李紅麗,閆巍文,閆益波,劉一飛,喬國峰,孟冬霞,王志宇

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西 太谷 030801;2.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春130062)

大腸桿菌是動物體內(nèi)一種常在寄生菌,其能夠促進動物代謝,合成動物所需的的維生素C和維生素K,并在動物免疫調(diào)節(jié)方面起著重要的作用[1]。然而大腸桿菌也是一種條件致病菌,一部分致病性大腸桿菌可以引起動物腹瀉,胃腸道損傷及敗血癥等病癥[2]。根據(jù)大腸桿菌O抗原可以將其分為170多種血清型[3],且難以通過血清型區(qū)分致病性菌株與非致病性菌株,KAIT等[4]研究發(fā)現(xiàn)非致病細菌可以通過改變必需基因的功能來獲得毒力特性,同時致病菌株產(chǎn)生的致病因子各不相同[5]。因此為了摸清大腸桿菌的關(guān)鍵致病因子,對本實驗室先前所分離的牛源大腸桿菌進行了小鼠致病性試驗。通過觀察統(tǒng)計各試驗組小鼠臨床癥狀以及小鼠攻毒后血清中C反應(yīng)蛋白和促細胞炎癥因子的濃度變化,對各分離株致病性進行測定,進而確定牛源大腸桿菌致病性的關(guān)鍵因子。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和試驗動物20株牛源大腸桿菌菌株由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院實驗室分離保存,各分離株血清型與所含毒力基因見表1,6～7周齡的雄性小鼠購買自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

表1 20株試驗菌株O抗原血清型及其攜帶的毒力基因

1.2 主要試劑小鼠血清中急性反應(yīng)蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠白細胞介素8酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購自AndyGeneCo.,Ltd公司。

A.小鼠腸道膨脹圖;B.小鼠脾臟梗死圖;C.小鼠胃黏膜水腫

1.3 動物致病性試驗將購買的150只6～7周齡的雄性小鼠飼養(yǎng)觀察3 d后,挑選體質(zhì)量相近活潑健康的小鼠132只隨機分為22組,每組6只,設(shè)對照組2組,根據(jù)所要灌服的牛源大腸桿菌的不同菌株將試驗組分為20組,隨后稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量。對各試驗組小鼠灌服0.2 mL濃度為5×108CFU/mL的對應(yīng)大腸桿菌菌液,對照1組不灌服任何東西,對照2組則灌服0.2 mL生理鹽水,攻毒后繼續(xù)飼養(yǎng)72 h,每12 h觀察小鼠的精神狀態(tài),并對死亡小鼠進行解剖。在攻毒72 h后,對存活小鼠稱取體質(zhì)量并做好記錄之后,將每只存活小鼠摘除眼球,用1.5 mL離心管收集眼眶下靜脈血1 mL左右,在37℃溫箱放置0.5 h,待血液自然凝固后,4 000 r/min離心10 min 后,仔細收集上清液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清中C反應(yīng)蛋白和促炎癥細胞因子的測定借助小鼠CRP酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠白細胞介素8酶聯(lián)免疫分析試劑盒和小鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒對保存的小鼠血清進行C反應(yīng)蛋白和促炎癥細胞因子含量測定,試劑盒從冷藏柜中取出,在室溫放置 30 min開始使用,按照試劑盒說明書進行操作,在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔10孔,將標(biāo)準(zhǔn)樣品進行稀釋加樣,設(shè)空白孔和待測樣品孔,以空白孔調(diào)零,測量各孔的D值,以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo),D值為橫坐標(biāo),計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,代入各檢測樣品的D值計算出樣品的實際濃度。

1.5 統(tǒng)計與分析所有的試驗數(shù)據(jù)都使用Excel進行初步處理,使用SPSS22.0軟件對試驗組和對照組進行組間差異分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠致病性試驗后臨床表現(xiàn)22組小鼠在攻毒12 h后,試驗組小鼠大多出現(xiàn)進食量減少,精神萎靡,呆滯等現(xiàn)象,至攻毒后24 h陸續(xù)有小鼠死亡,部分小鼠出現(xiàn)拉稀,尾部被糞便沾染,被毛雜亂無光,至攻毒72 h后,試驗組小鼠共計死亡23只。對死亡的小鼠進剖檢后,發(fā)現(xiàn)其腸道膨脹,有多量黃色液體狀內(nèi)容物和氣體(圖1A),腸黏膜呈急性卡他性炎癥變化,脾臟有出血梗死灶(圖1B),胃黏膜有膠凍樣水腫且有彌漫性出血點(圖1C)。在整個試驗期間,2個對照組小鼠則精神活潑,食欲正常,被毛光滑。

2.2 小鼠攻毒前后體質(zhì)量變化數(shù)據(jù)分析在攻毒前將22組的所有小鼠都稱量體質(zhì)量,做好記錄,設(shè)2個對照組,20組試驗組,使用SPSS22.0軟件進行單因子方差分析,對22組小鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)進行組間差異分析,結(jié)果顯示(圖2),小鼠平均體質(zhì)量 (22.04±1.01)g,22組小鼠體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)攻毒后72 h,試驗3,5,10和20組的小鼠全部存活,此外,與攻毒前相比體質(zhì)量增加了0.69～0.87 g,與2個對照組小鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù)組間比較差異不顯著(P>0.05),表明所灌服菌液并未影響小鼠正常生長。而其余16組試驗組小鼠則出現(xiàn)了體質(zhì)量明顯下降的現(xiàn)象,比攻毒前體質(zhì)量下降了0.93～1.64 g,且部分小鼠死亡,這16組試驗組與2個對照組小鼠體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)(圖3),表明灌服的菌液對小鼠的生長產(chǎn)生了抑制作用。

標(biāo)注相同字母組間差異不顯著(P>0.05),不同字母組間差異顯著(P<0.05)。下同

圖3 小鼠攻毒前和攻毒后72 h體質(zhì)量變化圖

2.3 小鼠攻毒后血清中C反應(yīng)蛋白濃度變化分析C反應(yīng)蛋白(CRP)是五肽家族中的一種多肽分子。CRP是在機體受到感染時血漿中一些急劇上升的急性蛋白,它能夠激活補體及加強吞噬細胞的吞噬作用,清除入侵機體的病原微生物,在炎癥反應(yīng)中起著積極作用,使機體具有非特異性抵抗力,臨床上常用機體血清中CRP的濃度作為炎癥性疾病的指標(biāo)[6]。

攻毒后72 h,與2對照組相比試驗3,5,10和20組小鼠血清中CRP濃度相近,質(zhì)量濃度是38.2～44.8 μg/L,組間比較無顯著差異(P>0.05),而其余16組試驗組小鼠血清中CRP質(zhì)量濃度是60.56～87.77 μg /L,與2個對照組相比CRP濃度顯著增高(P<0.05),血清中C反應(yīng)蛋白的濃度升高,表明這16組小鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng),造成小鼠的采食量下降,體質(zhì)量呈明顯下降(圖4)。

圖4 小鼠攻毒后72 h血清中C反應(yīng)蛋白濃度組間差異圖

2.4 小鼠攻毒后血清中白細胞介素-8(IL-8)濃度變化分析IL-8是一類結(jié)構(gòu)類似于血小板因子4的小分子細胞因子家族,由巨噬細胞和間充質(zhì)細胞在炎性刺激下產(chǎn)生,其可以激活中性粒細胞,誘導(dǎo)趨化、胞吐等。IL-8在急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起重要作用,其僅由72個氨基酸構(gòu)成,使它可在局部炎癥部位迅速合成,并完成聚集和激活急性炎癥細胞的功能[7-8]。

經(jīng)檢測,在攻毒后72 h試驗3,5,10和20組小鼠血清中IL-8濃度與對照組無顯著差異(P>0.05),而其余16組試驗組小鼠血清中IL-8濃度則顯著升高,與2個對照組相比差異顯著(P<0.05),表明這16組試驗組中小鼠在灌服菌液后出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)(圖5)。

圖5 小鼠攻毒后72 h血清中白介素8濃度組間差異圖

圖6 小鼠攻毒后72 h血清中TNF-α質(zhì)量濃度組間差異圖

圖7 20株大腸桿菌攜帶毒力基因預(yù)警值

2.5 小鼠攻毒后血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度變化分析腫瘤壞死因子α(TNF-α) 是一種由巨噬細胞/單核細胞在急性炎癥期間產(chǎn)生的炎性細胞因子,負責(zé)細胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo),可導(dǎo)致細胞壞死或細胞凋亡[9]。由圖5可觀測到,攻毒后72 h,D1組小鼠血清中TNF-a的質(zhì)量濃度是91.86 ng/L,D2組小鼠血清中TNF-a的質(zhì)量濃度是93.92 ng/L,經(jīng)組間差異分析,P>0.05,差異不顯著。

攻毒后72 h,試驗3組小鼠血清中TNF-a濃度是100.10 ng/L,試驗5組是102.49 ng/L,試驗10組是100.50 ng/L,試驗20組是102.09 ng/L,這4組小鼠與對照組小鼠血清中TNF-a濃度進行組間差異分析,P>0.05,結(jié)果顯示差異不顯著。

其余16組試驗組小鼠血清中TNF-a質(zhì)量濃度是130.56～190.31 ng/L,這16組試驗小鼠和對照組小鼠血清中TNF-a濃度進行組間差異分析,P< 0.05,結(jié)果顯示差異顯著。這16組試驗組小鼠血清中TNF-α濃度顯著升高,表明這些小鼠在灌服菌液后出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。

2.6 致病性大腸桿菌預(yù)警方法的建立根據(jù)對于之前結(jié)果統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)了試驗3,5,10和20組外的各試驗組使用的菌株具有相同特性,即同時攜帶黏附素與腸毒素基因。且先前研究發(fā)現(xiàn)在黏附素存在情況下,致病性大腸桿菌隨毒力基因個數(shù)增加而增強[10]。因此,以此現(xiàn)象作者建立了一種大腸桿菌預(yù)警方法。

我們將牛源大腸桿菌的9種毒力基因分為兩類,以是否攜帶黏附素如K88、K99、987P、F41為第一變量,如含有則記1分,不含則記0分;以所含腸毒素基因個數(shù)設(shè)定為第二變量,每攜帶一種則加0.2分,將兩變量相加則為預(yù)警值。公式如下:

預(yù)警指示值(y)=黏附素值(x1)+腸毒素值(0.2×x2)

以此次試驗結(jié)果為例:試驗3,5組的預(yù)警值為0.4,試驗10組的預(yù)警值為1.0,試驗20組的預(yù)警值為0.2,這4組大腸桿菌都未引起小鼠體質(zhì)量和精神狀態(tài)的改變,血清中C反應(yīng)蛋白、促炎癥因子濃度也沒有顯著升高,所以判定這4組所注射菌株為可疑致病性大腸桿菌。通過對小鼠致病性試驗等結(jié)果統(tǒng)計,通過數(shù)據(jù)分析計算出能引起牛臨床癥狀的致病性大腸桿菌的預(yù)警值y≥ 1.2分,定為致病性大腸桿菌,需要采取措施進行治療;0

3 討論

大腸桿菌是一種基因和表型多樣化的細菌物種。在宿主-細菌關(guān)系方面,大腸桿菌的多樣性范圍尤其明顯,它可以是多種宿主物種胃腸道中的互惠者、共生者、病原體或共生體。在每個大的類群中,有幾個毒株的亞類群具有相同的毒力因子和相似的臨床表現(xiàn),這些亞類群被稱為致病型[11-12]。在人類中,致病菌株被廣泛分類為腹瀉性大腸桿菌或腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)[13]。ExPEC通常無癥狀地駐留在腸道內(nèi),但當(dāng)允許定殖腸外壁時,會引起嚴(yán)重感染[14]。而牛源大腸桿菌是否具有相同的特點,其致病性的關(guān)鍵因子為何,則尚不清楚。

因此為了探究上述問題,作者開展了致病性試驗,并對攻毒72 h后各試驗組小鼠血清中的CRP、IL-8、TNF-a濃度進行測定。CRP是一種在系統(tǒng)發(fā)育上高度保守的血漿蛋白,在脊椎動物和許多無脊椎動物中都有同源物,參與全身對炎癥的反應(yīng),在組織損傷或感染后的幾小時內(nèi),它的合成迅速增加,這表明它有助于宿主防御,是先天免疫反應(yīng)的一部分[15]。它的血漿濃度在炎癥狀態(tài)下增加,這一特征長期以來一直用于臨床檢測[6]。IL-8工作溫度區(qū)間廣且耐蛋白質(zhì)酶分解,并對酸性環(huán)境相對耐受。這些生化特性使其成為急性炎癥部位的理想功能分子,以承受次優(yōu)條件,如膿腫內(nèi)的膿液中?？蓹z測到該物質(zhì)。因此,IL-8在感染、炎癥、缺血、創(chuàng)傷等多種組織中產(chǎn)生,被認(rèn)為是局部中性粒細胞聚集的主要原因[16]。TNF-α是最重要的促炎細胞因子之一,通過表達黏附分子參與血管擴張和水腫形成,以及白細胞與上皮的黏附,它調(diào)節(jié)血液凝固,促進炎癥部位的氧化應(yīng)激,并間接引起發(fā)燒[17]。3種因子濃度的升高,則表示了機體炎癥的發(fā)生,此時通常機體則會出現(xiàn)體質(zhì)量下降的情況[18],這與本研究結(jié)果不謀而合,16組體質(zhì)量明顯下降試驗組的血清中3種因子皆顯著增加,表明機體炎癥的發(fā)生,揭示了注射菌株的致病性。

這與試驗組16組小鼠血清中TNF-α和IL-8的濃度顯著升高相符合,由此發(fā)現(xiàn)了具有致病性的菌株基因組皆同時包含黏附素與腸毒素基因,黏附素(K88、K99、987P、F41)可促使菌株吸附在腸上皮細胞,這導(dǎo)致腸道蠕動和腸分泌液都不能將其沖刷掉[19],之后定植菌株所分泌的腸毒素(STa、STb、LT、stx-1、stx-2)使細胞內(nèi)ATP轉(zhuǎn)化為cAMP,當(dāng)cAMP增加后導(dǎo)致腸液過渡分泌,超過腸道的吸收能力后則引起腹瀉,發(fā)熱等一系列炎癥反應(yīng)[20-23]。以此初步建立了一種預(yù)警機制,對之后評估大腸桿菌致病性提供參考,為在養(yǎng)殖場快速預(yù)警需求提供方案,并為后續(xù)牛源大腸桿菌防治提供了思路。當(dāng)然此方法目前還存在諸多不足,如尿路致病性大腸桿菌 (UPEC) 是約 90% 的人類尿路感染的病原體,是一種獨特的ExPEC病原型,只有該特殊亞群引起尿路感染,而非隨便一種腸道大腸桿菌轉(zhuǎn)移至尿路便可引起反應(yīng)[24],對于其特異性的致病反應(yīng),當(dāng)前研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)毒力島(PAI)與其相關(guān),這些毒力島可以攜帶重要的毒力因子,如P菌毛、Ⅰ型菌毛、溶血素、鐵獲取蛋白、細菌素和與以葡萄糖和麥芽糖為主要底物的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶Ⅱ有關(guān)的MalX基因[25]。因此,牛源大腸桿菌致病性的評估變量需要進一步擴充,而這也需要進一步的機制研究來完善補充。以此更為精確的區(qū)分無致病性大腸桿菌,從而避免藥物的濫用,提高生產(chǎn)效益,助力我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的長足發(fā)展。