張 嵐,吳偉菁,余亞選

(廈門(mén)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系,福建 廈門(mén) 361023)

鈦合金材料具有高斷裂韌度和抗彎折強(qiáng)度等性能,能夠作為替代人牙硬質(zhì)的重要口腔植入材料,在口腔鈦種植體表面制備功能性羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]涂層成為研究的熱點(diǎn)[1-3],納米HA作為骨和牙硬組織相類似的化學(xué)和物理特性,常用于骨再生替換材料,具有良好的生物相容性,能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞在涂層表面粘附和成骨分化,也是目前作為種植體材料表面改性的重要材料[4-6],但是羥基磷灰石本身抗菌性較差,作為改性涂層仍然會(huì)出現(xiàn)植入感染及其與鄰近骨連接的缺失,這些并發(fā)癥可導(dǎo)致組織愈合時(shí)間延長(zhǎng)甚至種植治療的失敗[7]。Inga Grigoraviciute-Puroniene等[8]采用溶膠凝膠法制備Ca10(PO4)6(OH)2∶Ag粉體,但得到的晶體是微米級(jí)顆粒相比于納米HA顆粒在生物活性方面較差。Umit Erdem等[9]在牙本質(zhì)表面浸涂摻雜銀羥基磷灰石材料,使牙本質(zhì)小管充滿HA-Ag材料,具有較好的抗過(guò)敏、抗菌性和生物相容性用于治療齲齒,但是浸涂層均勻性較差,兩者均未涉及到種植體表面的應(yīng)用,適用范圍小。

文章采用水熱法預(yù)制納米Ca10(PO4)6(OH)2∶Ag粉體,使用TEM、FTIR、XRD表征其成分、組成,采用電泳沉積法[6]在口腔用種植體鈦表面沉積均勻Ca10(PO4)6(OH)2∶Ag涂層,涂層燒結(jié)處理后預(yù)期得到致密納米Ca10(PO4)6(OH)2∶Ag涂層,對(duì)改性后的鈦表面沉涂層進(jìn)行體外成骨細(xì)胞粘附和增殖測(cè)試表征,并評(píng)價(jià)其作為口腔種植體的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

(CH3COO)2Ca·H2O、(NH4)2HPO4、H2NCONH2、正丁醇、丙酮、雙氧水、濃氨水(以上試劑均購(gòu)于國(guó)藥廈門(mén)試劑公司),去離子水,口腔鈦種植體(寶雞英耐特醫(yī)用鈦有限公司),小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12(ATCC號(hào):CRL-1772TM)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DDY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、500 mL內(nèi)襯聚四氟乙烯的水熱高壓釜、KQ-100VDB型數(shù)控超聲清洗器、SX3-3-10陶瓷纖維馬弗爐、FLEXSEM 1000場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM) 、HITACHI HT770型透射電子顯微鏡(TEM)、SHIMADZU XRD-6100型X射線粉末衍射(XRD)儀、BRUKER ALPHA型紅外光譜儀(FTIR)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米Ca10(PO4)6(OH)2∶Ag粉體制備

按照表1數(shù)據(jù)Ca/P比約為1.67配置溶液,向100 mL燒杯中加入35 mL去離子水,分別加入AgNO3、(CH3COO)2Ca·H2O進(jìn)行溶解,與事先溶解的35 mL (NH4)2HPO4溶液混合后攪拌均勻,再加入表面活性劑SDS和尿素(H2NCONH2),攪拌15 min后轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中,放入烘箱調(diào)節(jié)恒溫120 ℃加熱10 h,自然冷卻后取出離心,經(jīng)去離子水洗滌,乙醇洗滌后得到的固體在60 ℃下烘干5 h得到產(chǎn)物,利用TEM、FTIR、XRD、EDS分析粉體的組成和結(jié)構(gòu)。

表1 水熱法制備納米Ca10(PO4)6(OH)2 ∶Ag粉體的組成Tab.1 Ingredients of silver-doped hydroxyapatite [Ca10(PO4)6(OH)2 ∶Ag] by a hydrothermal method

1.2.2 Ca10(PO4)6(OH)2∶Ag涂層制備

電子天平稱取球磨過(guò)的納米HA、添加劑和造孔劑,加入至100 mL燒杯中,以40 mL正丁醇為分散溶劑,攪拌均勻,緩慢滴加0.5 mL三乙醇胺改善顆粒懸浮狀況[10],燒杯置于超聲儀中超聲分散1 h,靜置陳化24 h待用。將口腔種植體鈦表面平整后放置于燒杯中加雙氧水/氨水超聲除油刻蝕,丙酮超聲除油,二次蒸餾水水洗晾干,以石墨為陽(yáng)極,口腔鈦種植體為陰極,距離0.7 cm,調(diào)節(jié)電壓45 V,電泳沉積時(shí)間120 s,取出放置在干燥器待用。將沉積的復(fù)合涂層放置于馬弗爐中以10 ℃/min速率程序升溫700 ℃,保溫2 h,燒結(jié)后自然冷卻,隔天取出,干燥器中存放。

1.2.3 體外生物活性實(shí)驗(yàn)

體外生物活性采用10%的胎牛血清(FBS)和1%雙抗(PS)的DMEM培養(yǎng)基(高糖),將小鼠骨骼肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,置于恒溫 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24 h更換新鮮培養(yǎng)基,每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮液接種在放置樣品的六孔板中,每組重復(fù)3孔,培養(yǎng)時(shí)間為24 h,采用PBS漂洗,用3%的戊二醛、1.5%的多聚甲醛混合固定液低溫固定30 min,不同濃度乙醇進(jìn)行梯度脫水,最后用丙酮脫水5min,取出樣品后采用真空烘干機(jī)中干燥,粘樣品至銅臺(tái),噴金處理后采用SEM表征細(xì)胞的粘附情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM分析

當(dāng)Ag+含量為15%(質(zhì)量百分比,下同)時(shí),水熱合成的粉體TEM圖如圖1,制備的粉體形狀呈棒狀,長(zhǎng)度在100～250 nm之間,直徑約為20 nm,尺寸分布較均勻,見(jiàn)圖1(a)。單根納米棒的選取電子衍射SAED見(jiàn)圖1(b),對(duì)應(yīng)的晶體衍射斑點(diǎn)明亮,陣列整齊,該晶體屬于典型的單晶結(jié)構(gòu),這與HA晶相一致[11]。說(shuō)明水熱合成的粉體為納米HA晶體,同時(shí)Ag+的摻雜沒(méi)有改變HA的晶相。

圖1 Ag+含量為15%所得粉體的 TEM(a)和SAED圖(b)Fig.1 TEM(a) and SAED(b) micrographs of sample with the amount of Ag+ 15%

2.2 FTIR分析

圖2 不同含量Ag+摻雜羥基磷灰石得的FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of Ca10(PO4)6(OH)2:Ag with different contents

2.3 XRD分析

隨著Ag+的摻雜含量的增加,一系列X射線衍射峰見(jiàn)圖3。與未摻雜Ag+的HA的標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS-09-0432)衍射峰基本一致,且不存在任何第二相如 CaO、Ag3PO4或β-TCP ,表明Ag+已成功取代Ca2+形成了晶體,同時(shí)又不會(huì)干擾羥基磷灰石的晶格,這也與TEM分析結(jié)果相一致,晶相可能的形成過(guò)程如下[13]。

圖3 不同含量Ag+摻雜Ca10(PO4)6(OH)2 ∶Ag XRD圖譜Fig.3 XRD patterns of Ca10(PO4)6(OH)2 ∶Ag with different contents

2.4 體外生物活性分析

體外細(xì)胞培養(yǎng)是評(píng)價(jià)涂層生物活性的重要手段之一[15],在鈦種植體表面電泳Ag/HA涂層,處理后的涂層在小鼠骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后的掃描電鏡圖,見(jiàn)圖4。相比于Ag摻雜HA涂層,見(jiàn)圖4(b)、圖4(c)、圖4(d)及圖4(e),純HA涂層上面小鼠骨骼肌細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢,偽足沒(méi)有向外延伸,粘附性也不強(qiáng)見(jiàn)圖4(a),可以看到小鼠骨骼肌細(xì)胞在不同Ag+含量摻雜Ag/HA的涂層表面生長(zhǎng)較好,放大倍數(shù)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠自主生長(zhǎng),細(xì)胞間交互交聯(lián),細(xì)胞的偽足不斷向外延伸,細(xì)胞粘附涂層表面貼合緊密,繼續(xù)觀察單個(gè)細(xì)胞大小達(dá)到25.9 μm以上,見(jiàn)圖4(e),說(shuō)明Ag+的摻雜能夠促進(jìn)小鼠骨骼肌細(xì)胞在HA涂層表面的生長(zhǎng),使HA涂層具有良好的生物活性[16]。

圖4 Ag/HA涂層表面小鼠骨骼肌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of mouse skeletal muscle cells on the Ag/HA coating observed by SEM

3 結(jié)論

水熱法合成Ca10(PO4)6(OH)2的過(guò)程中摻雜不同含量Ag+,通過(guò)TEM、FTIR、XRD、EDS表征表明長(zhǎng)度在100～250 nm之間,直徑約為20 nm的納米Ag/HA粉體,Ag+的摻雜并沒(méi)有改變Ca10(PO4)6(OH)2晶相,在鈦種植體表面電泳沉積Ag/HA涂層,經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞評(píng)價(jià)顯示,小鼠骨骼肌細(xì)胞在涂層表面能夠粘附并有效增長(zhǎng),隨著Ag+含量的增加細(xì)胞偽足不斷向外延伸,逐漸形成良好的細(xì)胞形態(tài),相比于純HA涂層具有更好的生物活性和生物相容性,綜上所述,經(jīng)過(guò)Ag/HA涂層改性后的鈦種植體具有較好的應(yīng)用前景。