何晶晶　蔣貴瑜　駱沁羽　劉紹歡

【摘要】目的：優(yōu)化并確立蜜炙枇杷葉最佳炮制工藝。方法：參照2020年版《中國(guó)藥典》，以不同切制規(guī)格、不同料蜜比作為考察因素，以外觀性狀，水分、灰分、浸出物，總黃酮、齊墩果酸和熊果酸含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行蜜炙枇杷葉炮制工藝優(yōu)化研究。結(jié)果：枇杷葉最適宜切制規(guī)格為段，最佳料蜜比為100∶10。結(jié)論：拓寬了枇杷葉的切制規(guī)格、料蜜比炮制工藝，為枇杷葉炮制品的生產(chǎn)優(yōu)化提供了數(shù)據(jù)參考。

【關(guān)鍵詞】枇杷葉；炮制工藝；總黃酮；齊墩果酸；熊果酸

【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）21-0048-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.21.zgmzmjyyzz202318012

Study on Processing Technology of Folium Eriobotryaeby HoneyHE Jingjing1JIANG Guiyu1LUO Qinyu2LIU Shaohuan2，3*

1.Pharmacy School， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China;

2.Pharmacy School， Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China;

3.Key Laboratory of Utilization of Natural Medicines， Guizhou Medical University， Guiyang 550025，ChinaAbstract：Objective To optimize and establish of honey processed Folium Eriobotryae processing technology.Methods According to The Chinese Pharmacopoeia（2020）， the processing technology optimization of honey-processed Folium Eriobotryae was studied by taking different cutting rules and honey refining ratio as factors， and the contents of appearance characters， water， ash， extract， total flavonoids， oleanolic acid and ursolic acid as indexes.Results The most suitable cutting specification of Folium Eriobotryae is to cut segments， and the optimum ratio of honey is 100∶10.Conclusion This study broadens the cutting specifications and the material to honey ratio of the Folium Eriobotryae concoction process， which provided a data reference for optimising the industrial production of Folium Eriobotryae.

Keywords：Folium Eriobotryae; Processing Technology; Flavonoids;Oleanolic Acid; Ursolic Acid

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）LindL.的干燥葉［1］，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品，歸肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳、降逆止嘔等功效，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘氣、胃熱嘔逆及煩熱口渴等癥［2］。枇杷葉不同炮制方法對(duì)其功效及作用部位差異較為明顯［3］。研究發(fā)現(xiàn)，枇杷葉水提物有抗炎、祛斑等作用［4-5］，其葉浸液具有抗炎和鎮(zhèn)痛的潛力［6］。枇杷葉三萜酸能有效減輕小鼠內(nèi)臟中心性肥胖、脂異常和炎癥反應(yīng)等［7］。

查閱文獻(xiàn)［8-10］發(fā)現(xiàn)，少見關(guān)于枇杷葉不同切制規(guī)格、不同料蜜比進(jìn)行炮制工藝優(yōu)化相關(guān)研究。故本實(shí)驗(yàn)從切制規(guī)格、料蜜比入手，優(yōu)化蜜炙枇杷葉最佳炮制工藝，為枇杷葉炮制品的優(yōu)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1儀器與材料

1.1儀器FA2204N電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；SX-10-12箱式電阻爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV-2700紫外分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）；Ultimate3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）等。

1.2材料乙醇（純度95%，批號(hào)20200309，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉（批號(hào)20150115，重慶江川化工有限公司）；硝酸鋁（批號(hào)20140421，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁（純度≥98%，批號(hào)180604，廣州分析測(cè)試中心科力技術(shù)開發(fā)公司）；齊墩果酸（純度91.1%，批號(hào)110709-201808，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；熊果酸（純度99.9%，批號(hào)110742-201823，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈（批號(hào)20200924，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（批號(hào)20201111，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）等。乙腈、甲醇為色譜純，其他均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1炮制工藝流程圖如圖1所示。

2.2樣品的制備實(shí)驗(yàn)用枇杷葉由筆者采集，由貴州醫(yī)科大學(xué)劉紹歡老師鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）LindL.的葉。枇杷葉采摘后，對(duì)其進(jìn)行清洗，刷去絨毛，晾曬至表面水分干燥，切成2～3 mm的細(xì)絲（編號(hào)為Y0～Y7）、5～10 mm的寬絲（編號(hào)Y10～Y17）、10～15 mm的段（編號(hào)Y20～Y27）3種規(guī)格。分別取熟蜜，加適量水稀釋，加入枇杷葉細(xì)絲/寬絲/段內(nèi)拌勻，悶潤(rùn)至透，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至不粘手為度，取出晾涼；干燥粉碎后備用。見表1。

2.3水分、灰分、浸出物測(cè)定

2.3.1水分測(cè)定參照2020年版《中國(guó)藥典》四部［1］水分測(cè)定法（通則0832）項(xiàng)下的烘干法。由表2可知：蜜炙枇杷葉水分符合2020年版《中國(guó)藥典》一部炙枇杷葉【檢查】項(xiàng)下規(guī)定；相同料蜜比、不同切制規(guī)格中切段的水分值最高；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，水分值隨著料蜜比的增加而降低；生品水分值最高。

2.3.2總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定參照2020 年版《中國(guó)藥典》第四部灰分測(cè)定法（通則2302）項(xiàng)下的總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定法進(jìn)行。由表3可知：結(jié)果顯示不同炮制工藝枇杷葉Y（1～4、11～13、21～24）總灰分超過《中國(guó)藥典》一部炙枇杷葉【檢查】項(xiàng)下限度要求，超出的原因可能與產(chǎn)地、加工方法、貯藏條件有關(guān)［11］。枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，細(xì)絲、寬絲、段的總灰分值相近；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，總灰分值隨著料蜜比的增加而降低；生品總灰分值最高。不同炮制工藝枇杷葉酸不溶性灰分值無(wú)明顯變化。

2.3.3浸出物測(cè)定參照2020年版《中國(guó)藥典》四部醇溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法進(jìn)行操作。由表4可知：蜜炙枇杷葉醇溶性浸出物符合2020年版《中國(guó)藥典》一部炙枇杷葉【浸出物】項(xiàng)下規(guī)定；枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，浸出物值相近；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，浸出物值隨著料蜜比的增加而增加；生品浸出物值最低。

2.4UV-Vis法測(cè)定總黃酮含量

2.4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品6.50 mg至25 mL容量瓶，加入80%乙醇制成濃度為254.8 μg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.4.2供試品溶液的制備分別稱取樣品粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇15 mL，在40 ℃下提取1 h，放冷，稱重，加80%乙醇補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.4.3顯色條件分別取對(duì)照品、供試品溶液1 mL，加入蒸餾水4 mL，搖勻，加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁0.5 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉4 mL，搖勻，靜置15 min，在510 nm處測(cè)定吸光度［12］。

2.4.4方法學(xué)考察

2.4.4.1線性關(guān)系考察取適量蘆丁對(duì)照品溶液于10 mL容量瓶中分別配成0 μg/mL、25.48 μg/mL、38.22 μg/mL、50.96 μg/mL、63.70 μg/mL、76.44 μg/mL6種不同濃度，按“2.4.3”項(xiàng)下的顯色條件進(jìn)行顯色，以蒸餾水作為空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程：Y=0.0101X-0.0053，R2=0.9997。結(jié)果表明，蘆丁在0～76.44 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4.2精密度試驗(yàn)精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下的顯色條件進(jìn)行顯色，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.3重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下的顯色條件進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為2.39%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下的顯色條件進(jìn)行顯色，分別于顯色后的0 min、10 min、20 min、30 min、40 min測(cè)定吸光度并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為2.87%，表明樣品在40 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4.5加樣回收試驗(yàn)取已知總黃酮含量為8.7692 mg/g的藥材粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入濃度為2.1952 mg/mL蘆丁溶液1 mL，按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下的顯色條件進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示加樣回收率均值為101.77%，RSD為1.93%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.4.5總黃酮含量測(cè)定精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下的顯色條件進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度并代入回歸方程計(jì)算總黃酮含量。由表5可知：生品總黃酮含量最高。枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，切段的總黃酮含量略高；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，總黃酮含量隨著料蜜比的增加而降低。

2.5HPLC法測(cè)定齊墩果酸、熊果酸含量

2.5.1對(duì)照品溶液的制備取齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品適量，置于同一容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度線，配置成濃度為50.47 μg/mL、206.29 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.5.2供試品溶液的制備精密稱取樣品粉末0.5 g，置于150 mL錐形瓶中，加入95%乙醇25 mL，稱重，超聲30 min，再次稱重，補(bǔ)足減失重量，濾過，取續(xù)濾液，再過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.5.3色譜條件采用Shim-Pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-甲醇（B）-0.5%醋酸銨（C） （67∶12∶21）；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫為23 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.5.4方法學(xué)考察

2.5.4.1系統(tǒng)適用性考察精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.5.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖2），結(jié)果說明方法專屬性良好、分離度良好。

2.5.4.2線性關(guān)系考察取適量的齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品分別配制成0 μg/mL、5.2327 μg/mL、8.7212 μg/mL、14.5354 μg/mL、24.2256 μg/mL、40.3760 μg/mL、50.4700 μg/mL與0 μg/mL、21.3885 μg/mL、35.6475 μg/mL、59.4125 μg/mL、99.0209 μg/mL、165.0348 μg/mL、206.2935 μg/mL 7種不同濃度。按“2.5.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），得到線性回歸方程：Y（齊墩果酸）=0.0815X+0.0005，R2=0.9999；Y（熊果酸）=0.0724X-0.0265，R2=0.9999。結(jié)果表明齊墩果酸、熊果酸分別在0～50.4700 μg/mL、0～206.2935 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.4.3精密度試驗(yàn)取上述兩種對(duì)照品混合溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值分別為1.6%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.4重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.5.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值分別為1.49%、1.41%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.5.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下的色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為0.99%、0.46%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4.6加樣回收試驗(yàn)取已知齊墩果酸、熊果酸含量的枇杷葉藥材粉末9份，每份0.25 g，加入對(duì)照品混合溶液后，制備成供試品溶液（第1～3份，加入已知含量的50%；第4～6份加入已知含量的100%；第7～9份加入已知含量的150%），按“2.5.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示齊墩果酸、熊果酸的加樣回收率均值分別為98.18%（RSD=1.93%）、98.75%（RSD=2.20%），表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.5.5齊墩果酸、熊果酸含量測(cè)定由表6可知：枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，齊墩果酸、熊果酸含量相近；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，齊墩果酸、熊果酸含量隨著料蜜比的增加而降低；生品齊墩果酸、熊果酸含量最高。

2.6炮制工藝指標(biāo)優(yōu)化以齊墩果酸、熊果酸、總黃酮、醇溶性浸出物等含量及外觀性狀評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素考察對(duì)蜜炙枇杷葉工藝進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

2.6.1外觀形狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照 2020 年版《中國(guó)藥典》第一部炙枇杷葉【性狀】項(xiàng)下規(guī)定，確定性狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。見表7。

2.6.2內(nèi)在指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要程度，將指標(biāo)分為3個(gè)層次，按齊墩果酸=熊果酸＞總黃酮＞浸出物=水分=總灰分=酸不溶性灰分＞外觀性狀的優(yōu)先順序，利用yaahp v10.3應(yīng)用軟件構(gòu)建各指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣，給予齊墩果酸、熊果酸的權(quán)重均為0.2918，給予醇溶性浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分的權(quán)重均為0.0607，分別給予總黃酮含量的權(quán)重為0.1462、外觀性狀為0.0274，并對(duì)矩陣進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算出一致性比（CR）=0.0161＜0.10，表明該指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣具有滿意的一致性，求得的權(quán)重系數(shù)有效。

將以上得到權(quán)重的各指標(biāo)加權(quán)綜合評(píng)分，得出綜合評(píng)分OD=（0.2918A/Amax+0.2918B/Bmax+0.1462C/Cmax+0.0607D/Dmax+0.0607E/Emax+0.0607F/Fmax+0.0607G/Gmax+0.0274H/Hmax）×100。見表8。其中A～H分別表示齊墩果酸含量、熊果酸含量、總黃酮含量、浸出物值、水分值、總灰分值、酸不溶性灰分值及外觀性狀得分。其中Amax-Hmax分別表示上述各數(shù)值的最大值，綜合評(píng)分越高表示樣品質(zhì)量越好。

2.6.3料蜜比考察基于上述結(jié)論可知，切段炮制品的水分值、總黃酮含量高于細(xì)絲、寬絲，其余指標(biāo)相近，故稱取切制成段后枇杷葉7份，每份100 g，在不同料蜜比（料蜜比分別為100∶5、100∶10、100∶20、100∶40、100∶60、100∶80、100∶100）下按照前述炮制要求進(jìn)行炮制、測(cè)定；考察不同料蜜比下對(duì)綜合評(píng)分的影響，結(jié)果顯示（圖2）料蜜比=100∶10時(shí)炮制品綜合評(píng)分最高。

2.6.4切制規(guī)格考察稱取生枇杷葉3份，每份100 g，切制成不同規(guī)格（細(xì)絲、寬絲、段），在料蜜比為100∶10時(shí)按照前述炮制要求進(jìn)行炮制、測(cè)定；考察不同切制規(guī)格下對(duì)綜合評(píng)分的影響，結(jié)果顯示（圖3）切制成段的炮制品綜合評(píng)分最高。

3結(jié)論與討論

枇杷葉中的三萜類成分具有鎮(zhèn)咳、抗炎等作用［13-14］，研究［15-16］發(fā)現(xiàn)在不同炮制品中總?cè)坪坑休^大差異，其中蜜炙品總?cè)坪孔罡?，且齊墩果酸和熊果酸（五環(huán)三萜類化合物）性質(zhì)穩(wěn)定、含量較大。

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)3種提取溶劑（95%乙醇、無(wú)水乙醇、甲醇）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)95%乙醇更穩(wěn)定，故選擇95%乙醇作為供試品的提取溶劑；通過對(duì)3種不同色譜柱（Shim-Pack GIST、Shim-Pack GIS、 Diamonsil）在不同檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速、進(jìn)樣量條件下進(jìn)行考察，根據(jù)峰數(shù)目、基線平穩(wěn)度、信號(hào)響應(yīng)值、分離度，確定色譜柱為Shim-Pack GIS C18，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為23 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

齊墩果酸和熊果酸互為同分異構(gòu)體，均為弱酸性五環(huán)三萜類化合物，兩者極其相似，故在同時(shí)含有齊墩果酸和熊果酸的植物中很難分離兩者［17］。2020年版《中國(guó)藥典》中所用流動(dòng)相含有醋酸銨鹽，而通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)［18］發(fā)現(xiàn)，水相是醋酸銨時(shí)，峰型和分離度都得到提高和改善，但其在210 nm處存在紫外吸收，從而使基線呈現(xiàn)波浪狀，影響成分檢查的結(jié)果，故將流動(dòng)相進(jìn)行混勻后使用。

本實(shí)驗(yàn)過程中相同切制規(guī)格、不同料蜜比樣品的水分值、灰分值、總黃酮含量、齊墩果酸和熊果酸含量隨著料蜜比的增加而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，浸出物值隨著料蜜比的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；通過單因素考察分析結(jié)果可知枇杷葉最適宜切制規(guī)格為段，最佳料蜜比為100∶10。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-02-11編輯：陶希睿）