盧倩倩,張澤兵,王景云

(吉林大學(xué)白求恩口腔醫(yī)學(xué)院,吉林 長春130021)

骨質(zhì)疏松癥、外傷和發(fā)育異常等常導(dǎo)致頜面部牙槽骨缺損和骨量不足[1]。一方面,限制了口腔修復(fù)方案的選擇,臨床上多數(shù)情況只能選擇活動(dòng)義齒來恢復(fù)缺失的牙槽骨,大大降低了咀嚼效率和固位力。另一方面,降低了口腔種植手術(shù)的成功率,通過植骨手術(shù)來增加骨量,給患者帶來了更多的創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-4]。因此亟需尋求更加高效增加骨量的方法。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)大量存在于頜骨骨髓腔中,能夠成骨、成軟骨向分化,其分化過程受很多分子調(diào)控[5-7]。

多種RNA分子調(diào)控著人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化以維持骨穩(wěn)態(tài)[8-10]。研究表明其中一些長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA) 通過與miRNA分子相互作用調(diào)控hBMSCs基因表達(dá)的信號(hào)通路,干預(yù)其成骨分化方向[11-13]。UCA1(urothelial cancer associated 1,UCA1)是一種高度特異化的lncRNA。作為一種大于200個(gè)核苷酸的非編碼基因[14],UCA1幾乎不編碼蛋白質(zhì)。基因芯片分析結(jié)果表明lncRNA UCA1在骨質(zhì)疏松癥患者的血漿中,和健康人相比明顯升高[15],提示UCA1很可能在調(diào)控骨代謝平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其有一短一長兩種主要形式,在本研究中分別記為UCA1a和UCA1b[16]。UCA1是否參與hBMSCs的成骨分化而影響骨代謝仍然未知。

本研究通過構(gòu)建過表達(dá)lncRNA UCA1的慢病毒載體UCA1a和UCA1b及空載體感染hBMSCs,探究體外兩種不同結(jié)構(gòu)的UCA1是否調(diào)控hBMSCs的成骨分化,對利用分子干預(yù)干細(xì)胞的基因表達(dá)從而促進(jìn)骨形成修復(fù)頜面部骨缺損具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)采用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天換液1次,細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)用Accutase細(xì)胞消化液以1∶2的比例傳代。每次傳代前凍存一定比例的傳代細(xì)胞。后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用第3至6代細(xì)胞。

1.2 感染和實(shí)驗(yàn)分組

UCA1的兩種變體(UCA1a和UCA1b)的cDNA分別被亞克隆到慢病毒載體質(zhì)粒CSII-CMV-MCS位于Nhe I和Xho I之間獨(dú)特的限制酶酶切位點(diǎn),并設(shè)立空載體慢病毒顆粒為對照組。實(shí)驗(yàn)分為4組:對照組1組為干細(xì)胞對照組;對照組2組為空載體對照組;UCA1a組為高表達(dá)UCA1a的實(shí)驗(yàn)組;UCA1b組為高表達(dá)UCA1b的實(shí)驗(yàn)組。感染HEK293T細(xì)胞72 h時(shí)采用Real-Time RT-PCR檢測各組UCA1的表達(dá)水平。成功高表達(dá)UCA1后,依次感染各組hBMSCs。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Real-Time RT-PCR

感染72 h的細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d、14 d和21 d的細(xì)胞,采用PureLink RNA Mini kit提取和純化總RNA。Nanodrop2000測量所提取的RNA的濃度,使用iScript cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄得到第1鏈cDNA,第1鏈cDNA與特異引物當(dāng)成模板完成Real-Time RT-PCR。擴(kuò)增程序:95℃變性 30 s,39 個(gè)擴(kuò)增循環(huán),反應(yīng)溫度為 95℃ 3 s、60℃ 30 s。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因S29的表達(dá)量,所用引物序列如表1。

表1 PCR所用引物的核苷酸序列

1.4 茜素紅染色

UCA1成功高表達(dá)后,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每3 d半量換液1次,共誘導(dǎo)21 d。成骨誘導(dǎo)7 d、14 d和21 d時(shí),完成茜素紅染色。室溫下,首先用100 ml蒸餾水溶解1 g茜素紅,并用稀釋氨水將pH值調(diào)至6.4,配制好茜素紅染液。室溫下每孔用4%PFA 1 ml固定10 min后,蒸餾水洗滌,加入1 ml剛配制的染液染色20 min,最后蒸餾水洗滌、放置干燥。

1.5 Real-Time RT-PCR測定成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)

按照上述方法測定成骨特異性基質(zhì)蛋白堿性磷酸酶ALP、骨橋蛋白OPN、I型膠原COL1和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SP7和成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ及脂類合成酶的關(guān)鍵基因LPL的mRNA表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組3個(gè)樣本量,操作驗(yàn)證3次。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 26處理分析,組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,Tukey多重檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建UCA1穩(wěn)定過表達(dá)的hBMSCs細(xì)胞系

UCA1a組和UCA1b組在21 d內(nèi)相比于對照組維持穩(wěn)定顯著高表達(dá)UCA1,兩對照組間無顯著差異,模型構(gòu)建成功(P<0.01),見圖1。

圖1 lncRNA UCA1基因高表達(dá)的檢測

2.2 茜素紅染色結(jié)果及分析

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后7 d、14 d和21 d,分別進(jìn)行油紅O染色。成骨誘導(dǎo)7 d后各組無陽性結(jié)果。14 d和21 d后,染色面積加大,21 d相較于14 d各組人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞染色顏色加深加厚,表明礦化結(jié)節(jié)增多,鈣鹽沉積量增多,見圖2。

圖2 成骨誘導(dǎo)14 d、21 d時(shí)茜素紅染色結(jié)果

2.3 成骨關(guān)鍵基因的Real-Time RT-PCR結(jié)果及分析

COL1I型膠原,作為成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志,兩組實(shí)驗(yàn)組7 d和14 d時(shí)相對于對照組表達(dá)水平均明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在21 d時(shí),Col1在4組中的表達(dá)量相較于7 d和14 d時(shí)均減低。ALP作為成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志,mRNA的表達(dá)水平在兩組實(shí)驗(yàn)組UCA1a組和UCA1b組中14 d和21 d時(shí),相對于兩組對照組均明顯上調(diào),且相較于7 d時(shí)明顯增加見圖3。另外,14 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組OPN和SP7的表達(dá)均高于對照組,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上結(jié)果表明UCA1高表達(dá)組細(xì)胞成骨分化能力明顯增強(qiáng),骨形成增強(qiáng)。

3 討論

UCA1作為成骨分化的正調(diào)控分子,在骨代謝中扮演重要角色。LI等[16]發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥患者血漿UCA1表達(dá)明顯升高。SHU等[17]的研究表明,UCA1通過miRNA-145-5p/SMAD5和miRNA-124-3p/SMAD4軸促進(jìn)BMSCs向軟骨分化。ISHIKAWA等[18]發(fā)現(xiàn)UCA1在成軟骨分化過程中呈明顯高表達(dá)趨勢。然而,UCA1是否通過參與BMSCs 的成脂分化和成骨分化平衡而影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展仍然未知[19-20]。本研究探討了UCA1對hBMSCs成骨分化的影響,結(jié)果表明隨著兩種結(jié)構(gòu)的UCA1持續(xù)高表達(dá),細(xì)胞在14 d時(shí)成骨分化能力均明顯增強(qiáng),骨形成增強(qiáng),但在21 d時(shí),成骨關(guān)鍵基因的mRNA水平相比于14 d均顯著減低。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和前人的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),UCA1在成骨功能減弱的骨質(zhì)疏松癥患者血漿中上調(diào),卻在體外實(shí)驗(yàn)中有一定促進(jìn)骨形成的功能。骨質(zhì)疏松癥患者還有脂肪大量堆積對成骨功能的影響[21-22],有可能是患者體內(nèi)成脂相關(guān)分子競爭抑制UCA1相關(guān)靶點(diǎn)的成骨信號(hào)通路,加強(qiáng)脂肪堆積。有研究表明未來有望在種植體周圍釋放適量的某種藥物通過上下游干預(yù)UCA1的基因表達(dá),進(jìn)而調(diào)控hBMSCs的分化,從而增強(qiáng)促骨形成功能。

值得注意的是,縱向觀察實(shí)驗(yàn)7 d、14 d和21 d的成骨基因表達(dá)水平變化,發(fā)現(xiàn)在21 d時(shí)兩種過表達(dá)UCA1的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA水平相對于14 d時(shí)均減低。有可能是因?yàn)樵?1 d時(shí)UCA1的表達(dá)量過高,通過某種機(jī)制對相關(guān)基因的調(diào)控產(chǎn)生了不同作用。也有可能是UCA1對hBMSCs相關(guān)分化的不同階段作用方式和強(qiáng)度不同,具體機(jī)制仍需深入研究。另一方面,關(guān)于UCA1促成骨方面的作用,采用不同的研究模型得出的結(jié)果并不一致。ISHIKAWA等[18]通過構(gòu)建穩(wěn)定敲除UCA1的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-e1細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)沉默UCA1能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-e1的增殖和分化。最后Western blotting分析骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)/(SMAD5/8)信號(hào)通路的表達(dá),顯示UCA1的作用可能是通過成骨細(xì)胞BMP-2/(SMAD5/8)信號(hào)通路介導(dǎo)。下調(diào)UCA1可通過激活成骨細(xì)胞BMP-2/(SMAD5/8)信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 UCA1過表達(dá)在hBMSCs成骨誘導(dǎo)14 d時(shí)成骨關(guān)鍵基因ALP、Col1、OPN及SP7的表達(dá)均增強(qiáng),且形態(tài)學(xué)染色觀察到相同結(jié)果,但其體內(nèi)實(shí)驗(yàn)作用結(jié)果尚不可知。

近期熱點(diǎn)分子lncRNA調(diào)控hBMSCs 分化的研究大量涌現(xiàn)[23],但是大部分 lncRNA 僅被確定為 BMSCs 成骨分化的促進(jìn)或抑制因子。本研究的結(jié)果表明UCA1過表達(dá)在體外細(xì)胞水平能夠促進(jìn)hBMSCs的成骨分化,可為后續(xù)深入研究修復(fù)骨缺損疾病的分子治療提供一定的參考價(jià)值。