張靖勇,賀 明

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 骨科,遼寧 沈陽110000)

骨肉瘤是一種轉(zhuǎn)移率高、惡性程度高的原發(fā)性骨腫瘤,最常見于青少年和兒童[1]。近年來,隨著新輔助化療與保守手術(shù)切除的結(jié)合,骨肉瘤患者的5年存活率從以往的不足20%提高至60%以上[2]。但骨肉瘤患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移這兩大難題仍然難以解決,約有1/3的患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā),其中轉(zhuǎn)移患者復(fù)發(fā)率可高達1/4[3]。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)家族包含13種不同的絲氨酸/蘇氨酸激酶,CDK6和與其高度同源的CDK4是較為經(jīng)典的細胞周期激酶,它們通過與D型細胞周期蛋白(D1、D2和D3)結(jié)合,調(diào)節(jié)細胞周期進展和轉(zhuǎn)錄等多種關(guān)鍵細胞進程。這些激酶的異常激活會導(dǎo)致細胞周期紊亂,從而使細胞的增殖出現(xiàn)失控,進一步導(dǎo)致癌癥的發(fā)展[4]。MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA,它可以識別靶信使RNA(mRNA)3’端非翻譯區(qū)的特定種子序列并與之結(jié)合,通過降低mRNA自身結(jié)合的穩(wěn)定性或干擾蛋白質(zhì)的翻譯對基因的表達產(chǎn)生影響[5]。在增殖、分化、凋亡和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的背景下,miRNAs參與機體內(nèi)多種生物學(xué)功能和細胞進程的調(diào)節(jié),同時也參與癌癥的形成和轉(zhuǎn)移[6]。研究表明miR-196a-5p在卵巢癌和結(jié)直腸癌中過度表達,且其高表達的水平與這些癌的進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7-8]。還有研究證實了miR-196b通過靶向抑制FOXP2來促進肝癌的進展,miR-196b高表達的肝癌患者5年生存率和無病生存率顯著降低[9]。本研究通過生物信息學(xué)分析miR-196在骨肉瘤中的差異性表達,實驗驗證miR-196在骨肉瘤中對CDK6的表達是否具有調(diào)控作用,從而明確miR-196對骨肉瘤細胞增殖的影響并初步研究其分子作用機制,為骨肉瘤的臨床診治和預(yù)后開辟新的領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞 人骨肉瘤MG63細胞與U2OS細胞購于中國科學(xué)院上海生物科學(xué)院細胞源中心。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司,miR-196 mimic、miR-196 inhibitor、miR-196 control、CDK6和內(nèi)參U6 PCR引物的設(shè)計及雙熒光載體的構(gòu)建均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司,Lipo-fectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑、PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司,四氮唑藍(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)購自美國 Sigma-Aldrich公司,CDK6抗體和GAPDH 抗體購自英國 Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1miR-196在骨肉瘤中的表達分析 通過沈陽陌信信息技術(shù)有限公司對miRNA在骨肉瘤組織中的表達進行差異性分析,使用miRDB(www.mirdb.org)數(shù)據(jù)庫尋找CDK6蛋白的mRNA序列,并尋找能夠調(diào)控CDK6蛋白的潛在miRNA序列及靶點,對其相關(guān)性進行分析。

1.2.2細胞培養(yǎng) 配制骨肉瘤MG63和U2OS細胞培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%FBS+1%青-鏈霉素雙抗混合液);當(dāng)細胞生長至融合度大約為80%以上時用胰酶消化傳代,置于37℃、5%CO2的孵箱中培育。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的骨肉瘤MG63和U2OS細胞取出,使用胰酶進行消化處理,均勻地接種于6孔板中,待細胞密度長至50%～70%時根據(jù)說明書分別將miR-196 mimic、miR-196 control和miR-196 inhibitor轉(zhuǎn)染于骨肉瘤MG-63細胞中。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA表達水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞,加入1 ml Trizol吹打裂解細胞后轉(zhuǎn)入EP管中室溫下靜置,再加入0.2 ml氯仿,于手中用力震蕩少許時間靜置2～3 min后以12 000 g(2～8℃)的條件離心15 min。取上層水相加入到另一EP管中并加入0.5 ml異丙醇,再次按上述步驟震蕩靜置離心。棄去上清,加入1 ml 75%乙醇洗滌后再螺旋混合,再次離心棄上清獲得細胞的總RNA,再通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR檢測方法使用SYBR Green法,PCR擴增條件如下:先于94℃環(huán)境中預(yù)變性3 min,而后94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min,一共進行35個循環(huán)。檢測引物如表1。

表1 RT-qPCR檢測引物序列

1.2.5MTT實驗測定細胞活性 于轉(zhuǎn)染6～8 h后使用胰酶消化細胞,以4×103個/孔的濃度接種于96孔板中,分別在培養(yǎng)至0 h、12 h、24 h、36 h、48 h進行MTT實驗,每孔加入10 μLMTT溶液(5 mg/mL)培養(yǎng)4 h,棄去上層清液后再于每孔中加入100 μL DMSO,室溫下低速震蕩混勻10 min后測定OD490 nm吸光度(A)值。

1.2.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiRNA與mRNA的調(diào)控關(guān)系 收集轉(zhuǎn)染48 h的MG-63與U2OS細胞,消化稀釋后以1×104個細胞/孔的濃度接種于24孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,當(dāng)細胞融合度達到80% ～90%左右時,按照1.2.3進行轉(zhuǎn)染,將構(gòu)建好的CDK6的野生型(WT-CDK6)和突變型(MUT-CDK6,突變了二者的結(jié)合位點)雙熒光素酶報告載體分別與miR-196 mimic和miR-196 control共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的MG-63細胞轉(zhuǎn)染48 h,收集細胞驗證轉(zhuǎn)染效果,將轉(zhuǎn)染的細胞使用裂解緩沖液于室溫下裂解20 min,離心收集上清,加入熒光素酶底物后立即使用發(fā)光儀對熒光素酶活性進行檢測。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參,計算螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.7Western blotting檢測蛋白表達 取出培養(yǎng)的細胞吸凈培養(yǎng)液后加入細胞裂解液,于冰盒上充分裂解后再吸出裂解液。提取各組總蛋白進行蛋白定量,120 V恒壓電泳60 min分離蛋白,電泳結(jié)束后切取條帶,加入轉(zhuǎn)膜緩沖液,恒定電流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。室溫下,將PVDF膜使用快速封閉液封閉1 h后將PVDF膜放入一抗中4℃水平搖床孵育過夜。吸去一抗后TBST洗膜3次,每次5～10 min。再加入按說明書比例稀釋好的標(biāo)記二抗室溫孵育1 h并洗膜后,系統(tǒng)發(fā)光成像,檢測目的蛋白的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

圖表中的數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,miR-196和CDK6的相關(guān)性通過spearman相關(guān)系數(shù)進行分析,采用單因素或多因素方差分析對各組數(shù)據(jù)之間差異是否顯著進行評估,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗數(shù)據(jù)均使用GraphPad 8.1進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析處理。

2 結(jié)果

2.1 miRDB數(shù)據(jù)庫及生物信息公司分析miR-196在骨肉瘤中的表達情況并篩選可能靶向CDK6的miRNA序列

通過信息技術(shù)公司分析miR-196在骨肉瘤中的表達,結(jié)果顯示miR-196在骨肉瘤中的表達顯著下調(diào)1.773 993倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。通過miRDB數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)miR-196前體序列與CDK6序列有結(jié)合位點,說明CDK6可能是miR-196的靶基因之一(圖1)。

圖1 miR-196與CDK6存在結(jié)合位點

表2 生信預(yù)測miR-196在骨肉瘤細胞中的表達情況

2.2 spearman相關(guān)系數(shù)分析骨肉瘤中miR-196和CDK6表達的相關(guān)性

對miR-196和CDK6在骨肉瘤組織中的表達量使用spearman相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析,統(tǒng)計分析結(jié)果指出miR-196與CDK6在骨肉瘤組織中的表達呈負相關(guān)(rs=-0.8055,P<0.05,圖2),說明miR-196的過表達能夠抑制CDK6在骨肉瘤中的表達。

圖2 miR-196和CDK6表達的相關(guān)性分析

2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-196與CDK6在骨肉瘤中的關(guān)系

通過miRDB生物數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CDK6與miR-196存在結(jié)合位點,由此猜測CDK6可能是miR-196的靶基因之一,因此采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灧謩e對骨肉瘤MG63細胞系和U2OS細胞系中miR-196與CDK6的靶向結(jié)合進行驗證,見于圖3A與圖3B。CDK6-WT+miR-196 control組的熒光活性低于CDK6-WT+miR-196 mimic組,兩者相比差異較為顯著(P<0.05)。CDK6-MUT+miR-196 control組和CDK6-MUT+miR-196 mimic組的熒光活性相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-196與CDK6的相互作用(*)*P<0.05)

2.4 RT-qPCR檢測骨肉瘤中miR-196對CDK6表達的調(diào)控

采用RT-qPCR分別驗證MG63與U2OS細胞系中miR-196對CDK6表達的調(diào)控作用,結(jié)果顯示,對比miR-196 control組,miR-196 mimic組中miR-196的表達顯著上調(diào),與此同時miR-196 mimic組中的CDK6表達量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4A與圖4C。對比miR-196 control組,miR-196 inhibitor組中miR-196的表達下調(diào),而miR-196 inhibitor組中CDK6的表達顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4B與圖4D。

圖4 RT-qPCR檢測miR-196和CDK6的表達水平(*)*P<0.05)

2.5 Western blotting檢測骨肉瘤中miR-196和CDK6表達的關(guān)系

采用western blotting分別檢測MG63細胞和U2OS細胞中miR-196 control組、miR-196 mimic組和miR-196 inhibitor組中CDK6蛋白的表達情況,以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示miR-196 mimic組中CDK6蛋白表達量減少,而miR-196 inhibitor組中CDK6蛋白表達量增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5A與圖5B。

圖5 western blotting檢測CDK6的表達

2.6 miR-196過表達或低表達對骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響

miR-196 mimic與miR-196 inhibitor轉(zhuǎn)染后采用MTT實驗檢測骨肉瘤MG63和U2OS細胞的增殖能力,結(jié)果如圖6所示。與轉(zhuǎn)染miR-196 control組相比,轉(zhuǎn)染miR-196 mimic組的增殖活性在12 h、24 h、36 h和48 h均顯著降低(P<0.05,圖6A與圖6C),而轉(zhuǎn)染miR-196 inhibitor組的增殖活性在12 h、24 h、36 h和48 h均有不同程度的升高(P<0.05,圖6B與圖6D)。實驗證明過表達miR-196能夠抑制骨肉瘤MG63和U2OS細胞的增殖活性,而當(dāng)miR-196呈低表達時能夠促進骨肉瘤MG63和U2OS細胞的增殖能力。

圖6 miR-196 mimic和miR-196 inhibitor對骨肉瘤細胞增殖的影響(*)*P<0.05)

3 討論

目前miRNA在骨肉瘤領(lǐng)域的研究取得了大量進展,為腫瘤的臨床診治、化療耐藥以及改善預(yù)后等提供了新的思路。HE等[10]發(fā)現(xiàn)miR-486可以靶向抑制PKC-δ信號通路而抑制骨肉瘤MG-63細胞的增殖和侵襲,可見miR-486是骨肉瘤潛在的治療靶點之一。另外一些miRNA的靶點與骨肉瘤的病理生理學(xué)有關(guān),SUN等[11]證明了FOS樣抗原2(FOSL2)是miR-143-3p的直接靶點,并檢測出miR-143-3p在預(yù)后不良的骨肉瘤患者中表達下調(diào),當(dāng)miR-143-3p過表達時能夠抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲,促進骨肉瘤細胞的凋亡。而FOSL2在骨肉瘤中的過量表達能夠逆轉(zhuǎn)miR-143-3p的作用,從而得出結(jié)論,miR-143-3p通過靶向FOSL2抑制骨肉瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。這些研究共同支持miRNAs在骨肉瘤方面可能具有診斷和治療價值的觀點。

近年來miR-196已被許多研究證實其參與腫瘤的發(fā)生和進展,ZHAO等[12]和KANNO等[14]發(fā)現(xiàn),miR-196b通過靶向抑制SOCS2的表達來促進喉鱗狀細胞癌的增殖和侵襲能力,并抑制其癌細胞的凋亡,從而可將miR-196b視為喉鱗狀細胞癌的一個預(yù)后因素。LI等[13]發(fā)現(xiàn)miR-196b在非小細胞肺癌中過表達,且與其靶基因GATA6的表達呈負相關(guān),并證明miR-196b的過表達通過靶向GATA6而促進非小細胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。同時,在胰腺癌中,KANNO等[14]發(fā)現(xiàn)miR-196b的高表達與胰腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān),miR-196b可以作為胰腺癌患者的生物標(biāo)志物來檢測和評估患者的預(yù)后情況。還有一項研究指出miR-196a-5p可能參與了小鼠破骨細胞中對線粒體代謝的抑制作用,從而證實了miR-196-5p能夠抑制小鼠體內(nèi)破骨細胞的形成[15]。

CDK在促進癌癥發(fā)生發(fā)展方面的關(guān)鍵性使其成為受到大量關(guān)注的潛在藥物靶點。CDK4/6抑制劑能夠使細胞周期中G1期到S期的進展出現(xiàn)阻滯進而抑制腫瘤細胞的增殖[16]。除了阻斷細胞周期外,CDK4/6抑制劑還能通過多種作用機制來抑制腫瘤細胞的生長,如增強信號通路抑制劑引起的細胞抑制、誘導(dǎo)衰老、調(diào)節(jié)細胞代謝,甚至促進抗腫瘤免疫反應(yīng)等[17]。ZHU等[18]發(fā)現(xiàn)miR-29b通過抑制CDK6蛋白的表達而起到了抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移的作用,揭示了靶向CDK6是miRNAs作用于骨肉瘤的一種新的調(diào)節(jié)途徑。TIAN等[19]也證實了miR-497通過靶向CDK6和plexinA4來抑制骨肉瘤的生長和遷移,首次闡明了miR-497和CDK6、plexinA4之間的關(guān)系及其在骨肉瘤中的作用。但目前關(guān)于miR-196能否通過靶向調(diào)控CDK6的表達來影響骨肉瘤細胞增殖的研究尚未見相關(guān)報道,本研究填補了這一空白。

本研究分析了骨肉瘤組織中miR-196的差異性表達情況,發(fā)現(xiàn)miR-196在骨肉瘤組織中的表達量顯著下調(diào),且通過MTT實驗證明過表達的miR-196可以抑制骨肉瘤MG63和U2OS細胞的增殖,證實了miR-196在能夠抑制骨肉瘤發(fā)生與進展的作用。此外,還通過生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDK6與miR-196的前體序列存在結(jié)合位點,猜測CDK6可能是miR-196的靶點并對其進行驗證。使用spearman相關(guān)系數(shù)對miR-196和CDK6在骨肉瘤組織中的表達量進行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示二者呈負相關(guān)(rs=-0.805 5,P<0.05)。通過螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C明miR-196在骨肉瘤組織中能夠顯著抑制CDK6的活性,又采用RT-qPCR檢測miR-196和CDK6在mRNA水平表達的調(diào)控關(guān)系,western blotting檢測在miR-196調(diào)控下骨肉瘤MG63和U2OS細胞中CDK6蛋白的表達情況。結(jié)果顯示過表達miR-196能夠顯著地抑制CDK6的表達,而miR-196的低表達則能夠促進骨肉瘤中CDK6的表達。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)miR-196在骨肉瘤中的表達顯著下調(diào),當(dāng)miR-196過表達時,可以對骨肉瘤細胞的增殖起到抑制作用,并且能抑制CDK6的表達,由此推斷得出miR-196通過靶向調(diào)控CDK6的表達而起到抑制骨肉瘤細胞增殖的作用。miR-196和CDK6有望成為新的骨肉瘤早期診斷和治療的分子靶點,構(gòu)建miRNA相關(guān)生物制劑可能從基因?qū)用娉霭l(fā)改變腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄翻譯等過程,進而影響骨肉瘤的發(fā)生與進展,對骨肉瘤未來的臨床護理和診治情況做出改善。