阮 磊,黃 博,王蘭蘭,薛惠天,孫夢(mèng)龍,段苗苗,彭 亮

(湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208)

纖維化是骨骼肌損傷后的主要病理特征之一,主要是由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的過度生成和積累所形成。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是眾多內(nèi)源性蛋白水解酶中一類,是許多組織生理和病理過程中ECM成分形成、重塑和降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。依MMPs結(jié)構(gòu)特征和底物特異性可大致分為5個(gè)不同的功能亞型[1],其中明膠酶中MMP-9的主要功能為降解基底膜內(nèi)的Ⅳ型膠原纖維,并可通過增加炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、增強(qiáng)致纖維化因子的作用促進(jìn)纖維化[2-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是MMPs的重要內(nèi)源性抑制因子,其中TIMP-1 能與眾多MMPs特異性結(jié)合,如MMP-9、MMP-1等,從而抑制與之相結(jié)合的MMPs活性,進(jìn)而導(dǎo)致MMPs與TIMP-1的表達(dá)量發(fā)生變化。當(dāng)TIMPs與MMPs失衡時(shí),ECM代謝紊亂,膠原沉積,最終形成纖維化[4]。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)能夠阻礙MMPs的生成,同時(shí)促進(jìn)TIMPs的合成,導(dǎo)致ECM的生成與降解失衡,ECM沉積增加,進(jìn)一步加劇纖維化[5]。此外,TGF-β1還可通過調(diào)控其下游結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)等蛋白表達(dá),直接參與纖維化的形成[6]。推拿?法具有行氣活血、舒筋活絡(luò)、緩解痙攣等效應(yīng),既往研究發(fā)現(xiàn)該法可通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)抑制組織纖維化和減輕炎癥反應(yīng)而促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察推拿?法對(duì)骨骼肌鈍挫傷家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討推拿?法治療骨骼肌損傷的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 15只成年健康普通級(jí)新西蘭大耳白兔(雌兔7只,雄兔8只),體重2～2.5 kg,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心采購(gòu)供應(yīng)[動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2020-0005]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皆由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心依照動(dòng)物生存適宜濕溫環(huán)境統(tǒng)一飼養(yǎng)。

1.2主要儀器與試劑 自制重力錘打擊裝置,?法按摩器(授權(quán)公開號(hào):CN216365 872U),按摩手法測(cè)試儀(上海騰蔭教學(xué)儀器有限公司,型號(hào):ZTC-II),切片機(jī)(浙江金華益迪試驗(yàn)器材,型號(hào):YD-315),電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,型號(hào):MS204TS),脫色搖床(武漢Servicebio,型號(hào):DS-2S100)。HE和Masson染色試劑盒(武漢Servicebio,批號(hào):G1005和G1006),兔源MMP-9一抗、兔源TGF-β1一抗、兔源COL-Ⅰ一抗、鼠源β-actin一抗(武漢Servicebio,批號(hào):GB11132、GB111876、GB114197、GB15001),兔源TIMP-1一抗(武漢三鷹,批號(hào):16644-1-ap),RIPA裂解液(武漢Servicebio,批號(hào):G2002),轉(zhuǎn)膜緩沖液(武漢Servicebio,批號(hào):G2017),脫脂奶粉(武漢Servicebio,批號(hào):G5002),戊巴比妥鈉(德國(guó)Merck公司,批號(hào):P3761)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將15只家兔完全隨機(jī)分為空白組、模型組、推拿?法組,每組5只?？瞻捉M家兔正常喂養(yǎng),模型組、推拿?法組家兔采用自制重力錘打擊裝置建立骨骼肌鈍挫傷模型。造模方法參考文獻(xiàn)[7-8]并適當(dāng)改進(jìn):右下肢內(nèi)側(cè)股四頭肌處備皮,將兔仰臥位固定在兔臺(tái),在右下肢股四頭肌背面與兔臺(tái)之間放置厚度約1 cm的脫脂棉墊以充分暴露股四頭肌平面,擊打右下肢內(nèi)側(cè)股四頭肌肌腹(約髕底上3.5 cm)中段。打擊時(shí)一實(shí)驗(yàn)人員將雙手置于股四頭肌上下端輕度按壓固定,以防移位;另一實(shí)驗(yàn)人員控制重力錘,將重力錘提至導(dǎo)向管最上端(重力錘最下端與導(dǎo)向管最上端處于同一水平),隨后松手讓重力錘沿導(dǎo)向管自由落體,連續(xù)打擊6次,打擊面積約為1.77 cm2,動(dòng)能3.33 J,沖量2.38 N·s;以打擊部位肉眼可見紅腫、瘀血,且無皮膚破損與骨折,觸碰時(shí)可見躲避反射為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。為保證干預(yù)手法操作規(guī)范化,在實(shí)驗(yàn)操作前,實(shí)驗(yàn)人員(同一人)根據(jù)專業(yè)教材記載的?法參數(shù),在 ZTC-II 按摩手法測(cè)試儀上測(cè)試訓(xùn)練并熟練掌握操作要求和力度。造模成功后第7天開始,對(duì)推拿?法組兔進(jìn)行?法干預(yù):將兔仰臥位固定于兔臺(tái),充分暴露右下肢股四頭肌被擊打部位,采用課題組自制?法按摩器附于肌肉損傷處皮膚實(shí)施?法,前后滾作用力比為3∶1,最大下壓力約3 N,操作頻率140次/min,3 min/次,2次/d,連續(xù)3 d?？瞻捉M、模型組兔同時(shí)段捆綁后不做其他處理。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法 干預(yù)結(jié)束后第3天,采用2%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉,家兔頸動(dòng)脈放血處死。家兔死后立即取右下肢股四頭肌受損組織一小塊(約1 cm×1 cm×0.5 cm),于冰板上將肌肉組織切割分離成2等份,其中1份立即放入-80 ℃冰箱保存用于Western blot檢測(cè),另1份采用4%多聚甲醛浸泡固定用于HE和Masson染色。

1.4.1骨骼肌病理形態(tài) 將用4%多聚甲醛固定24 h以上的組織取出修正,放入對(duì)應(yīng)脫水盒內(nèi),將脫水盒放置于脫水機(jī)內(nèi)降梯度浸入酒精內(nèi)脫水;將組織完全浸入熱蠟中包埋,待組織熱退成塊后修整切片。HE染色:室溫下將所制備的切片滴加適量蘇木精染液,時(shí)間到后取出再將切片放入1%乙醇鹽酸溶液中,以達(dá)到去除多余蘇木精的目的,隨后反染5 min。Masson染色:將制備的切片依次使用重鉻酸鉀、鐵蘇木素、麗春紅浸染,每步時(shí)間長(zhǎng)度不等,且浸染完成后皆用自來水清洗再進(jìn)行下一步;隨后使用磷鉬酸與苯胺藍(lán)染色、醋酸分化,透明封片,閱片軟件進(jìn)行圖像采集分析。

1.4.2股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):使用PBS洗滌股四頭肌組織,搗碎后放入勻漿管中,按序依次加入勻漿珠、蛋白酶抑制劑、裂解液等研磨成漿,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清液,經(jīng)過制膠、蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育(MMP-9一抗1∶3 000、TIMP-1一抗1∶3 000、TGF-β1一抗1∶3 000、COL-Ⅰ一抗1∶3 000、β-actin一抗1∶2 000,二抗1∶5 000)、顯色,檢測(cè)骨骼肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達(dá)量,以β-actin為內(nèi)參蛋白,檢測(cè)重復(fù)3次,使用AlphaEaseFC處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組兔股四頭肌病理形態(tài) HE染色顯示:空白組肌細(xì)胞大小均勻,排列緊密,邊緣清晰,無明顯間隙,細(xì)胞核因嗜堿性而呈現(xiàn)藍(lán)紫色,且均位于細(xì)胞邊緣;模型組大量肌細(xì)胞變性壞死,大小不一致,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,細(xì)胞間隙顯著增大,結(jié)締組織顯著增多,瘢痕組織形成;推拿?法組肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞間隙較小,結(jié)締組織減少。Masson染色顯示:空白組肌纖維排列整齊、緊湊,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整均一,未見明顯的藍(lán)色膠原纖維;模型組肌纖維形態(tài)多樣且不規(guī)整,排列紊亂無序,間隙增寬,部分肌纖維融合成片狀,邊界不清,膠原纖維沉積明顯;推拿?法組肌纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,間隙縮小,膠原纖維生成明顯減少。見圖1及圖2。

圖1 空白組和骨骼肌鈍挫傷各組家兔股四頭肌HE染色表現(xiàn)(×100)

2.2各組兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達(dá)情況 模型組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05),推拿?法組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3及表1。

表1 空白組和骨骼肌鈍挫傷各組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 空白組和骨骼肌鈍挫傷各組家兔股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白條帶圖

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,骨骼肌損傷的治療手段層出不窮。推拿是傳統(tǒng)外治法中應(yīng)用較多的一種治療手段,具有便捷、舒適度高、起效快等特性。目前,隨著推拿在臨床應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大且治療效果顯著而逐漸被國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者所接受和重視。?法是中醫(yī)推拿擺動(dòng)類手法之一,其受力面積大,作用力均勻柔和且滲透性強(qiáng),臨床使用率高且治療范圍廣,被認(rèn)為是當(dāng)代最具影響力的推拿手法[9]。

骨骼肌纖維化是一個(gè)多因素過程,是不同細(xì)胞類型、生長(zhǎng)因子、炎癥/纖維化細(xì)胞因子和蛋白水解酶之間多種細(xì)胞和生化事件的整合,進(jìn)而導(dǎo)致組織微環(huán)境發(fā)生一系列改變[10]。ECM過度沉積是骨骼肌纖維化的特征性病理改變,其形成主要與骨骼肌組織中MMPs/TIMPs表達(dá)失衡相關(guān)。COL-Ⅰ是ECM的主要成分,其在細(xì)胞內(nèi)的沉積含量能夠直接反映出纖維化程度,與纖維化發(fā)展進(jìn)程呈正相關(guān)。降解ECM是MMPs的主要功能,而TIMPs能夠反向調(diào)控其降解功能,即TIMPs的過表達(dá)能夠抑制MMPs的活性,使ECM降解受阻,進(jìn)而導(dǎo)致組織中ECM過度沉積,促使骨骼肌纖維化的發(fā)生[11-12]。在正常生理狀態(tài)下,MMP-9參與ECM的正常代謝,在骨骼肌損傷早期分泌增加以加快ECM的降解;TIMP-1是 MMPs 組織特異性拮抗劑中最為常見且被研究最多的一種,能與MMP-9、MMP-1等特異性結(jié)合使其失活從而發(fā)揮抑制ECM降解的作用。MMP-9的異常激活能夠刺激TIMP-1大量產(chǎn)生而反向抑制其活性,而兩者表達(dá)水平的失衡致使骨骼肌修復(fù)異常。MMP-9持續(xù)高水平將會(huì)造成纖維壞死、炎癥和纖維化等嚴(yán)重后果,并干擾受損肌纖維的再生[13]。有研究發(fā)現(xiàn),抑制MMP-9活性可顯著降低mdx小鼠骨骼肌結(jié)構(gòu)破損、炎癥、壞死和纖維化的程度,使骨骼肌收縮功能得到明顯改善[14-15]。TGF-β1是纖維化的主要誘導(dǎo)因素,與多種組織、器官纖維化的形成密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的mdx小鼠動(dòng)物模型中,TGF-β1蛋白表達(dá)顯著升高,激活纖維化級(jí)聯(lián)反應(yīng),促使成肌細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,導(dǎo)致骨骼肌再生異常,而給予TGF-β1蛋白抑制劑能顯著改善上述變化[16-17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)推拿?法可以減少受損骨骼肌內(nèi)TGF-β1、GDF-8、F-肌動(dòng)蛋白等蛋白表達(dá),促進(jìn)成纖維細(xì)胞、肉芽組織及新生血管的生成,降低骨骼肌纖維化程度,提高骨骼肌修復(fù)質(zhì)量[7-8,18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組兔肌纖維形態(tài)多樣,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,部分肌纖維融合成片狀,膠原纖維沉積明顯,股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達(dá)明顯增加;推拿?法組肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,膠原纖維增明顯減輕,且股四頭肌組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表達(dá)明顯減少。以上結(jié)果表明?法能通過下調(diào)MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ的表達(dá),抑制膠原蛋白沉積,調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的生降平衡,進(jìn)而抑制骨骼肌纖維化,促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù),這可能是?法治療骨骼肌損傷的作用機(jī)制之一。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。