何文峰,李 琛,李隆熙,董靚靚,楊國慶,常洪濤,劉慧敏*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)可引起動(dòng)物的腦炎和心肌炎。該病毒屬于微RNA病毒科心病毒屬[1-2]。EMCV感染小鼠在1周內(nèi)出現(xiàn)后肢癱瘓和心肌炎,隨后死亡,表明小鼠在EMCV感染過程中,其中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到了損害[3]。EMCV在世界不同地區(qū)的許多野生和家養(yǎng)動(dòng)物中被檢測到[4-5],它可能是一種潛在的人畜共患病病毒,可以通過攝入被污染的食物、水和患病的尸體傳播[6-7],導(dǎo)致心肌炎、糖尿病以及生殖和神經(jīng)障礙。豬感染EMCV后常呈現(xiàn)急性的局灶性心肌炎并猝死,臨床表現(xiàn)為厭食、麻木、麻痹、癱瘓或呼吸困難,妊娠母豬感染后出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎,仔豬斷奶前患病死亡率可以達(dá)到100%[8-10]。

干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)是干擾素(interferon,IFN)誘導(dǎo)的具有抗病毒活性的類泛素蛋白,是ISGs中被誘導(dǎo)最強(qiáng)烈、最迅速的ISGs之一,在宿主固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[11]。ISG15作為一種關(guān)鍵的ISGs,在對(duì)抗多種病毒入侵過程中發(fā)揮著重要作用。近年來,對(duì)ISG15抗病毒復(fù)制的作用有越來越多的研究[12-13]。然而,ISG15在EMCV復(fù)制、發(fā)病機(jī)制和宿主反應(yīng)中的作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)ISG15能明顯抑制PRV復(fù)制,但是ISG15缺失對(duì)RNA病毒易感性的影響尚未見有報(bào)道,因此,本試驗(yàn)應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),構(gòu)建ISG15基因敲除的小鼠,通過分析EMCV感染后小鼠存活率、病毒滴度、炎性因子表達(dá)等,探究敲除ISG15基因?qū)MCV復(fù)制的影響,以期為進(jìn)一步研究ISG15抑制EMCV復(fù)制的分子機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、EMCV由實(shí)驗(yàn)室保存;SPF級(jí)ISG15-/-C57BL/6N小鼠,7周齡,體質(zhì)量20～22 g,SPF級(jí)野生型C57BL/6N小鼠,7周齡,體質(zhì)量20～22 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自賽業(yè)生物科技有限公司;RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;Lipofectamine 3000購自賽默飛世爾科技公司;ELISA試劑盒購自酶免實(shí)業(yè)有限公司;細(xì)胞凍存液購自賽文創(chuàng)新科技有限公司;無水乙醇、二甲苯、中性樹膠購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HE染色套盒購自賽維爾生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找各目的基因mRNA序列,應(yīng)用Primer-Blast設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表1)。

表1 引物序列

1.3 過表達(dá)ISG15對(duì)EMCV復(fù)制的影響B(tài)HK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)染ISG15質(zhì)粒與空載對(duì)照,按照lipofectamine3000說明書操作,12 h后感染EMCV,分別在0,12,24,36 h時(shí)提取RNA和上清,將RNA反轉(zhuǎn)錄后利用熒光定量PCR檢測VP1的轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)體系10 μL:TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL,上、下游引物(0.2 μmol/L)各0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 min;95℃變性5 s,60℃退火和延伸34 s,共40個(gè)循環(huán)。并選取β-actin作為內(nèi)參基因;上清反復(fù)凍融3次后離心,用實(shí)驗(yàn)室前期建立的病毒噬斑法檢測病毒滴度[14]。

1.4 EMCV感染小鼠后存活率、體質(zhì)量變化及臨床癥狀將小鼠分為ISG15-/-小鼠組(n=10)和野生型小鼠組(n=10),腹腔注射100 μL感染劑量為1×105TCID50的EMCV,每天記錄2組小鼠的體質(zhì)量、死亡情況和臨床癥狀。

1.5 EMCV感染小鼠后病毒滴度的變化2組小鼠(n=6)腹腔注射EMCV,在感染后第4天取腦組織和心臟組織檢測病毒滴度。將小鼠的組織剪碎,加入PBS研磨成勻漿狀,凍融3次,離心取上清液后,通過病毒噬斑法檢測組織中的病毒滴度。

1.6 EMCV感染小鼠后炎性因子的變化2組小鼠腹腔注射EMCV,在感染后第4天采血,并取腦組織和心臟組織。腦組織和心臟組織提取RNA,按1.3方法熒光定量PCR檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平;血液離心后取上清,ELISA試劑盒檢測IL-1β、L-6和TNF-α的表達(dá),具體步驟參照說明書。

1.7 HE染色分析腦組織與心臟組織的病理學(xué)變化感染后4 d,將2組小鼠給予安樂死,取腦組織和心臟組織,4%多聚甲醛固定48 h,脫水后石蠟包埋,并用蘇木精-伊紅染液中染色,中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析作圖,結(jié)果中小鼠體質(zhì)量變化曲線值、病毒滴度、炎癥因子濃度以及轉(zhuǎn)錄水平以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)ISG15對(duì)EMCV復(fù)制的影響為了探究ISG15對(duì)EMCV復(fù)制的影響,本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染ISG15真核表達(dá)質(zhì)粒,12 h后感染EMCV(MOI=1),24 h后提取RNA與上清。熒光定量PCR結(jié)果如圖1A所示,病毒基因VP1轉(zhuǎn)錄水平隨著EMCV的復(fù)制逐漸升高,在不同時(shí)間段過表達(dá)ISG15后病毒基因VP1轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降(P<0.05),病毒噬斑也出現(xiàn)了類似的結(jié)果(圖1B)。結(jié)果表明,ISG15基因可以抑制EMCV的復(fù)制。

A．熒光定量PCR檢測過表達(dá)ISG15后VP1的轉(zhuǎn)錄水平;B．病毒噬斑檢測過表達(dá)ISG15后EMCV的病毒滴度;C.EMCV感染24 h病毒噬斑結(jié)果圖(1.表示細(xì)胞對(duì)照;2～6.表示病毒4倍梯度稀釋);D．EMCV感染過表達(dá)ISG15后病毒噬斑結(jié)果圖(1.表示細(xì)胞對(duì)照;2～6.表示病毒4倍梯度稀釋)

2.2 EMCV感染小鼠后存活率、體質(zhì)量變化及臨床癥狀為了進(jìn)一步探究ISG15在體內(nèi)對(duì)EMCV復(fù)制的影響,EMCV感染ISG15敲除(ISG15-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠,檢測感染后7 d內(nèi)野生型小鼠和ISG15-/-小鼠的生存率和體質(zhì)量變化,并記錄小鼠發(fā)病情況。如圖2A所示,感染EMCV之前ISG15-/-小鼠和野生型小鼠狀態(tài)均正常,而ISG15-/-小鼠在EMCV感染后3 d出現(xiàn)精神不振,離群、動(dòng)作緩慢、后肢癱瘓等癥狀(圖2C),第4天開始出現(xiàn)死亡,第6天病死率為100%;而野生型小鼠在感染后第4天才出現(xiàn)精神萎靡、被毛雜亂、動(dòng)作遲緩等癥狀(圖2C),第5天開始出現(xiàn)死亡,到第7天的病死率為75%。隨著癥狀加重,ISG15-/-小鼠在第3天以后體質(zhì)量明顯下降,并且持續(xù)下降,而野生型小鼠在第5天后又逐漸恢復(fù)體質(zhì)量(圖2B)。這些結(jié)果說明ISG15-/-小鼠對(duì)EMCV更易感。

A.生存率;B.體質(zhì)量變化;C.臨床癥狀

2.3 ISG15基因敲除小鼠對(duì)腦組織和心臟組織病毒滴度的影響野生型小鼠和ISG15-/-小鼠感染后4 d取腦和心臟組織檢測其病毒滴度。ISG15-/-小鼠腦組織的病毒滴度顯著高于野生型小鼠(P<0.05)(圖3A),ISG15-/-小鼠心臟的病毒滴度也顯著高于野生型小鼠(P<0.05)(圖3B)。

A.病毒噬斑檢測腦組織病毒滴度;B.病毒噬斑檢測心臟組織病毒滴度

2.4 ISG15基因敲除小鼠對(duì)炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響一般病毒感染會(huì)引起細(xì)胞因子風(fēng)暴,也是機(jī)體抗感染的一種表現(xiàn)。我們進(jìn)一步通過熒光定量PCR檢測野生型小鼠和ISG15-/-小鼠腦中IL-1β、IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,小鼠腦組織和心臟組織的IL-1β、IL-6和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于野生型小鼠(圖4A～F)。

A～C.熒光定量PCR檢測腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平;D～F.熒光定量PCR檢測心臟中IL-1β、IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 ISG15基因敲除小鼠對(duì)炎性因子蛋白表達(dá)的影響ELISA檢測野生型小鼠和ISG15-/-小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平,結(jié)果顯示,ISG15-/-小鼠的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著高于野生型小鼠(圖5A～C)。這進(jìn)一步表明ISG15-/-小鼠比野生型小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),說明ISG15敲除促進(jìn)EMCV感染的致病性。

A～C.ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平

2.6 HE染色分析腦與心臟組織病理變化腦心肌炎病毒感染引起的腦炎和心肌炎是導(dǎo)致動(dòng)物死亡的關(guān)鍵因素[10]。為了檢測野生型小鼠和ISG15-/-小鼠的腦炎與心肌炎程度,在感染后4 d對(duì)腦組織和心臟進(jìn)行了組織病理學(xué)分析。如圖6A～D所示,ISG15-/-小鼠與野生型小鼠相比,心肌細(xì)胞出現(xiàn)大面積細(xì)胞壞死,組織結(jié)構(gòu)異常,腦組織中神經(jīng)細(xì)胞變性壞死,有大量炎性細(xì)胞浸潤,并嚴(yán)重充血。剖檢發(fā)現(xiàn)ISG15-/-小鼠與野生型小鼠相比,腦和心臟都嚴(yán)重充血(圖6I～L)。

3 討論

EMCV是一種潛在的人畜共患病病原體,該病毒廣泛分布于世界各國,給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15-17],探索有效預(yù)防和治療腦心肌炎的方法顯得尤為重要。大量研究表明ISG15具有抗病毒功能,但其作用因宿主和病毒種類而不同[18-19]。ISG15調(diào)控EMCV復(fù)制的機(jī)制還未見報(bào)道,在大多數(shù)研究中,嚙齒動(dòng)物常被作為動(dòng)物模型進(jìn)行EMCV相關(guān)研究[20]。因此,本試驗(yàn)通過體內(nèi)、體外試驗(yàn)探究ISG15對(duì)EMCV復(fù)制的作用。

本試驗(yàn)前期將ISG15重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞后感染EMCV,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISG15過表達(dá)后病毒基因VP1轉(zhuǎn)錄水平和病毒滴度均顯著低于對(duì)照組,說明體外過表達(dá)ISG15可抑制EMCV的復(fù)制。NAI等[21]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ISG15可以抑制日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的復(fù)制。在人類細(xì)胞中敲低ISG15表達(dá)后促進(jìn)A型流感病毒(influenza virus,IAV)的復(fù)制,表明ISG15可直接拮抗病毒復(fù)制[22]。LI等[23]研究表明ISG15可以抑制CSFV復(fù)制。這些結(jié)果與本試驗(yàn)得出ISG15抑制EMCV復(fù)制的結(jié)果一致。

為了進(jìn)一步研究ISG15在體內(nèi)是否影響EMCV的復(fù)制,本試驗(yàn)通過ISG15-/-小鼠和野生型小鼠感染EMCV的相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,ISG15-/-小鼠更容易感染EMCV,表現(xiàn)為死亡率升高,體質(zhì)量下降更明顯。通過病毒噬斑檢測腦組織和心臟的病毒滴度,結(jié)果表明ISG15-/-小鼠的腦組織和心臟組織的病毒滴度顯著高于野生型小鼠,說明敲除ISG15基因在體內(nèi)促進(jìn)EMCV的復(fù)制。ISG15敲除小鼠的早期研究表明,感染了IAV的ISG15敲除小鼠的死亡率有所增加[24]。PERNG等[13]研究發(fā)現(xiàn)在B型流感病毒(influenza B virus,IBV)感染期間,野生型小鼠的病毒載量在整個(gè)感染過程中保持非常低的水平。同樣,ISG15基因敲除小鼠感染EMCV后體質(zhì)量顯著下降,病毒載量顯著高于野生型小鼠。綜上所述,這些結(jié)果表明ISG15在體外和體內(nèi)均抑制EMCV的復(fù)制。

本試驗(yàn)檢測了感染EMCV小鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)ISG15-/-小鼠體內(nèi)與炎癥相關(guān)的3種細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α轉(zhuǎn)錄與表達(dá)均顯著高于野生型小鼠,這個(gè)結(jié)果與腦炎和心肌炎的病癥相吻合。觀察感染EMCV小鼠腦組織與心臟組織病理學(xué)切片發(fā)現(xiàn),與WT小鼠相比,ISG15-/-小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的心肌炎和腦炎的癥狀,主要為心肌細(xì)胞出現(xiàn)大面積壞死、彌漫性炎癥和腦組織的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死及充血現(xiàn)象。有研究表明腦損傷主要是血管周圍單核細(xì)胞浸潤,心肌損傷主要表現(xiàn)為心肌壞死和細(xì)胞浸潤[10],與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這些組織病理學(xué)變化為觀察野生型小鼠感染EMCV后出現(xiàn)的嚴(yán)重神經(jīng)癥狀,包括后肢癱瘓、精神沉郁、動(dòng)作緩慢等提供了形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)[25]。結(jié)果表明,ISG15敲除提高了EMCV的感染力以及復(fù)制。

通過RT-qPCR和病毒噬斑的方法初步發(fā)現(xiàn)在體外ISG15顯著抑制EMCV的復(fù)制。進(jìn)一步通過病毒噬斑、RT-qPCR、ELISA、HE染色等方法發(fā)現(xiàn)腹腔注射EMCV后,ISG15敲除小鼠組織的病毒滴度、死亡率、炎性因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá)均高于野生型小鼠,說明在體內(nèi)ISG15也具有抑制EMCV復(fù)制的作用。本試驗(yàn)為ISG15在體外和體內(nèi)均抑制EMCV復(fù)制提供了證據(jù),為EMCV感染提供了新的宿主細(xì)胞免疫治療靶點(diǎn)。