李冠廷,張永婷,孫文正,徐東昱*,瞿小杰

(1.中國水利水電科學(xué)研究院水生態(tài)環(huán)境研究所,北京 100038;2.甘肅省地礦局四勘院,甘肅酒泉 735000;3.梧州學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,廣西梧州 543000)

隨著當(dāng)前工農(nóng)業(yè)用水量的增加,我國農(nóng)村黑臭水體日趨嚴(yán)重,其中以生活源、農(nóng)業(yè)源為主體的污染是造成農(nóng)村黑臭水體的主要原因[1]。農(nóng)村黑臭水體中氮、磷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了水體的自凈能力,導(dǎo)致農(nóng)村水體富營養(yǎng)化程度嚴(yán)重,水體生態(tài)平衡被破壞,引起水體富營養(yǎng)化[2-3]。特別是當(dāng)水體中磷營養(yǎng)鹽濃度增加時,植物的生長和分配格局被改變,這些改變對植物的形態(tài)及生理代謝具有一定的影響[4]。在植物的生長發(fā)育過程中,磷是不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)之一,是植物合成酶、葉綠素等物質(zhì)的基礎(chǔ)物質(zhì),且磷亦是能量轉(zhuǎn)移載體物質(zhì),能夠參與到植物代謝過程、調(diào)節(jié)植物光合作用和呼吸作用,因此磷的濃度會對植物形態(tài)和生理機(jī)制產(chǎn)生一系列的調(diào)控性影響[5-6]。然而,過多的磷仍然能夠脅迫植物的生長發(fā)育[7]。

植物修復(fù)技術(shù)是被廣泛認(rèn)可的治理和修復(fù)富營養(yǎng)化水體的有效方法[3]。沉水植物具有能夠控制藻類生長、凈化水質(zhì)和調(diào)解物質(zhì)循環(huán)等功能[8],對富營養(yǎng)化水體中的氮磷等污染物的去除具有明顯效果。范真等[9]研究了多種濕地植物對含氮磷水體的吸附能力,發(fā)現(xiàn)濕地植物可以凈化水體。姚瑤等[10]通過篩選研究表明,苦草可以對富磷水體進(jìn)行凈化。趙建成等[11]使用苦草[Vallisnerianatans(Lour.)Hara]等植物凈化農(nóng)村水體,其中苦草對水體中氮磷的凈化效果明顯。由此可見,苦草對于修復(fù)水體中氮磷含量過多具有重要意義。以往研究多聚焦于修復(fù)水體的植物選擇上,而較少關(guān)注磷是否影響苦草種子的生長發(fā)育及其生理代謝。因此,該研究以苦草種子及其苗期單株為試驗(yàn)材料,探究富磷水體對苦草生長發(fā)育及其生理代謝的影響,為苦草凈化富磷水體效果提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料該研究采用市售的已包衣苦草種子及苗期單株,并將苦草單株進(jìn)行清洗,以防止枯死葉片及其根部泥土污染水體。采用磷酸二氫鉀(KH2PO4)固體配制磷酸鹽濃度為500 mg/L的母液,然后逐級稀釋至目標(biāo)濃度[12]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1磷酸鹽對苦草種子發(fā)芽率的影響。磷酸鹽濃度分別設(shè)置為0(去離子水)、10、50、100、200、300 mg/L,分別編號為Ⅰ～Ⅵ組。每組設(shè)置3個平行,并以Ⅰ組為試驗(yàn)對照組。用培養(yǎng)皿作為種子的培養(yǎng)容器,并使用含有不同濃度的浸濕濾紙為種子提供磷營養(yǎng)鹽,且每天定時用滴管給種子添加對應(yīng)濃度的磷酸鹽溶液,以保持濾紙的濕潤。種子發(fā)芽試驗(yàn)共進(jìn)行12 d[13]。分別在0、3、6、9、12 d的固定時間觀察并記錄種子發(fā)芽率及根長。試驗(yàn)初期對種子進(jìn)行遮光處理,后期給予種子一定的光照,但要防止強(qiáng)光損傷種子。

1.2.2磷酸鹽對苦草單株生理指標(biāo)的影響。選取生長狀態(tài)良好、生長發(fā)育情況相似的單株,去除黃葉枯葉反復(fù)洗凈后分別放入編號為Ⅰ～Ⅵ的燒杯中,并在燒杯中加入250 mL的磷酸鹽溶液,濃度同種子發(fā)芽試驗(yàn),每組處理設(shè)置3個平行。試驗(yàn)共進(jìn)行20 d,每隔5 d取樣一次,測定溶液中PO43--P濃度以及植株葉片的生理代謝參數(shù)(主要包括葉綠素和丙二醛含量)。每次取樣后添加去離子水補(bǔ)充取樣、蒸發(fā)、植物蒸騰所消耗的水分。

1.2.3苦草根際泌氧分析?？嗖莞H泌氧情況以及根周pH使用平面光極技術(shù)(PO)[14]對苦草根際周圍O2和pH分布進(jìn)行拍照成像,首先是調(diào)節(jié)燈與苦草之間的距離,設(shè)置光強(qiáng)參數(shù),其次將苦草容器前窗替換為O2偏光器和pH偏光器窗,接著保持環(huán)境的黑暗進(jìn)行拍照成像,并用ImageJ軟件繪制O2和pH的二維分布圖,觀察植物根系泌氧和泌酸的過程。

1.3 生理參數(shù)測定

1.3.1磷酸鹽濃度的測定。溶液中磷酸鹽濃度采用《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)中鉬銻抗分光光度法[15]測定。

1.3.2葉綠素含量的測定。葉綠素含量的測定參考劉湘慶等[16]的方法。具體如下:選取成熟的苦草葉片,將葉片用去離子水沖洗干凈后吸干表面水分,稱取0.1 g的葉片并將其剪碎成長寬均約為2 mm的碎塊后放入50 mL試管中,加入25 mL葉綠素提取劑(丙酮、無水乙醇和去離子水按4.5∶4.5∶1混合配制),蓋上蓋子,避光浸提24 h,以提取劑作為空白,分別在663和645 nm波長下測定其吸光度。并根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b濃度(mg/L):

Chl a=12.72A633-2.69A645

(1)

Chl b=22.80A645-4.67A663

(2)

在得到葉綠素的濃度后,再按下式計(jì)算組織中鮮重的各種色素的含量:

(3)

式中:W為葉綠素含量(mg/g);Chl為色素濃度(mg/L);v為提取液體積(mL);n為稀釋倍數(shù);g為樣品鮮重(g)。

1.3.3丙二醛(MDA)含量的測定。MDA含量的測定參考張瓊等[17]的方法。具體如下:稱0.5 g葉片于研磨缽中,然后加入2 mL l0%的三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨至勻漿,勻漿以4 000 r/min的速度離心10 min,然后吸取上清液2 mL(對照為2 mL去離子水),之后加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,于沸水浴中反應(yīng)15 min,迅速冷卻后再離心10 min。用紫外分光光度計(jì)在450、532、600 nm波長下測定上清液吸光度。MDA含量計(jì)算公式如下:

C=6.45(A532-A600)-0.56A450

(4)

式中:C為MDA含量(μmol/L);A532、A600、A450分別為波長532、600、450 nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和origin軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸鹽對苦草種子發(fā)芽率的影響從圖1可以看出,各個處理組種子發(fā)芽率隨時間的增加而逐步上升,在0～6 d時,各組種子發(fā)芽速率較高,在6 d時Ⅰ～Ⅵ組發(fā)芽率分別為70%、70%、80%、83%、77%、73%,前6 d Ⅰ組和Ⅱ組種子萌發(fā)率明顯滯后于其他組。在6 d后,各組發(fā)芽率沒有明顯提升,趨于穩(wěn)定,其中Ⅲ組在9 d時發(fā)芽率到達(dá)90%后停止,Ⅳ組在6 d時發(fā)芽率到達(dá)83%后停止,Ⅴ組在9 d時發(fā)芽率到達(dá)83%后停止,Ⅵ組在9 d時發(fā)芽率到達(dá)87%后停止。在12 d時,Ⅰ～Ⅵ組發(fā)芽率分別為80%、83%、90%、83%、83%、87%,Ⅱ～Ⅵ組苦草種子發(fā)芽率均大于Ⅰ組,可見苦草種子受磷營養(yǎng)鹽脅迫更易發(fā)芽。

圖1 不同濃度磷酸鹽溶液對種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of phosphate solutions on germination rate of seeds

從表1可以看出,磷酸鹽濃度對苦草根長有較大影響,隨著磷酸鹽濃度的增加,苦草根長平均增長長度總體呈增加趨勢。磷酸鹽苦草根長總體隨磷酸鹽濃度增加而增長。在不同濃度的磷酸鹽溶液中,根系從第3天開始具有明顯的長度增加,在12 d時,Ⅰ～Ⅵ組對應(yīng)的根長分別為2.80、3.13、4.04、5.17、4.89、5.38 cm;與對照組相比,各處理組根長隨磷酸鹽濃度增加而增長速率加快。

表1 不同濃度磷酸鹽溶液對苦草根長的影響Table 1 Effects of different concentrations of phosphate solutions on the root length of Vallisneria natans

2.2 磷酸鹽對苦草葉片中葉綠素及MDA含量的影響植物葉綠素廣泛存在于植物組織中,其含量是反映植物光合作用和生長狀況的重要指標(biāo)。從圖2a可以看出,隨著時間的延長,Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅵ組中葉綠素含量出現(xiàn)了先降低后升高的趨勢,其中Ⅰ組最終葉綠素含量較初始減少了0.269 mg/g,Ⅱ組最終葉綠素含量較初始減少了0.241 mg/g,Ⅵ組最終葉綠素含量較初始減少了0.212 mg/g;而Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組中葉綠素含量變化差異不明顯。綜合來看,中高濃度(50～200 mg/L)的磷酸鹽溶液可以維持苦草體內(nèi)葉綠素的穩(wěn)定。

當(dāng)植物受到脅迫時,細(xì)胞原生質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸會發(fā)生過氧化產(chǎn)生丙二醛(MDA),其含量可反映出植物的受損程度[18]。從圖2b可以看出,各組植株中MDA含量隨時間的變化整體呈上升趨勢。與0 d時相比,試驗(yàn)最初的10 d內(nèi),各處理組下的苦草葉片MDA含量變化不明顯,Ⅰ～Ⅵ組均是在15 d時MDA含量明顯增加,而Ⅵ組從5 d時開始明顯增加?？傮w而言,Ⅰ～Ⅴ組均在20 d時苦草單株體內(nèi)MDA含量最高,Ⅱ組中MDA含量變化幅度最大,相比0 d時增加了0.026 μmol/L,變化最小的是Ⅴ組,MDA含量增加了0.008 μmol/L;Ⅵ組中MDA含量呈現(xiàn)在15 d之前增加、15 d之后減少的趨勢。

圖2 不同濃度磷酸鹽溶液對苦草中葉綠素(a)和MDA(b)含量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of phosphate solutions on chlorophyll(a)and MDA(b)content in Vallisneria natans

為了進(jìn)一步驗(yàn)證苦草根系泌氧與磷酸鹽脅迫的響應(yīng)關(guān)系,以磷酸鹽最高濃度組(300 mg/L)苦草根部為樣本,拍攝平面光極的動態(tài)圖片,觀察苦草根際活性氧和pH隨時間的變化情況(圖3～4)。從圖3可以看出,在苦草根際幾毫米區(qū)域內(nèi)氧氣量隨著時間的增加而持續(xù)增多,說明根系發(fā)生了泌氧現(xiàn)象。圖4顯示,溶液中苦草根系周圍pH較低,均在6.50～6.75,并且該現(xiàn)象持續(xù)存在。

圖3 苦草根際活性氧隨時間變化Fig.3 Changes of reactive oxygen species in the rhizosphere of Vallisneria natans with time

2.3 苦草對水中磷酸鹽的去除效果該試驗(yàn)以水中磷酸鹽濃度的下降量來反映苦草對磷酸鹽的吸收量。從圖5a可以看出,在20 d時,各處理組中磷酸鹽濃度與0 d時相比均有大幅度降低,Ⅳ組中20 d時水中磷酸鹽濃度下降了57.8 mg/L,Ⅴ組中20 d時水中磷酸鹽濃度下降了134.6 mg/L,Ⅵ組20 d時水中磷酸鹽濃度下降了73.2 mg/L;可以明顯判斷出Ⅴ組苦草對水中磷酸鹽的吸附量高于Ⅳ組和Ⅵ組,Ⅴ組中苦草對水中磷酸鹽的吸附量最大。

從圖5b可以看出,各處理組(除Ⅰ組)的去除率與對照組相比明顯增加,其中,Ⅱ組中在處理5 d時,去除率已達(dá)到81%,20 d時達(dá)到了99.6%;Ⅵ組中,隨著處理時間的延長,苦草對磷酸鹽的去除率呈線性增加。但Ⅰ組中卻出現(xiàn)了在15 d 之后水中磷酸鹽去除率為負(fù)的現(xiàn)象,也就是苦草向水中釋放磷酸鹽。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于苦草部分根系衰亡脫落,造成了磷的釋放[19]。

圖4 苦草根際pH隨時間變化Fig.4 Change of pH in the rhizosphere of Vallisneria natans with time

圖5 水中磷酸鹽濃度(a)和去除率(b)隨時間的變化Fig.5 Changes of phosphate concentration(a)and removal rate(b)in water with time

3 討論

3.1 不同濃度磷酸鹽對種子發(fā)芽的影響一定濃度的磷營養(yǎng)鹽溶液對苦草種子會產(chǎn)生一定的脅迫作用,體現(xiàn)出對苦草種子生長發(fā)育的促進(jìn)作用。楊麗麗等[20]研究表明,白及種子在受低濃度磷酸鹽的脅迫下更容易發(fā)芽。然而,該研究發(fā)現(xiàn)不同磷酸鹽濃度對苦草種子的發(fā)芽具有一定程度的促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該研究的結(jié)果,對發(fā)芽率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同濃度磷營養(yǎng)鹽溶液均可以促進(jìn)苦草種子的發(fā)芽,但是各個濃度的促進(jìn)效果沒有顯著差別。這與Vetterlein等[21]的研究結(jié)果一致。磷酸鹽營養(yǎng)液促進(jìn)種子生長發(fā)育,主要是由于磷可以幫助修復(fù)種子的膜結(jié)構(gòu),提高種子淀粉酶的活性,使種子對營養(yǎng)元素的吸收加快,從而促進(jìn)種子的萌發(fā)[22]。

3.2 不同濃度磷酸鹽對苦草根系生長的影響植物的生長發(fā)育過程對水分的利用受限于磷,從而影響植物根系的生長發(fā)育[23],在植物耐受范圍之內(nèi),可以實(shí)現(xiàn)以磷促水。這與該研究的結(jié)果一致,磷酸鹽濃度對苦草根長產(chǎn)生的是正相關(guān)性影響,隨著磷酸鹽濃度的增加,苦草根長總體逐漸增加。這與朱士江等[24]對香蒲、美人蕉對磷的耐受程度的研究結(jié)果相似。因此,在較高濃度磷營養(yǎng)鹽條件下,磷對苦草根長生長仍然具有促進(jìn)作用。

出現(xiàn)苦草根長隨磷酸鹽濃度增加而增長更快的原因可能是在高濃度磷營養(yǎng)鹽條件下,植物可以清除體內(nèi)過氧化氫,保持植物體內(nèi)活性氧的代謝平衡,保護(hù)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),從而在水體中阻止高濃度氮磷對植物的傷害[25]。對此,對最高磷酸鹽濃度組的苦草根部進(jìn)行pH測量,觀測到溶液中苦草根系周圍pH較低,均在6.50～6.75,并且該現(xiàn)象持續(xù)存在。該現(xiàn)象驗(yàn)證了苦草在受到高濃度磷酸鹽脅迫時,激發(fā)了自我保護(hù)體系,將體內(nèi)產(chǎn)生過氧化氫排出體外,導(dǎo)致苦草根系周圍的pH升高。這也說明苦草具有很強(qiáng)的抗逆性,在此次試驗(yàn)中,由于苦草并未長出葉片,不能進(jìn)行光合作用,所以過高濃度的磷營養(yǎng)鹽溶液對苦草的負(fù)面影響較小。

3.3 不同濃度磷酸鹽對苦草葉綠素和MDA含量的影響在苦草單株的生長發(fā)育過程中,中高濃度的磷溶液可以維持苦草正常生長并且維持苦草中葉綠素濃度的穩(wěn)定,在正常的有氧代謝過程中苦草進(jìn)行正常的光合呼吸作用,但是當(dāng)磷溶液濃度過高時,苦草的活性氧動態(tài)平衡被打破[26],產(chǎn)生大量活性氧,使得苦草光合功能下降,其體內(nèi)的葉綠素含量明顯下降,影響枯草的健康生長,對苦草產(chǎn)生毒害作用。劉文竹等[27]研究也發(fā)現(xiàn),植物組織在鹽脅迫下產(chǎn)生活性氧,活性氧對植物功能分子有破壞作用。

磷酸鹽在苦草體內(nèi)累積到一定的濃度后,會影響細(xì)胞膜的滲透性,產(chǎn)生活性氧,使膜脂過氧化[28],導(dǎo)致MDA含量升高。Ⅵ組(磷酸鹽濃度300 mg/L)中MDA含量出現(xiàn)升高早于其他組,是由于Ⅵ組磷酸鹽含量過高,在苦草體內(nèi)積累較快,使MDA含量在試驗(yàn)中期開始顯著升高;而其他處理組濃度較低,加之苦草耐受性較強(qiáng),因此磷酸鹽在苦草體內(nèi)積累較慢,在試驗(yàn)后期MDA含量才開始明顯升高。李佩[29]研究也發(fā)現(xiàn),MDA含量隨磷濃度的升高而增加,也隨時間延長而累積,這與該研究的觀點(diǎn)一致。

綜合葉綠素和MDA含量的變化情況,磷酸鹽對苦草的脅迫影響了苦草根系活性氧的產(chǎn)生過程,黃玉源等[30]研究結(jié)果也表明,不同濃度的磷酸鹽溶液影響苦草對氧氣的吸收與釋放,從而影響苦草的生長發(fā)育過程。

3.4 苦草對富磷水體中磷酸鹽的去除效果隨著水中磷酸鹽濃度的增加,苦草對磷酸鹽的吸附量不斷增加,Ⅵ組(磷酸鹽濃度300 mg/L)的吸附量明顯低于Ⅴ組(磷酸鹽濃度200 mg/L),這是由于Ⅵ組中磷酸鹽濃度過高,對苦草生理代謝與結(jié)構(gòu)的影響較大,MDA與葉綠素指標(biāo)均可說明此現(xiàn)象。文明章等[31]研究也表明過高濃度的磷營養(yǎng)鹽溶液會對苦草產(chǎn)生脅迫作用。Ⅴ組在15 d之后去除率突然間大幅度增加,結(jié)合MDA含量的結(jié)果,原因可能是由于Ⅴ組植株的抗逆性相較于其他組更強(qiáng),且Ⅴ組中磷酸鹽的濃度依然在苦草承受范圍之內(nèi)。綜合各組苦草對水中磷酸鹽去除的結(jié)果,Ⅴ組為磷酸鹽吸附量最高的組,因此,當(dāng)磷酸鹽濃度在200 mg/L時,苦草對水中磷酸鹽的吸附量最高。

4 結(jié)論

該研究以苦草為模式植物,采用原位根系泌氧圖像分析(平面光極技術(shù))的方法,研究不同濃度富磷水體對苦草種子和植株生長發(fā)育以及根系泌氧的影響。結(jié)果表明:不同濃度的富磷水體對苦草種子發(fā)芽均有促進(jìn)效果,苦草幼苗根長生長隨富磷水體中磷酸鹽濃度的增加而加快。當(dāng)磷酸鹽濃度在50～200 mg/L時,苦草中葉綠素含量變化穩(wěn)定;當(dāng)磷酸鹽濃度超過200 mg/L時,苦草中葉綠素含量波動顯著,后期呈現(xiàn)出升高趨勢。當(dāng)磷酸鹽濃度超過200 mg/L時,苦草累積MDA速度較快,此濃度下,苦草對磷酸鹽吸附量最多,去除率達(dá)67.6%。植物根系的養(yǎng)分吸收程度會直接影響植物中葉綠素的合成以及MDA的釋放,苦草根系泌氧研究表明,磷酸鹽脅迫下根系pH降低,活性氧含量呈增加趨勢。

綜合來看,不同濃度富磷溶液對苦草生長發(fā)育影響較大,在選擇用苦草作為修復(fù)富營養(yǎng)化水體植物時,應(yīng)考慮水體的富營養(yǎng)化程度中水體磷酸鹽的含量,因地制宜,因水制宜,在提高對水體富營養(yǎng)化的修復(fù)效率的同時,達(dá)到節(jié)約成本和美化環(huán)境的最終目的。