/mL時(shí)菌落形成被完全抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與溶劑對(duì)照組比,口服色胺酮(5 mg/只)能顯著抑制蒙古沙土鼠胃中的細(xì)菌菌落。此外,色胺酮與克拉霉素聯(lián)用時(shí)還能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng),為降低抗生素的使用劑量提供可能性,從而減輕副作用[52]。色胺酮(亞-MIC 2 μg/mL)對(duì)霍亂弧菌也有較好的抑制作用,其靶點(diǎn)為群體感應(yīng)(Quorum sensing)調(diào)節(jié)蛋白LuxO。溶血性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),色胺酮在12 h內(nèi)溶血率至少為0.72%,在第12 h至少為2.78%(溶血<10%通常被認(rèn)為是安全的),說明其亞-MIC濃度為非溶血性[7]。色胺酮對(duì)霍亂弧菌的抑制作用較好、且無溶血性,因此可以考慮將色胺酮與抗生素聯(lián)用,用于治療霍亂。色胺酮還能有效抑制各種肺結(jié)核菌株,其對(duì)結(jié)核分枝桿菌MTB H37Rv、M avium和M smegmatis具有較好的抑制活性,最小抑制濃度分別為1、4、6 mg/L,同時(shí)對(duì)多藥耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株仍能保持較強(qiáng)抑制作用[53]。不僅如此,與空白組相比色胺酮(6.25～25 μg/mL)對(duì)革蘭氏陽性致齲菌和革蘭氏陰性厭氧牙周病菌均有顯著抑制作用,因此色胺酮還用于齲齒和牙周病的防治[54]。

色胺酮對(duì)許多真菌也表現(xiàn)出良好的抑制作用。隱球菌可從樹木和鳥類排泄物中分離出來,多通過散布在空氣中的繁殖體引起感染,并伴隨著誘發(fā)腦膜炎、肺炎等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。目前,隱球菌病是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的動(dòng)物真菌病之一。一項(xiàng)關(guān)于中東地區(qū)隱球菌感染的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),其在伊朗的樹木,鳥糞,動(dòng)物和人類中的總體流行率分別估計(jì)為4.7%、20.4%、1.7%和2.8%[55]。研究表明在30 ℃時(shí),鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑FK506和環(huán)孢霉素A誘導(dǎo)了色胺酮的抗隱球菌活性,最低抑菌濃度為2 μg/mL。值得注意的是,高溫環(huán)境中色胺酮仍能具有較強(qiáng)的抗隱球菌活性,具體表現(xiàn)在調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞周期蛋白的基因和新生隱球菌孢子蟲的SBF/MBF復(fù)合物(CLN1、MBS1、PCL1和WHI5)的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G/S期。對(duì)新生隱球菌孢子蟲突變體數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選進(jìn)一步揭示了色胺酮與多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和信號(hào)通路有關(guān),如鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Pmc1)和蛋白激酶a信號(hào)通路。提示色胺酮通過干擾細(xì)胞周期和信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)隱球菌產(chǎn)生了抗菌活性[56]。此外,色胺酮對(duì)犬小孢子菌、須毛癬菌、紅色癬菌、紫色癬菌、斷發(fā)癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣癬菌、石膏樣小孢子菌、羊毛狀小孢子菌等皮膚類真菌也有較好的抑制效果[4]。

上述研究表明色胺酮具有活性強(qiáng),抗菌譜廣的特點(diǎn)。色胺酮抗菌作用的發(fā)現(xiàn)為一些復(fù)雜致病菌的治療提供了新思路?？煽紤]單獨(dú)使用色胺酮,或?qū)⑵渑c其它抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用達(dá)到預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病的目的。接下來還需對(duì)色胺酮的抗菌機(jī)制和科學(xué)合理使用進(jìn)行深入研究,以期研發(fā)出以色胺酮為有效成分的抗菌新藥。

2.4 抗病毒作用

在短短20年間,冠狀病毒已經(jīng)引發(fā)了包括COVID-19、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)在內(nèi)的3次傳染病大流行,給人類的健康帶來了極大的危害。盡管冠狀病毒具有極高的物種多樣性,但它們共享著關(guān)鍵的基因組元素,可依據(jù)病毒基因組信息和生物信息學(xué)特征指引發(fā)現(xiàn)潛在的有效藥物[57]。人冠狀病毒NL63(HCoV-NL63)是一種呼吸道病原體,感染后可引起上、下呼吸道感染,在兒童及免疫力低下的人群中的感染率較高。Tsai[58]等發(fā)現(xiàn)Strobilanthescusia(Nees) Kuntze葉的甲醇提取物能有效抑制HCoV-NL63感染細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)和病毒產(chǎn)量,IC50為0.64 μg/mL,并確定其關(guān)鍵活性成分是色胺酮。在LCC-MK2和Calu-3細(xì)胞中,色胺酮表現(xiàn)出與細(xì)胞類型無關(guān)的抗HCoV-NL63活性,IC50分別為1.52 μmol/L和0.30 μmol/L。免疫熒光染色的感染性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在兩種模式下,色胺酮阻止HCoV-NL63復(fù)制的早期(IC50=0.32 μmol/L)和晚期(IC50=0.06 μmol/L),特別是阻斷病毒RNA基因組的合成和類木瓜樣蛋白酶2的活性。此外,色胺酮(IC50=0.06 μmol/L)還表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺病毒活性。值得注意的是,HCoV-NL63棘突蛋白(S蛋白)靶向ACE2受體,顯示出與SARS-CoV和SARS-CoV-2高度保守的序列和結(jié)構(gòu)相似性,提示色胺酮有可能被作為一種生物活性劑來對(duì)抗SARS-CoV-2和其他人類冠狀病毒。3CLpro是冠狀病毒復(fù)制所必需的酶,也是SARS-CoV-2最具特征的藥物靶點(diǎn)之一,因此尋找以3CLpro為靶點(diǎn)的抑制劑對(duì)于COVID-19的防治具有重要意義[59]。Narkhede等[60]篩選出了包括甘草酸、色胺酮、大黃酸和小檗堿等在內(nèi)的12種能發(fā)揮抗SARS-CoV-2感染作用的潛在候選藥物。分子對(duì)接結(jié)果顯示,色胺酮與3CLpro結(jié)合的親和力是-8.2 kcal/mol,通過與GLN 110形成兩個(gè)氫鍵以及與ILE 106、VAL 104的pi-alkyl烷基相互作用以及與ARG 105、GLN 107、THR 111、THR 292、PHE 294、ASP 153和SER 158的幾種范德華相互作用。它遵循利賓斯基的五定律,顯示出良好的藥物性質(zhì),沒有任何違反,提示色胺酮可用于抗COVID-19的探索性研究。

不僅如此,色胺酮對(duì)流感病毒也有潛在的預(yù)防作用。流感病毒分為甲、乙、丙三型,其中甲型流感病毒(IVA)最容易發(fā)生變異,流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的。Xu等[61]對(duì)不同的IVA株,包括野生型和抗藥性IVA株,進(jìn)行了細(xì)胞病變作用還原試驗(yàn)(CEP)。意外地發(fā)現(xiàn)在A/Minfang/151/2000(野生型H3N2)病毒感染前給犬腎細(xì)胞注射色胺酮,其IC50=76.33±3.4 μmol/L與奧司他韋(IC50=54.45±14.24 μmol/L)和利巴韋林(IC50=62.45±16.24 μmol/L)相似,表明色胺酮對(duì)野生型IAV具有保護(hù)作用。神經(jīng)氨酸酶(NA)是一種分布于流感病毒被膜上的糖蛋白,具有抗原性,能促進(jìn)新生病毒的釋放。Zhang等[62]采用分子對(duì)接試驗(yàn)研究了色胺酮對(duì)兩種流感病毒NA活性的影響(PDB密碼分別為3ti6和4mww)。發(fā)現(xiàn)色胺酮以顯著的結(jié)合能抑制NA(對(duì)3ti6編碼的結(jié)合能為-8.07 kcal/mol,對(duì)編碼4mww的NA的結(jié)合能為-7.52 kcal/mol),甚至優(yōu)于奧司他韋(對(duì)3ti6編碼的結(jié)合能為-5.92 kcal/mol,對(duì)編碼4mww的NA的結(jié)合能為-7.12 kcal/mol),這表明色胺酮可有效地抑制NA,從而產(chǎn)生抗病毒作用。色胺酮可作為抗流感病毒的候選化合物,但還需進(jìn)一步研究其體內(nèi)功效、機(jī)制和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。

2.5 保護(hù)心臟

色胺酮可通過改善心肌缺血發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈所致心肌缺血大鼠在灌胃色胺酮(0.10 g/kg)后,心肌收縮能力增強(qiáng),心肌舒張順應(yīng)性得到改善,左心室內(nèi)收縮壓LVSP和左心室內(nèi)壓最大變化速率±dp/dtmax明顯增高,與模型組比有明顯差異(P<0.05)。病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),給予色胺酮治療后心肌組織肌間隙纖維增生、慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)和灶性壞死狀況均有一定改善,說明色胺酮對(duì)缺血心肌損傷有保護(hù)作用。但隨給藥劑量的增大,其對(duì)心肌的保護(hù)作用反而減弱,不呈量效依賴關(guān)系。這可能與色胺酮?jiǎng)┝吭黾?其對(duì)COX-2蛋白的抑制增強(qiáng),導(dǎo)致副作用增大有關(guān)[63]。

2.6 抗血管生成

抗血管生成治療是一種通過血管生成抑制劑阻斷促血管生成因子,靶向抑制腫瘤血管生成的一種治療方法。血管生成因子眾多,常見的有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、肝素、前列腺素E1/E2等。細(xì)胞試驗(yàn)表明,色胺酮(50 μmol/L)能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,抑制細(xì)胞增殖,這是通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中apelin的表達(dá)、抑制apelin啟動(dòng)子活性和縮短mRNA半衰期來實(shí)現(xiàn)的[64]。色胺酮還能阻斷PKB或Akt和FAK途徑,使血管內(nèi)皮細(xì)胞G2/M期阻滯,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管。在mRNA和蛋白質(zhì)水平上,色胺酮(0～50 μmol/L)能呈劑量依賴性地降低細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK1和CDK2的表達(dá)。值得注意的是,該研究是在原代血管內(nèi)皮細(xì)胞用色胺酮預(yù)處理24 h后進(jìn)行的,并且在沒有色胺酮的情況下進(jìn)行遷移和成管實(shí)驗(yàn),提示色胺酮具有持續(xù)的抑制作用。

3 藥物動(dòng)力學(xué)特征

藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)是篩選新藥的重要指標(biāo)之一,為給色胺酮的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供依據(jù),學(xué)者們對(duì)色胺酮的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究。Zhu等[65]對(duì)色胺酮(0.8～20 μmol/L)在Caco-2細(xì)胞中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)特性進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)在該濃度范圍內(nèi)色胺酮的吸收型Papp(AP→BL)和分泌型Papp(BL→AP)均無顯著變化,表明色胺酮的轉(zhuǎn)運(yùn)不受濃度的影響;Papp(AP→BL)/Papp(BL→AP)大于1,表明色胺酮能被很好地吸收且以被動(dòng)擴(kuò)散為主;外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp和MRP2抑制劑的加入幾乎不影響色胺酮(4 μmol/L)的Papp,表明其外排不受P-gp和MRP2抑制劑的影響。

Zhang等[66]研究了色胺酮(80 mg/kg)在昆明小鼠體內(nèi)的分布情況。小鼠灌胃2.5 h后,肝臟中色胺酮含量最高(3.54 g/g),其次是腎臟(2.12 g/g),肺(1.46 g/g),提示色胺酮與這些組織可能存在一定的關(guān)聯(lián)和靶向性;腦中含量最低(<0.2 g/g),提示色胺酮可能難以穿過小鼠血腦屏障。小鼠灌胃第12 h的Cmax是第1.5 h的Cmax的四十八分之一,表明色胺酮在體內(nèi)無明顯蓄積。雄性SD大鼠體內(nèi)初步藥代動(dòng)力學(xué)研究表明,色胺酮(2 mg/kg BW i.v.)的半衰期為40.63±6.66 min,清除率為1.00±0.36 L/(h·kg)[67]。隨后,Wu等[68]研究了色胺酮在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。SD大鼠尾靜脈注射色胺酮(75 mg/kg)后,t1/2β為2.193 h,AUC(0-∞)為4.616 mg/(L·h),V1為33.794 L/kg,CL為29.76 L/(h·kg)。上述研究表明,色胺酮在體內(nèi)具有吸收迅速、分布廣泛、代謝較快等特點(diǎn),但還需進(jìn)一步研究其作用靶點(diǎn)、代謝途徑,為色胺酮的臨床應(yīng)用提供更多可靠的數(shù)據(jù)。

4 毒性

大量細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明,色胺酮不具直接毒性。Lee等[6]研究了色胺酮(2.5～20.0 μmol/L)對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響,MTT結(jié)果顯示在沒有或存在LPS的情況下色胺酮均無細(xì)胞毒性。此外,顯微鏡下的形態(tài)學(xué)評(píng)估發(fā)現(xiàn)經(jīng)色胺酮(2 μg/mL)處理的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HEK-293細(xì)胞顯示出與PBS陰性對(duì)照組相似的紡錘形健康細(xì)胞,該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了色胺酮非細(xì)胞毒性的特點(diǎn)[7]。急性毒性研究表明,小鼠灌胃色胺酮(25、50、80 mg/kg)后,體重略有減輕,但未見其他異常,無死亡。隨后,按同劑量連續(xù)給藥30 d,進(jìn)行亞急性毒性研究。試驗(yàn)期間動(dòng)物的一般指標(biāo),如外觀、行為、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物排泄物等均無顯著異常,且未見小鼠死亡。小鼠臟器,如心、肝、脾、肺、腎、大腦等未見異常,臟器系數(shù)和空白對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示,色胺酮毒性較低,安全性較好,是一種很有前途的替代療法藥物[8]。

5 總結(jié)

色胺酮的天然來源十分廣泛,在藥用植物馬藍(lán)、菘藍(lán)、蓼藍(lán)中均能分離得到色胺酮?，F(xiàn)已證實(shí)色胺酮是一種后熟產(chǎn)物,且其合成過程是非酶催化的。色胺酮還是某些微生物如解脂假絲酵母、裂褶菌、海洋鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物。然而,自然界中色胺酮的含量很低,且存在提取工藝繁瑣、分離過程費(fèi)時(shí)、提取率低等問題。因此色胺酮的化學(xué)合成是當(dāng)前研究的熱點(diǎn),靛紅和靛紅酸苷是常用的合成原料。與直接從植物中提取色胺酮相比,人工合成提高了色胺酮的產(chǎn)率,但合成路線較為繁瑣,反應(yīng)條件較為苛刻,僅適用于實(shí)驗(yàn)室少量合成。若想大規(guī)模生產(chǎn),還需探索更簡(jiǎn)捷、低成本的人工合成方法及工藝,色胺酮的仿生合成可作為未來的研究方向。

眾多藥理實(shí)驗(yàn)表明,色胺酮具有良好的抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性,且毒副作用低。色胺酮具有的藥理作用及在腸道中易于被吸收的特點(diǎn)使其在疾病的預(yù)防與治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而,現(xiàn)今有關(guān)色胺酮的報(bào)道僅限于體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn),具有局限性,未來還需足夠的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為有力支撐,如何充分利用、開發(fā)具有市場(chǎng)價(jià)值的色胺酮類化合物產(chǎn)品,將會(huì)是今后的研究重點(diǎn)。