姚依然,楊 普,吳浩東,甘 磊,畢師誠(chéng),曹禮靜,王慶華*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,重慶 榮昌 402460;2.重慶市榮昌區(qū)職業(yè)教育中心,重慶 榮昌 402460)

白色念珠菌(Candidaalbicans)廣泛存在于大自然環(huán)境中,可引起多種動(dòng)物感染,尤其是免疫力低下的幼齡動(dòng)物,常常通過皮膚、口腔或陰道黏膜侵入機(jī)體,治療不及時(shí)會(huì)繼發(fā)多系統(tǒng)疾病[1-3]。該菌常引起家禽死亡,特別是幼禽,據(jù)報(bào)道4周齡內(nèi)的幼禽病死率可達(dá)50%[4],而3月齡以上成年禽類的感染易治愈。其中雞感染白色念珠菌后常表現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、羽毛蓬亂,食欲廢絕,常常在感染的2 d內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)大批死亡,而動(dòng)物往往缺乏相應(yīng)的抗真菌劑治療,導(dǎo)致雞群的病死率超過30%[5]。此外,據(jù)報(bào)道感染白色念珠菌后鴿子的發(fā)病率達(dá)10%,病死率達(dá)5%[6]。

現(xiàn)有的白色念珠菌治療藥物多為三唑類(如:氟康唑)、多烯類(如:兩性霉素B)、棘白菌素類(如:卡泊芬凈)等傳統(tǒng)的抗真菌性藥物,而這些藥物的大量使用會(huì)導(dǎo)致耐藥性白色念珠菌泛濫,且長(zhǎng)期使用這些藥物還會(huì)產(chǎn)生各種毒副作用,影響肝、腎等臟器功能[7-10]。但目前在動(dòng)物飼料和藥品中禁用絕大多數(shù)抗真菌藥[11-13],因此在這種政策背景下,開發(fā)新型的抗白色念珠菌的動(dòng)物用抗真菌劑顯得極為迫切。很多研究表明,將有機(jī)硫化合物轉(zhuǎn)化為無機(jī)硫化物可以產(chǎn)生具有抑菌功效的聚硫烷[14-16],并且納米級(jí)聚硫烷顯示出高效的抗細(xì)菌活性、低細(xì)胞毒性、高生物相容性等優(yōu)點(diǎn)[17-18],但目前尚缺乏聚硫烷抗侵襲性真菌(比如白色念珠菌)的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究從發(fā)生了流行性皮膚病的重慶市某養(yǎng)雞場(chǎng)分離到疑似白色念珠菌的致病菌,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。采用皮膚涂布法構(gòu)建白色念珠菌分離株的皮膚感染模型,并使用本實(shí)驗(yàn)室合成的聚硫烷研究其抗真菌特性和對(duì)侵襲性真菌皮膚病的愈合作用。通過檢測(cè)其對(duì)致病菌的菌落大小、孢子萌發(fā)及凋亡與壞死、菌絲體數(shù)量等情況來探究其抑菌作用,為防控侵襲性真菌特別是白色念珠菌病的流行、開發(fā)新型抗真菌劑提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn),重慶市某養(yǎng)雞場(chǎng)疑似發(fā)生侵襲性真菌流行性皮膚病,病雞精神萎靡,食欲不振,飲水量增加,皮膚發(fā)癢、干燥,羽毛雜亂無光澤,皮膚干燥,雞嗉囊腫大松馳,雞冠變暗,背腰部皮膚有一層灰白色鱗屑附著,用刀片采集作為檢測(cè)病料。

白來航雞140只,體質(zhì)量1～2 kg,飼養(yǎng)于西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)室。每天定時(shí)飼喂,并清掃雞舍,提供良好的飼喂環(huán)境及條件。試驗(yàn)結(jié)束后試驗(yàn)雞被執(zhí)行安樂死,本研究通過了西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查(倫理審查號(hào):IACUC-20200701-01)。

A.YPD平板上劃線培養(yǎng)出邊緣有皺褶的白色菌落;B.乳酸酚棉蘭染色后,顯微鏡下觀察到大量的藍(lán)色的芽生菌體(400×)

1.2 主要試劑酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司;乳酸酚棉藍(lán)染液購(gòu)自青島海博生物科技有限公司;真菌DNA基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;2×Taq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker均購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司;凋亡壞死試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 白色念珠菌的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定

1.3.1病原菌的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定 用刀片刮取病雞背腰部皮膚鱗屑,將其接種于YPD液體培養(yǎng)基中,30℃、150 r/min震蕩增菌培養(yǎng)48 h,再接種于YPD固體培養(yǎng)基上,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,并繼續(xù)傳代培養(yǎng),觀察菌落特征,從純化后的單個(gè)菌落挑取病原菌進(jìn)行乳酸酚棉藍(lán)染色鏡檢,觀察菌體染色情況[19]。

1.3.2病原菌的分子生物學(xué)鑒定 以真菌核糖體RNA基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)為擴(kuò)增目的基因,選用真菌rDNA—ITS通用擴(kuò)增引物,引物序列:上游引物:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;下游引物:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為500 bp[20-21]。PCR反應(yīng)的特異性引物是根據(jù)白色念珠菌ITS1-ITS2部分的保守序列,采用生物信息學(xué)軟件Primer select設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物。上游引物:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;下游引物:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為471 bp[22]。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。使用真菌DNA基因組提取試劑盒提取純培養(yǎng)病原菌DNA。RCR反應(yīng)體系25 μL:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,Sterilized ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 4 min;94℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30 min(110 V),然后在凝膠成像儀上成像,觀察是否擴(kuò)增出目的條帶,記錄結(jié)果并拍照保存。

1.4 新型聚硫烷的不同合成方法和抑菌作用測(cè)定

1.4.1新型聚硫烷的不同合成方法 取無機(jī)硫(硫化鈉、硫酸鐵)、有機(jī)硫(半胱氨酸、胱氨酸)按照設(shè)定的配方(配方1:硫化鈉1.21 g、乙酸鈉3.6 g、半胱氨酸0.5 g;配方2:硫化鈉1.21 g、半胱氨酸0.5 g;配方3:硫酸鐵為1.21 g、乙酸鈉3.6 g、胱氨酸0.5 g;配方4:硫酸鐵為1.21 g、胱氨酸0.5 g)分別使用20 mL蒸餾水混勻,置于37℃溫箱中,使用磁力攪拌器混合,置于200℃高壓反應(yīng)釜分別反應(yīng)6,12,24,36 h[14-15,23],高溫反應(yīng)結(jié)束后,使用高速低溫離心機(jī),12 000 r/min,4℃離心后取上清,分離出聚硫烷。并于馬爾文激光粒度儀上進(jìn)行粒徑的測(cè)定。

1.4.2使用藥敏試驗(yàn)(濾紙片擴(kuò)散法)篩選出具有最佳抑菌活性的聚硫烷 將上述不同合成方法獲得的聚硫烷進(jìn)行濾紙片擴(kuò)散試驗(yàn),在YPD固體培養(yǎng)基上均勻涂布濃度為105CFU/mL的白色念珠菌,濾紙片放到平皿中,將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察聚硫烷對(duì)白色念珠菌(濃度為105CFU/mL)的抑菌效果,重復(fù)3次,取平均值。

1.4.3最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 YPD液體培養(yǎng)基稀釋菌液至濃度為3.5×105CFU/mL備用,用微量二倍稀釋法測(cè)定聚硫烷對(duì)白色念珠菌的MIC,重復(fù)3次。

1.4.4最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 在上述MIC測(cè)定實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步將MIC試驗(yàn)中反應(yīng)孔內(nèi)未出現(xiàn)渾濁的培養(yǎng)液,接種至YPD液體培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng),如無白色念珠菌生長(zhǎng)則認(rèn)為該濃度具有殺滅白色念珠菌作用,此時(shí)最低的殺滅白色念珠菌的濃度記錄為MBC。

1.5 聚硫烷的毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)選取60只雞,試驗(yàn)前禁食12 h,按照10,40,80 g/kg的劑量灌服聚硫烷,觀察和記錄雞死亡情況,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)灌服聚硫烷后雞的狀態(tài)和死亡數(shù),來設(shè)置正式試驗(yàn)中灌服聚硫烷的劑量。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果,正式試驗(yàn)采用改良寇氏法,按照預(yù)試驗(yàn)計(jì)算所得劑量間距,將雞分5組,每組10只,馴化飼養(yǎng)3 d,試驗(yàn)前禁食不禁水12 h,經(jīng)口灌服聚硫烷,灌胃3 h后自由進(jìn)食。觀察并記錄各組死亡情況,根據(jù)按公式LD50=log-1[Xm-i(Σp-0.5)]計(jì)算,求半數(shù)致死量(LD50)。(注:Xm為最大劑量組劑量對(duì)數(shù)值;i為相鄰2組對(duì)數(shù)劑量的差值;p為各組雞病死率;∑P:各組動(dòng)物病死率之總和)。

1.6 聚硫烷對(duì)雞白色念珠菌性皮膚病的治療作用在創(chuàng)建白色念珠菌性皮膚病疾病模型前,對(duì)實(shí)驗(yàn)雞連續(xù)3 d注射地塞米松免疫抑制劑以降低雞的免疫力。而后劃破雞皮膚表皮層,制造10 mm×10 mm的傷口。創(chuàng)建皮膚傷口模型后,將實(shí)驗(yàn)雞隨機(jī)分為白色念珠菌感染組、聚硫烷治療組、生理鹽水組(n=10)。吸取6.8×108CFU/mL白色念珠菌液50 μL均勻涂布到皮膚傷口處,創(chuàng)建白色念珠菌感染組。使用上述劑量的白色念珠菌感染傷口后,使用質(zhì)量濃度為7.8 g/L的聚硫烷涂抹50 μL創(chuàng)建聚硫烷治療組,而生理鹽水組則在傷口處只涂抹50 μL的生理鹽水。

1.7 聚硫烷抑制白色念珠菌菌落生長(zhǎng)分別取107,106,105,104,103CFU/mL白色念珠菌菌懸液10 μL滴至含不同質(zhì)量濃度(0,0.10,0.20,0.39 g/L)聚硫烷的YPD固體平板上,于30℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)10 d,以觀察聚硫烷對(duì)白色念珠菌菌落大小的影響。

1.8 聚硫烷抑制白色念珠菌孢子萌發(fā)率試驗(yàn)使用液體YPD培養(yǎng)基將白色念珠稀釋至107CFU/mL,并用不同質(zhì)量濃度的聚硫烷(0,0.10,0.20,0.39 g/L)30℃條件下處理4 h,加入PBS溶液重懸菌體,磁力攪拌器中攪拌8 min,使聚集成團(tuán)的孢子均勻分散于溶液中。顯微鏡下觀察并計(jì)算孢子萌發(fā)率,孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%[24]。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)統(tǒng)計(jì)200個(gè)孢子的萌發(fā)率,取平均值。

1.9 聚硫烷抑制白色念珠菌菌絲體試驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)制備制備107CFU/mL的菌懸液,檢測(cè)聚硫烷抑制白色念珠菌菌絲體繁殖效果[8]。107CFU/mL的菌懸液用1 mL小牛血清重懸,于培養(yǎng)箱內(nèi)30℃孵育4 h。取出1滴懸浮液,置于顯微鏡下確認(rèn)有芽管出現(xiàn)后,將菌體重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置孵育6 h,以生成菌絲體。根據(jù)聚硫烷質(zhì)量濃度的不同,試驗(yàn)分為4組,即:0,0.10,0.20,0.39 g/L,每組各設(shè)3個(gè)重復(fù)。使用RPMI-1640培養(yǎng)基將聚硫烷母液稀釋至所需的質(zhì)量濃度(0,0.10,0.20,0.39 g/L)。于30℃恒溫培養(yǎng)箱處理24 h后用光學(xué)顯微鏡觀察不同質(zhì)量濃度聚硫烷作用下的菌絲體。擴(kuò)大培養(yǎng)至100 mL,記錄各組培養(yǎng)液中菌絲體的鮮重。

1.10 聚硫烷誘導(dǎo)白色念珠菌孢子凋亡和壞死試驗(yàn)

1.10.1臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)聚硫烷誘導(dǎo)白色念珠菌孢子的壞死率 臺(tái)盼藍(lán)染料正常情況下被細(xì)胞壁和細(xì)胞膜阻攔在活細(xì)胞外,只有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受損后,才能進(jìn)入細(xì)胞,從而與壞死孢子的DNA結(jié)合,使DNA染為藍(lán)色,因此,活細(xì)胞一般不能被臺(tái)盼藍(lán)染色,而死細(xì)胞會(huì)被染成藍(lán)色[25]。具體操作方法是:白色念珠菌孢子懸浮液用生理鹽水稀釋至107CFU/mL,加入不同質(zhì)量濃度的聚硫烷(0,0.10,0.20,0.39 g/L)到各試驗(yàn)組。置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后取出,使用5 μL臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色,10 min內(nèi)于顯微鏡下計(jì)數(shù)染成藍(lán)色的白色念珠菌,并統(tǒng)計(jì)白色念珠菌壞死率。

1.10.2流式細(xì)胞儀進(jìn)一步確認(rèn)聚硫烷誘導(dǎo)白色念珠菌孢子的壞死率和凋亡率 107CFU/mL白色念珠菌孢子分別經(jīng)不同質(zhì)量濃度的聚硫烷(0,0.10,0.20,0.39 g/L)于30℃條件下處理4 h后,10 000 r/min離心5 min收集孢子。用400 μL Binding Buffer重懸,分別加入5 μL標(biāo)記Ca2+依賴性結(jié)合蛋白的異硫氰酸熒光素(Annexin-FITC)、5 μL碘化丙啶(PI)進(jìn)行染色。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)聚硫烷誘導(dǎo)的白色念珠菌孢子凋亡和壞死情況[26]。凋亡中期(Q2象限)和凋亡晚期的細(xì)胞(Q3象限)記錄為凋亡細(xì)胞,凋亡晚期細(xì)胞(Q2象限)和壞死細(xì)胞(Q1象限)記錄為壞死細(xì)胞。

A.不同配方(配方1、配方3、配方3原液)合成的聚硫烷對(duì)白色念珠菌的藥敏試驗(yàn);B.配方3合成的聚硫烷對(duì)白色念珠菌的MIC實(shí)驗(yàn)

A.配方3合成的聚硫烷的粒徑分布特征;B.配方3合成的聚硫烷在自然光下呈棕黃色

A.在雞皮膚傷口涂抹白色念珠菌;B.在雞皮膚傷口涂抹白色念珠菌后,第3天涂抹聚硫烷;C.在雞皮膚傷口涂抹生理鹽水

A.不同質(zhì)量濃度聚硫烷(0,0.10,0.20,0.39 g/L)抑制白色念珠菌在YPD固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng);B.不同質(zhì)量濃度聚硫烷(0,0.10,0.20,0.39 g/L)抑制白色念珠菌菌落直徑的折線圖;C.顯微鏡下觀察不同質(zhì)量濃度的聚硫烷抑制白色念珠菌孢子的萌發(fā)(放大10×40倍);D.不同質(zhì)量濃度聚硫烷(0,0.10,0.20,0.39 g/L)抑制白念珠菌孢子的萌發(fā)率(與空白組(無)相比,**P<0.01)

A.未添加聚硫烷組的白色念珠菌菌絲體大量繁殖;B.0.10 g/L質(zhì)量濃度的聚硫烷抑制了菌絲體數(shù)量;C.0.20 g/L質(zhì)量濃度的聚硫烷聚硫烷抑制了菌絲體數(shù)量;D.0.39 g/L質(zhì)量濃度的聚硫烷聚硫烷抑制了菌絲體數(shù)量

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,以P<0.05為顯著水平,P<0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 白色念珠菌的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定

2.1.1白色念珠菌的分離和形態(tài)學(xué)鑒定 分離菌在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h后,平板上可見乳白色、圓形的菌落,其表面略粗糙,邊緣有皺褶出現(xiàn),無色素沉著,菌落直徑為2 mm左右(圖1A);在YPD液體培養(yǎng)基中呈渾濁生長(zhǎng);經(jīng)乳酸酚棉蘭染色,顯微鏡下鏡檢可見藍(lán)色的圓形或卵圓形單個(gè)、成堆排列的菌體,外部有莢膜,有的可見較小的芽生菌體,背景為淡藍(lán)色乳酸酚棉蘭染液(圖1B)。

2.1.2白色念珠菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 在提取病原菌DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后,用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,其rDNA-ITS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小靠近500 bp左右(圖2A),白色念珠菌PCR產(chǎn)物在471 bp附近出現(xiàn)目的條帶(圖2B),擴(kuò)增目的片段與預(yù)期白色念珠菌片段大小均一致。

2.2 不同方法合成的聚硫烷對(duì)白色念珠菌的藥敏試驗(yàn)、MIC和MBC藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3A):和其他合成方法相比,使用配方3(硫酸鐵為1.21 g、乙酸鈉3.6 g、胱氨酸0.5 g)在200℃高溫反應(yīng)釜中反應(yīng)12 h合成的聚硫烷對(duì)白色念珠菌的抑菌效果最好,抑菌圈直徑是15.3 mm,白色念珠菌對(duì)使用配方3合成的聚硫烷是高度敏感的。而使用配方1(硫化鈉1.21 g、乙酸鈉3.6 g、半胱氨酸0.5 g)在200℃高溫反應(yīng)釜中反應(yīng)12 h合成的聚硫烷對(duì)白色念珠菌的抑菌效果比較好,抑菌圈直徑是11.2 mm。另外,白色念珠菌對(duì)配方1～配方4的原液均不敏感,具體見表1。

表1 不同合成方法獲得的聚硫烷對(duì)白色念珠菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過采用96孔板進(jìn)行微量二倍稀釋法檢測(cè)本課題組合成的聚硫烷對(duì)白色念珠菌的MIC。通過微量二倍稀釋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚硫烷對(duì)白色念珠菌的MIC是0.78 g/L(圖3B)。取MIC孔內(nèi)澄清的培養(yǎng)液接種到新鮮的YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),無菌生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度為1.56 g/L,即聚硫烷對(duì)白色念珠菌的MBC是1.56 g/L。

2.3 聚硫烷的最佳合成方法(配方3)及粒徑測(cè)定使用藥敏篩選發(fā)現(xiàn):使用配方3的無機(jī)硫和有機(jī)硫可以有效的轉(zhuǎn)化為具有最佳抗菌效果的聚硫烷,其合成方法為:硫酸鐵為1.21 g、乙酸鈉3.6 g、胱氨酸0.5 g使用蒸餾水20 mL混勻,置于37℃溫箱中,使用磁力攪拌器混合2 h后,置于200℃高壓反應(yīng)釜反應(yīng)12 h。聚硫烷合成反應(yīng)結(jié)束后,12 000 r/min離心5 min,取上清,于馬爾文激光粒度儀上進(jìn)行聚硫烷粒徑的測(cè)定。制得的聚硫烷平均粒徑在162 nm左右(圖4A),溶液澄清透明呈棕黃色(圖4B)。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 聚硫烷(配方3)的毒性試驗(yàn)毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)聚硫烷灌服劑量達(dá)到39.60 g/kg時(shí),幼雞開始出現(xiàn)死亡,聚硫烷灌服劑量越高,幼雞的病死率越高。當(dāng)聚硫烷灌服劑量達(dá)到101.86 g/kg時(shí),幼雞全部死亡。據(jù)公式LD50=log-1[Xm-i(Σp-0.5)]計(jì)算,得出LD50為65 g/kg。在下述的聚硫烷對(duì)雞白色念珠菌性皮膚病的治療試驗(yàn)中,要求治療劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本研究得出的中毒劑量。

2.5 聚硫烷(配方3)對(duì)雞白色念珠菌性皮膚病的治療作用使用聚硫烷治療雞白色念珠菌性皮膚病的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與生理鹽水(圖5C)組相比,白色念珠菌感染組(圖5A)的傷口紅腫明顯,在伍德氏燈下發(fā)現(xiàn)傷口周圍有大量的黃綠色熒光,說明白色念珠菌大量繁殖,在第4～5天,傷口擴(kuò)大,觸摸傷口有疼痛表現(xiàn)(雞表現(xiàn)興奮、狂躁),第6～9天傷口大小變化不明顯,在第10～13天傷口逐漸縮小自愈,痂皮脫落,伍德氏燈下沒有發(fā)現(xiàn)黃綠色熒光。而聚硫烷治療組(圖5B)在第6天,結(jié)痂脫落,傷口及周圍黃綠色熒光消失,伍德氏燈下沒有發(fā)現(xiàn)黃綠色熒光。

2.6 聚硫烷(配方3)抑制白色念珠菌菌落直徑、抑制孢子萌發(fā)率聚硫烷抑制白色念珠菌菌落直徑結(jié)果顯示(圖6A):在相同生長(zhǎng)周期下(均培養(yǎng)10 d),在YPD固體培養(yǎng)基上,不同質(zhì)量濃度的聚硫烷能夠抑制白色念珠菌菌落的直徑增長(zhǎng)(圖6B),而且聚硫烷對(duì)白色念珠菌的抑制作用隨其質(zhì)量濃度的增加而增加,呈劑量依賴性。

聚硫烷抑制白色念珠菌孢子萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果顯示(圖6C):不同質(zhì)量濃度的聚硫烷能夠顯著抑制孢子萌發(fā)率(P<0.01),其抑制作用隨其聚硫烷質(zhì)量濃度的增加而增加,而且在光學(xué)顯微鏡下(放大10×40倍)也驗(yàn)證了其抑菌作用隨聚硫烷質(zhì)量濃度的增加而遞增的特征(依據(jù)培養(yǎng)液中聚硫烷質(zhì)量濃度從低到高的順序,孢子萌發(fā)率依次平均為86%,25%,8%,2%)(圖6D)。綜上,聚硫烷可以有效抑制白色念珠菌菌落的生長(zhǎng),降低孢子萌發(fā)率,并呈劑量依賴效應(yīng)。

2.7 聚硫烷(配方3)抑制白色念珠孢子轉(zhuǎn)化為菌絲體聚硫烷抑制白色念珠孢子轉(zhuǎn)化為菌絲體結(jié)果顯示(圖7):在未添加聚硫烷組中,由小牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的白色念珠菌在培養(yǎng)10 h后形成了相互交錯(cuò)、致密細(xì)長(zhǎng)的菌絲體(圖7A)。而和未添加聚硫烷組相比,添加0.10 g/L聚硫烷的菌絲體數(shù)量顯著較少(圖7B)(P<0.01),并且隨著聚硫烷質(zhì)量濃度升高(圖7C、D),菌絲體鮮重(依據(jù)聚硫烷質(zhì)量濃度從小到大的順序,每100 mL培養(yǎng)液中菌絲體的鮮重依次變?yōu)闉?.9,1.1,0.9,0.4 g)逐漸降低,與聚硫烷質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。因此聚硫烷抑制了孢子向侵襲性菌絲體的轉(zhuǎn)變,阻斷白色念珠菌的增值和傳播。

2.8 聚硫烷(配方3)誘導(dǎo)白色念珠菌孢子凋亡與壞死白色念珠菌孢子經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后使用顯微鏡觀察并計(jì)算了聚硫烷處理下白色念珠菌孢子的壞死率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在聚硫烷的作用下,白色念珠菌孢子出現(xiàn)壞死,并且壞死率隨著聚硫烷質(zhì)量濃度的升高而增大(圖8A)。此外,還通過PI和Annexin-FITC雙染后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了聚硫烷誘導(dǎo)白色念珠菌孢子的凋亡和壞死情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著聚硫烷質(zhì)量濃度(0,0.10,0.20,0.39 g/L)的升高,白色念珠菌孢子凋亡率(根據(jù)聚硫烷質(zhì)量濃度的增加,凋亡率依次為3.30%,30.70%,43.00%,57.50%)和壞死率(根據(jù)聚硫烷質(zhì)量濃度的增加,壞死率依次為0.39%,12.37%,16.81%,21.51%)相應(yīng)升高(根據(jù)聚硫烷質(zhì)量濃度的增加,依次為圖8B～E)。以上結(jié)果表明,聚硫烷通過劑量依賴性方式誘導(dǎo)白色念珠菌孢子發(fā)生凋亡和壞死。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì),由真菌引起的皮膚感染中,白色念珠菌占感染的80%～90%[27],尤其在氣候劇烈變化、飼料和飼養(yǎng)環(huán)境變化和長(zhǎng)途運(yùn)輸情況下,白色念珠菌感染率更高[28]。本研究在重慶地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)流行性皮膚病的皮屑中分離鑒定出白色念珠菌,通過動(dòng)物回歸試驗(yàn),確認(rèn)分離出的致病菌白色念珠菌可以引起雞皮膚感染,并合成和篩選了具有抗白色念珠菌特性的抗真菌劑聚硫烷,為當(dāng)?shù)厍忠u性白色念珠菌的預(yù)防和治療打下了基礎(chǔ)。

采用不銹鋼釜體和聚四氟乙烯的熱反應(yīng)體系,具有合成方法簡(jiǎn)單,化學(xué)反應(yīng)時(shí)間比較短的優(yōu)點(diǎn)[29],適合大多數(shù)科研院所的科學(xué)試驗(yàn)甚至小規(guī)模中試生產(chǎn)。多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道,通過化學(xué)方法制備的無機(jī)納米材料硫化物抗細(xì)菌和抗腫瘤效果明顯[30-31]。本研究采用次熱反應(yīng)體系快速合成了具有抗侵襲性真菌的聚硫烷,而且在同樣的化學(xué)合成條件下,胱氨酸比半胱氨酸對(duì)白色念珠菌抑菌作用更強(qiáng),其原因可能是胱氨酸比半胱氨酸的有機(jī)含硫量大,從而產(chǎn)生較多的聚硫烷。

本研究發(fā)現(xiàn),聚硫烷能夠抑制白色念珠菌孢子萌發(fā)、抑制孢子向侵襲性菌絲體轉(zhuǎn)變,從而阻斷白色念珠菌的增值和傳播,其抑菌作用與聚硫烷濃度呈正相關(guān)。白色念珠菌孢子通常附著在宿主細(xì)胞上,當(dāng)機(jī)體免疫屏障機(jī)能下降時(shí)白色念珠菌孢子萌發(fā),往往通過角質(zhì)層和上皮層侵入機(jī)體,也就是導(dǎo)致皮膚和黏膜損傷后隨之損傷其他內(nèi)臟器官,最終導(dǎo)致動(dòng)物大范圍發(fā)病甚至大規(guī)模死亡[32]。根據(jù)毒性試驗(yàn)結(jié)果,聚硫烷對(duì)雞LD50為65 g/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于本感染模型使用的治療劑量,因此本研究使用的劑量為安全劑量。本課題組相信后期經(jīng)過合成工藝、合成配方的深入的優(yōu)化后,期待聚硫烷可以更安全和更廣泛地應(yīng)用于生物及醫(yī)藥領(lǐng)域。

綜上,本研究合成并篩選了抗侵襲性真菌的新型抗真菌劑聚硫烷,探究了其對(duì)流行性白色念珠菌的抑菌作用,填補(bǔ)了無機(jī)納米級(jí)硫化物抗侵襲性真菌的研究空白。