楊茗崴,王瑋玉,王裕光,胡俊英,張 群,張芷源,王新平

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人與動物共患傳染病國家重點(diǎn)實驗室/教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實驗室,吉林 長春 130062)

大腸桿菌是一種廣泛存在于人與動物體內(nèi)的機(jī)會性致病菌,可引起人與動物發(fā)生多類型表現(xiàn)的傳染病,如敗血癥、腸炎、尿道炎、菌血癥、肺炎和腦膜腦炎等。本實驗室前期從臨床上呈現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉和神經(jīng)癥狀為特征的羔羊體內(nèi)分離獲得1株大腸桿菌NMGCF-19菌株,發(fā)現(xiàn)NMGCF-19菌株可以通過血腦屏障,引起動物腦膜腦炎[1]。

大腸桿菌具有許多與感染相關(guān)的毒力因子,如P型菌毛、Ⅰ型菌毛、溶血素、細(xì)胞壞死因子等,這些毒力因子在細(xì)胞黏附、損傷宿主細(xì)胞及環(huán)境生存等方面發(fā)揮作用。其中菌毛是大腸桿菌介導(dǎo)菌體黏附在宿主細(xì)胞上的一種重要的黏附因子[2],借助于菌毛對宿主黏膜上皮細(xì)胞的黏附作用,細(xì)菌得以定居,以便進(jìn)一步獲得侵入血液,進(jìn)入器官的通道,并且有研究發(fā)現(xiàn)菌毛在許多腸外致病性大腸桿菌的致病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3],由此我們推斷菌毛與大腸桿菌NMGCF-19菌株突破血腦屏障引起動物腦膜腦炎等致病能力有關(guān)。菌毛中Ⅰ型菌毛起主要黏附作用,該菌毛能與宿主黏膜上皮細(xì)胞上的甘露糖受體發(fā)生特異性結(jié)合,從而導(dǎo)致細(xì)菌黏附在黏膜上皮細(xì)胞上,同時95%大腸桿菌表達(dá)Ⅰ型菌毛,而P型菌毛則是對疾病的進(jìn)一步發(fā)展起重要作用[4-5]。Ⅰ型菌毛與大腸桿菌的致病性密切相關(guān),其fimH蛋白與Ⅰ型菌毛的黏附及免疫反應(yīng)緊密相關(guān),有研究顯示fimH基因廣泛存在于大腸桿菌,因此本試驗將fimH基因作為靶向敲除基因[4-6]。

目前廣泛應(yīng)用于大腸桿菌基因敲除的方法有l(wèi)ambda Red重組系統(tǒng)和自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組基因敲除方法,但前者在同一個細(xì)菌引入多個突變的條件下,每引入一個突變就會影響下一個突變的成功率,還可能造成非所需突變的產(chǎn)生,甚至還會引起細(xì)菌基因組的不穩(wěn)定;后者對某些保守且敲除困難的基因篩選效率極低,進(jìn)而限制其應(yīng)用。由于以上兩種方法的限制性,本研究選擇應(yīng)用基因編輯效率高的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)來完成基因敲除的操作。進(jìn)行基因編輯操作時,CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要轉(zhuǎn)錄兩個RNA片段,一個是前體CRISPR(pre-crRNA),另一個是轉(zhuǎn)錄激活RNA(tracrRNA)[6-9]。這兩個RNA通過堿基配對形成二聚體,與Cas9蛋白結(jié)合,形成復(fù)合物;然后,在pre-crRNA的介導(dǎo)下發(fā)揮Cas9蛋白的HNH與RuvC活性,切割基因組特定位置的DNA,形成DNA雙鏈斷裂[10-23]。JINEK等[24]將pre-crRNA和tracrRNA加工成一條單鏈RNA嵌合體,稱之為gRNA。CRISPR/Cas9中的gRNA 3′端還有一段小的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM),目前證明PAM一般為NGG,是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的必備區(qū)域[8]。為了進(jìn)一步探索NMGCF-19菌株的致病機(jī)制,本研究將應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)和小鼠模型,通過敲除菌株潛在毒力基因fimH及確定其致病性,為闡明NMGCF-19菌株的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

A.pwtCas9-fimH-sgRNA1;B.pwtCas9-fimH-sgRNA3

A.NMGCF-19wild在Amp培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)結(jié)果;B.pwtCas9-N19-fimH-sgRNA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化結(jié)果;C.pwtCas9-N19-fimH-sgRNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化結(jié)果;D.空白Amp培養(yǎng)皿用作陰性對照

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和抗生素大腸桿菌NMGCF-19菌株分離于臨床上呈現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉和神經(jīng)癥狀的羔羊[1-2],由吉林大學(xué)動物檢驗檢疫教研室保存;pwtCas9-fimH-sgRNA1、pwtCas9-fimH-sgRNA3質(zhì)粒均由吉林大學(xué)動物檢驗檢疫教研室成功構(gòu)建并保存;培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基;抗生素為終質(zhì)量濃度100 mg/L的氨芐青霉素。

1.2 主要試劑Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Bbs Ⅰ和氨芐青霉素均購自美國 Thermo Fisher Scientific公司;HE染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌生化檢測試劑盒購自杭州微生物試劑有限公司;膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 實驗動物24只SPF級昆明小鼠(6～7周齡),雌雄各半,購自遼寧長生生物科技有限公司;小鼠飼養(yǎng)條件良好,自由采食及飲水,飼養(yǎng)過程中的晝夜明暗循環(huán)為12 h,室溫控制在(22±0.5)℃之間。

1.4 NMGCF-19fimH-的構(gòu)建利用本實驗室前期測定的NMGCF-19菌株完整基因組序列,獲得fimH基因的序列信息,進(jìn)行sgRNA的設(shè)計,在其5′端分別加上Bbs Ⅰ酶切位點(diǎn)的黏性末端(CACC/AAAC),得到Cas9-fimH-F和Cas9-fimH-R引物,送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列如表1所示。將Cas9-fimH-F、Cas9-fimH-R 稀釋至100 μmol/L,經(jīng)退火形成具有黏性末端雙鏈DNA。反應(yīng)體系Cas9-fimH-F 和Cas9-fimH-R 各10 μL,反應(yīng)程序94 ℃ 5 min,然后以 0.1℃/s 降溫至 4℃。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將pX459質(zhì)粒以Bbs Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,將膠回收產(chǎn)物與退火后形成的雙鏈sgRNA(DNA)進(jìn)行連接,以構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Top10感受態(tài)細(xì)胞,使用質(zhì)粒提取試劑盒將質(zhì)粒提出,經(jīng)PCR及測序驗證后獲得pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體。

表1 敲除載體引物序列

大腸桿菌NMGCF-19菌株電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備,參見文獻(xiàn)介紹方法進(jìn)行[25]。各取1 μL純化后的pwtCas9-fimH-sgRNA1、pwtCas9-fimH-sgRNA3基因敲除載體于1.5 mL離心管中,并將其與電轉(zhuǎn)杯一同置于冰上預(yù)冷,向離心管內(nèi)各加入40 μL解凍的NMGCF-19電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,混勻后冰上放置10 min;將該混合物轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中,電轉(zhuǎn)儀電壓調(diào)節(jié)為2.1 kV進(jìn)行電轉(zhuǎn)操作。

取20 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160 μL LB,混勻后涂布于含有終質(zhì)量濃度為100 mg/L氨芐青霉素的固體平板,37℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆搖菌,使用購自天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌液中的細(xì)菌基因組,用針對fimH基因的特異性引物fimH-up和fimH-dn進(jìn)行PCR檢測。對PCR檢測成功的細(xì)菌,回收其PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆,并送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序;將測序結(jié)果和原基因序列進(jìn)行比對,檢測fimH基因是否敲除成功,檢測成功則獲得NMGCF-19fimH-。

1.5 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild生物學(xué)特性的鑒定以比濁法測定并繪制生長曲線。取NMGCF-19wild和NMGCF-19fimH-各接種于10管3 mL LB液體培養(yǎng)基中,于接種后 0,2,3,4,6,8,10,12,22,24 h 分別收取1管菌液,保存于4℃冰箱內(nèi)。待收集齊所有菌液后,同時測定吸光度值(D600 nm),并以GraphPad Prism 9.0軟件繪制NMGCF-19wild和NMGCF-19fimH-的生長曲線。

以接種環(huán)取適量NMGCF-19wild和NMGCF-19fimH-,接種于各生化鑒定管(半固體培養(yǎng)基、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、蛋白胨水、甘露醇、肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇、棉子糖、MR-VP)中,用封口膜封住,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)后觀察并記錄各鑒定管的變化。

1.6 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild致病性的確定將24只小鼠隨機(jī)分為4組,分別為NMGCF-19菌株接種組、NMGCF-19-F1菌株接種組、NMGCF-19-F3菌株接種組和正常對照組,每組6只,每組小鼠分別腹腔注射濃度為106CFU/0.1 mL的各菌株菌液(N-19、F1、F3)0.1 mL(即NMGCF-19wild的LD50值[3])或同體積生理鹽水,接種后觀察記錄小鼠的活動狀態(tài)與存活情況,并用GraphPad Prism 9.0軟件繪制小鼠的生存曲線。對死亡或發(fā)病小鼠進(jìn)行剖解,取小鼠肝臟、腎臟、肺臟等器官組織,用福爾馬林固定后制作石蠟切片,進(jìn)行 HE染色與病理組織學(xué)變化觀察。同時,取小鼠腦組織進(jìn)行涂片、革蘭染色鏡檢并提取腦組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用于腦組織中緊密連接蛋白的實時熒光定量PCR檢測。緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白基因的引物根據(jù) GenBank 上傳的序列設(shè)計,各基因擴(kuò)增的長度為 100 bp 左右,引物名稱和序列如表2。

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體的構(gòu)建將設(shè)計的sgRNA引物經(jīng)退火處理后與Bbs Ⅰ內(nèi)切酶酶切的pX459質(zhì)粒產(chǎn)物連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒經(jīng)PCR驗證陽性后進(jìn)行基因測序鑒定。結(jié)果如圖1所示,所構(gòu)建的3種pwtCas9-fimH-sgRNA 基因敲除載體中只有pwtCas9-fimH-sgRNA1和pwtCas9-fimH-sgRNA3載體測序結(jié)果正確,構(gòu)建成功率為66.7%。

2.2fimH基因轉(zhuǎn)化效率驗證將成功構(gòu)建的pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體通過電穿孔轉(zhuǎn)化到NMGCF-19菌株感受態(tài)細(xì)胞中,并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板,12 h后的培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示。挑取單克隆搖菌后提取細(xì)菌基因組,PCR擴(kuò)增片段測序確定fimH基因敲除,表明成功構(gòu)建了NMGCF-19fimH-。

2.3 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild的生長速率無顯著性差異比濁法測定并繪制的NMGCF-19wild及NMGCF-19fimH-生長曲線如圖3所示。F1基因敲除株生長速率與NMGCF-19wild基本相同,而F3基因敲除株生長速率與NMGCF-19wild相比略有降低。

圖3 NMGCF-19wild與fimH-sgRNA1(F1)和fimH-sgRNA3(F3)基因敲除菌株的細(xì)菌生長曲線

2.4 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild的生化特性鑒定無顯著性差異接種NMGCF-19fimH-(F1和F3)與NMGCF-19wild的生化鑒定管觀察后結(jié)果記錄如表3所示。NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild相比,只有在對鳥氨酸脫羧酶的利用上存在差異,鑒定結(jié)果NMGCF-19wild呈陰性,而NMGCF-19fimH-呈陽性。

表3 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild生化特性鑒定結(jié)果

2.5 NMGCF-19fimH-的LD50值高于NMGCF-19wild將1.0×106CFU(即NMGCF-19wild的LD50值[1-2])的NMGCF-19fimH-和NMGCF-19wild腹腔注射小鼠,觀察小鼠的活動狀態(tài)及存活情況,記錄結(jié)果如圖4所示。所有腹腔注射NMGCF-19wild和fimH3基因敲除株的小鼠均在24 h內(nèi)死亡,但在12 h時NMGCF-19wild感染的小鼠死亡4只,fimH3基因敲株感染小鼠死亡2只,而fimH1基因敲除株感染的小鼠有4只超過48 h仍存活。結(jié)果表明:NMGCF-19fimH-的LD50值與NMGCF-19wild相比明顯增大。

圖4 NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild的小鼠死亡曲線

2.6 NMGCF-19fimH-感染小鼠腦組織中菌體數(shù)量明顯少于NMGCF-19wild將1.0×106CFU的NMGCF-19fimH-和NMGCF-19wild腹腔注射小鼠,24 h 后對腦組織進(jìn)行涂片,革蘭染色后鏡下觀察結(jié)果如圖5所示。NMGCF-19fimH-感染的小鼠腦組織中未見有或僅見有少量菌體,而NMGCF-19wild感染小鼠腦組織見有大量的細(xì)菌,表明fimH基因敲除后能夠通過小鼠血腦屏障的菌體數(shù)量顯著減少。

A.NMGCF-19wild感染;B.fimH1基因敲除株感染;C.fimH3基因敲除株感染;D.注射同體積生理鹽水用作陰性對照

2.7 NMGCF-19fimH-感染小鼠器官組織的病理變化明顯輕于NMGCF-19wild將1.0×106CFU的NMGCF-19fimH-和NMGCF-19wild腹腔注射小鼠,經(jīng)24 h相同條件飼養(yǎng)后剖解小鼠,取其肝臟、腎臟、肺臟組織作石蠟切片,HE染色后鏡下觀察結(jié)果如圖6所示。NMGCF-19fimH-感染引起的小鼠器官組織DIC、炎性浸潤和組織細(xì)胞變性腫脹等病理變化程度與NMGCF-19wild相比明顯減輕。

A,B,C.注射同體積生理鹽水(正常健康狀態(tài))用作陰性對照的小鼠肝臟、腎臟、肺臟組織;D,E,F.分別為NMGCF-19wild感染小鼠的肝臟、腎臟、肺臟組織;G,H,I.NMGCF-19fimH-感染小鼠的肝臟、腎臟、肺臟組織

2.8 NMGCF-19fimH-感染對小鼠血腦屏障的破壞程度小于NMGCF-19wild本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌NMGCF-19菌株具有破壞動物血腦屏障而侵入腦組織的致病能力。為確定fimH基因敲除對腦組織血腦屏障的影響,運(yùn)用qPCR方法檢測小鼠腦組織中緊密連接蛋白的表達(dá)量。結(jié)果如圖7所示,NMGCF-19fimH-(F1和F3)感染小鼠腦組織中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin在核酸水平上的表達(dá)量與NMGCF-19wild相比顯著上調(diào),表明NMGCF-19fimH-對小鼠血腦屏障的破壞程度明顯小于NMGCF-19wild。

圖7 qPCR檢測NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild感染小鼠腦組織中ZO-1和Occludin核酸表達(dá)量

3 討論

NMGCF-19菌株作為2019年本實驗室從羔羊體內(nèi)分離出的一種腸外致病性大腸桿菌[1-2],可引起動物諸多嚴(yán)重典型的組織器官病變,因此對其毒力因子和致病機(jī)制的研究具有重要意義。本實驗室在前期已完成對該菌株的分離鑒定和全基因組的測序,并確定了NMGCF-19菌株具有突破動物血腦屏障進(jìn)而引起腦膜腦炎的致病能力。本研究為了進(jìn)一步探索NMGCF-19菌株的毒力基因及其初步致病機(jī)制,通過敲除某一潛在毒力基因和比較其與NMGCF-19wild對小鼠的致病性差異,確定基因的毒力。由于菌株的fimH基因蛋白與細(xì)菌Ⅰ型菌毛的黏附及免疫反應(yīng)密切相關(guān),并且我國目前對于大腸桿菌Ⅰ型菌毛的研究相對較少,因此我們選擇fimH基因作為本試驗所敲除的潛在毒力基因。由于目前常用基因敲除方法的自身局限性,我們轉(zhuǎn)向選擇CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)來進(jìn)行基因敲除的操作。

通過設(shè)計sgRNA引物、退火、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、PCR及測序驗證等方法,成功構(gòu)建了pwtCas9-fimH-sgRNA基因敲除載體;將該載體電轉(zhuǎn)NMGCF-19感受態(tài)細(xì)胞后,經(jīng)驗證成功構(gòu)建了NMGCF-19fimH-。將NMGCF-19fimH-與NMGCF-19wild進(jìn)行比較之后發(fā)現(xiàn)NMGCF-19fimH-具有與NMGCF-19wild不同的可以利用鳥氨酸脫羧酶的生物學(xué)特性,而細(xì)菌鳥氨酸脫羧酶在細(xì)菌生長、環(huán)境適應(yīng)、抗生素抗性、生物膜形成等方面起到調(diào)節(jié)作用[26-29];在致病性方面,發(fā)現(xiàn)與NMGCF-19wild相比,NMGCF-19fimH-的LD50值更大,所引起動物組織器官病變的程度更弱,對動物血腦屏障的破壞性更小并且進(jìn)入腦組織的菌體數(shù)量更少,這些結(jié)果表明,fimH基因的敲除可以在一定程度上降低NMGCF-19菌株的致病能力,即fimH基因為NMGCF-19菌株的毒力基因之一。

本研究確定了fimH基因為大腸桿菌NMGCF-19菌株的毒力基因之一,并為進(jìn)一步闡明該菌株的致病機(jī)制和臨床診療提供理論依據(jù)。