李月，楊建新，王彬，吉郝斌，孟治壽，程子健

1 山西醫(yī)科大學麻醉學院，太原 030000；2 山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院疼痛科；3 山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院麻醉科

圍手術期神經(jīng)認知障礙（perioperative neurocognitive disorders，PND）是圍手術期一種常見的并發(fā)癥，可引起患者術后人格、社交和認知能力的改變，如反應遲鈍、注意力不集中、記憶及學習能力受損等［1-2］。根據(jù)認知障礙發(fā)生的時間可將PND 分為術前存在的認知功能障礙（NCD）、術后譫妄（POD）、神經(jīng)認知延遲恢復（DNR）及術后神經(jīng)認知障礙（POCD），其中POD 指術后1周或患者出院前發(fā)生的神經(jīng)認知障礙［3］。POD 的發(fā)病機制目尚前不清楚，相關研究主要圍繞中樞及外周炎癥、神經(jīng)元自噬、Aβ 蛋白沉積及tau 蛋白過度磷酸化、線粒體能量代謝異常等。NLR 受體是免疫細胞表達于胞質內模式識別受體（PRRs）亞群之一，其中NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）是NLR 受體家族中已知的唯一可被致病和無菌炎癥信號通路間接激活的成員［4］。p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是核因子κB（NF-κB）的上游分子，NF-κB 信號通路可通過上調NLRP3 蛋白表達，促進連接蛋白ASC 和效應蛋白半胱天冬酶-1（caspase-1）表達，介導白細胞介素1β（IL-1β）、IL-18 的成熟釋放，提高炎癥反應程度［5］。別孕烯醇酮是一種內源性神經(jīng)甾體激素。研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，隨年齡增長，小鼠海馬組織別孕烯醇酮表達降低，外源性補充別孕烯醇酮可逆轉阿爾茲海默癥小鼠海馬組織中Aβ 沉積引起的神經(jīng)認知障礙。別孕烯醇酮是否可改善老年雄性小鼠脛骨骨折內固定術后POD 程度目前尚無相關研究報道。2022 年9 月—2023 年7 月，我們觀察了別孕烯醇酮腹腔及皮下注射的老年雄性小鼠脛骨骨折內固定術后POD 發(fā)生情況，探討其可能作用機制，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 1 月齡老年雄性小鼠C57BL/6J 小鼠96 只，體質量（13 ± 3）g，購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（晉）2019-0004，動物飼養(yǎng)5 個月后進行實驗，動物倫理經(jīng)山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院醫(yī)院動物倫理委員會批準（動物倫理委員會編號：DW2023030）。別孕烯醇酮（生產(chǎn)批號：B7456）購于美國Apexbio 公司；2-羥丙基-β-環(huán)糊精試劑（生產(chǎn)批號：ST2114）購于碧云天生物技術公司；小鼠ELISA檢測試劑盒 IL-β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、p-p38MAPK、NLRP3、NF-κB（生產(chǎn)批號：MM-0040M1、MM-0132M1、MM-1209M2、MM-0656M2、MM-44130M1）均購于江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.2 動物分組、POD 模型制備及別孕烯醇酮給予方法 96 只6 月齡小鼠隨機分為A、B、C 組及對照組（各24 只）：A、B、C 組小鼠參照相關文獻，建立脛骨骨折內固定術小鼠POD 模型［8］（常用POD 動物模型制備方法），對照組小鼠不作任何處理，正常飼養(yǎng)。小鼠POD 模型制備［9］方法：3%～5%七氟烷和29%的FiO2全身麻醉小鼠，維持劑量2%～3%，小鼠翻正反射消失后固定鼠身，于小鼠右脛骨前方備皮、消毒，沿脛骨前緣、膝關節(jié)下方切開0.5～1.0 cm 縱行切口，小心分離脛骨上1/3 處周圍血管、肌肉、筋膜，在髓內腔內插入一根直徑為0.53（25G）mm 針，去除暴露在外的髓內針，后用鋸片橫向將脛骨骨干鋸斷，骨折后用無菌生理鹽水沖洗并縫合傷口，于切口處涂抹林可霉素利多卡因凝膠（術后鎮(zhèn)痛及抗感染治療），將液體敷料抹于傷口（防止傷口被污染），即完成脛骨骨折內固定術。術畢三組小鼠腹腔注射250 μg/kg的LPS，停止七氟烷吸入，加大氧流量，小鼠蘇醒后放回籠中，常規(guī)給予水和飼料，維持環(huán)境溫度。A 組小鼠術后第1 小時腹腔注射別孕烯醇酮8 mg/kg，術后第6、24、48小時分別皮下注射8 mg/kg的別孕烯醇酮；B 組小鼠術后第1 小時腹腔注射等體積溶劑2-羥丙基-β-環(huán)糊精，術后第6、24、48 小時分別皮下注射等體積溶劑2-羥丙基-β-環(huán)糊精；C 組小鼠術后未給予任何藥物干預。各組術后常規(guī)給予水和飼料，小鼠分籠飼養(yǎng)，12 h 晝夜交替環(huán)境，溫度（21 ± 2）℃，濕度50～60%，定期環(huán)境通風與紫外線消毒。

1.3 各組小鼠神經(jīng)認知功能檢測方法 分別于術前及術后第1、3、7 天采用Morris 水迷宮實驗評估小鼠空間學習和記憶能力（代表小鼠神經(jīng)認知功能）。水迷宮分為NE、NW、SE、SW 四個象限，水池溫度控制在22～24℃。該實驗分訓練階段和實驗階段。訓練階段記錄小鼠找到平臺所花費的時間（逃避潛伏期）。實驗階段記錄術前及術后第1、3、7 天四個象限的小鼠逃避潛伏期，并取平均值。術后第7 天測算完各組小鼠逃避潛伏期后，撤去平臺，選擇平臺對面象限及任一象限釋放小鼠，各象限限時60 s，觀察并記錄小鼠在目標象限平臺區(qū)域穿越次數(shù)，即為平臺穿越次數(shù)。

1.4 各組小鼠海馬組織炎性因子及NLRP3 相關信號通路蛋白檢測 分別于術前及術后第1、3、7 天水迷宮行為學測試結束2 h 時各組隨機處死6 只小鼠，斷頭后取海馬組織，采用ELISA 法檢測各組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、p-p38MAPK、NF-κB 及NLRP3。取各組小鼠海馬組織，稱重、依次加入PBS緩沖液，PMSF 試劑抑制蛋白酶，組織剪剪碎、超聲粉碎機粉碎、離心、收集上清液，BCA 法測定上清液蛋白濃度，所有操作均嚴格按照ELISA 試劑盒說明進行，繪制標準曲線，測算TNF-α、IL-1β、p-p38MAPK、NF-κB 及NLRP3 相對表達量。重復測算3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用Shapiro-Wilk 法行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素ANOVA 方差分析，組間兩兩事后比較用LSD 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠逃避潛伏期及平臺穿越次數(shù)比較 術前及術后第1、3、7 天各組小鼠逃避潛伏期比較見表1。A 組、B 組、C 組及對照組小鼠術后第7 天平臺穿越次數(shù)分別為（3.06 ± 1.05）、（1.86 ±0.75）、（1.86 ± 1.00）、（6.23 ± 0.83）次。與對照組比較，A、B、C 組小鼠術后第7 天平臺穿越次數(shù)少（P均＜0.05）；P與B、C 組比較，A 組術后第7 天平臺穿越次數(shù)多（P均＜0.05）。

2.2 各組小鼠海馬組織IL-1β 及TNF-α 相對表達量比較 術前A、B、C 及對照組小鼠海馬組織IL-1β相對表達量分別為19.33 ± 1.29、21.15 ± 2.27、19.20 ± 1.84、19.41 ± 1.55，術后第1天A、B、C及對照組小鼠海馬組織IL-1β 相對表達量分別為43.01 ± 1.41、51.45 ± 2.28、49.69 ± 3.59、20.38 ±1.88，術后第3 天A、B、C 及對照組小鼠海馬組織IL-1β 相對表達量分別為33.88 ± 2.44、44.02 ±1.76、44.55 ± 2.62、21.68 ± 1.31，術后第7 天A、B、C 及對照組小鼠海馬組織IL-1β 相對表達量分別為27.89 ± 2.84、40.34 ± 2.98、39.67 ± 2.30、18.68 ±2.11。與對照組比較，術后第1、3、7 天A、B、C 組小鼠海馬組織IL-1β 相對表達量高（P均＜0.05）；與C組比較，術后第1、3、7 天A 組小鼠海馬組織IL-1β 相對表達量低（P均＜0.05）；與B 組比較，術后第1、3、7天A 組小鼠海馬組織IL-1β 相對表達量低（P均＜0.05）。術前及術后第1、3、7 天各組小鼠海馬組織TNF-α相對表達量比較見表2。

表2 術前及術后第1、3、7天各組小鼠海馬組織TNF-α相對表達量比較（ng/L，-x ± s）

2.3 各組小鼠海馬組織p-p38MAPK、 NF-κB、 NLRP3蛋白相對表達量比較 術前A、B、C及對照組小鼠海馬組織p-P38MAPK 相對表達量分別為34.24 ±2.09、33.35 ± 1.59、35.08 ± 2.72、32.73 ± 1.94，術后第1天A、B、C及對照組小鼠海馬組織p-P38MAPK相對表達量分別為60.27 ± 4.19、66.83 ± 5.87、66.98 ± 3.84、33.97 ± 3.26，術后第3天A、B、C及對照組小鼠海馬組織p-P38MAPK 相對表達量分別為54.15 ± 2.31、60.91 ± 1.93、59.40 ± 2.70、35.09 ±2.04，術后第7 天A、B、C 及對照組小鼠海馬組織p-P38MAPK 相對表達量分別為45.98 ± 1.97、54.67 ± 3.93、53.27 ± 2.53、34.17 ± 2.02。與對照組比較，術后第1、3、7 天A、B、C 組小鼠海馬組織p-P38MAPK 相對表達量高（P均＜0.05）；與C 組比較，術后第1、3、7 天A 組小鼠海馬組織p-P38MAPK相對表達量低（P均＜0.05）；與B組比較，術后第1、3、7天A組小鼠海馬組織p-P38MAPK相對表達量低（P均＜0.05）。術前及術后第1、3、7天各組小鼠海馬組織NF-κB、NLRP3α相對表達量比較見表3、4。

3 討論

圍術期神經(jīng)認知障礙的發(fā)病機制較多研究圍繞中樞炎癥展開研究，大腦是具有免疫功能的器官，星形膠質細胞、內皮細胞支持著血腦屏障的完整性，手術創(chuàng)傷后對機體的損傷引起損傷相關模式分子（DAMP）介質的快速釋放，進而激活先天免疫系統(tǒng)，致使TNF-α、IL-1β 等炎性因子的合成釋放入血，破壞血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，激活小膠質細胞進一步釋放炎性因子TNF-α、IL-1β，引起中樞炎癥和神經(jīng)功能障礙。炎性因子TNF-α 及IL-1β 在炎癥級聯(lián)反應的啟動和放大中起關鍵作用，參與氧化應激、細胞凋亡、修復等機制，高水平的IL-1β 還可干擾長時程增強和突觸可塑性，進而影響學習及記憶能力。

別孕烯醇酮是一種內源性神經(jīng)甾體激素，通常由中樞的神經(jīng)膠質細胞和神經(jīng)元合成，經(jīng)外周血運，透過血腦屏障在中樞發(fā)揮作用［10］。別孕烯醇酮是一種作用于GABA-A 受體的正性變構調節(jié)劑，可通過增加GABA 與受體結合發(fā)揮作用［11］。有研究［12］表明GABA 可抑制NF-κB 和p38MAPK 激酶等途徑誘導的炎癥反應。p38 MAPK 引起炎癥反應、細胞凋亡、細胞分化等多種生物反應［13］；NF-κB 作為p38MAPK通路的下游分子，同時也是參與小膠質細胞M1 激活的關鍵調節(jié)因子，可被磷酸化的p38MAPK激活入核，正反饋促進多種炎癥因子的合成釋放，誘發(fā)中樞炎癥反應，造成神經(jīng)元受損，腦功能異常［13］。NF-κB通路的激活可上調NLPR3 蛋白等物質合成，促進NLRP3 炎癥小體進行組裝和激活［14］。NLRP3 與PND的進展相關。ZHANG 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能夠通過泛—自噬途徑促進NLRP3 炎癥小體的降解，減輕中樞炎癥及神經(jīng)元損傷，改善了小鼠圍術期認知障礙的發(fā)生。而NLRP3阻斷劑MCC950則是通過阻斷NLRP3、ASC 和caspase-1 復合物的組裝和形成來改善術后認知功能障礙；此外衰老過程中的一些炎性介質、代謝物等也會啟動增強NLRP3 炎癥小體反應，進一步驅動炎癥反應和疾病發(fā)展。

海馬在空間學習和情景記憶中起著關鍵作用，其中皮層1區(qū)（CA1）、CA3和齒狀回（DG）區(qū)域參與了空間導航和情景記憶的形成［16］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其余各組術后小鼠的逃避潛伏期均有所延長，術后第7天平臺穿越次數(shù)減少，活動軌跡分散，反映了小鼠術后學習記憶能力的下降，與之相一致，小鼠海馬組織炎性因子水平也顯著升高；而A組小鼠術后水迷宮中的表現(xiàn)明顯優(yōu)于C組，海馬組織炎性因子表達下降，提示別孕烯醇酮可改善小鼠術后的學習及記憶能力；此外，本研究對小鼠海馬組織NLRP3 及其上游p-p38MAPK、NF-κB 的表達進行了定量分析，這三種蛋白作為炎性反應的參與者，在促進炎性因子的合成釋放中發(fā)揮著重要作用，本研究結果示，與對照組相比，其余進行手術的三組小鼠術后海馬組織中p-p38MAPK、NF-κB、NLRP3表達均升高，而A組小鼠經(jīng)過別孕烯醇酮干預后，其海馬組織p-p38MAPK、NF-κB、NLRP3 的表達較C 組明顯降低。

綜上所述，別孕烯醇酮可抑制中樞炎癥反應，改善小鼠脛骨骨折內固定術后譫妄引起的認知功能受損，其機制可能與通過抑制海馬組織 p38 MAPK /NF-κB /NLRP3 信號通路中相關蛋白表達有關。