張士芳，魏 丹，郭 媛，劉應(yīng)竹，路 平，劉鳳春，朱世兵

（1.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱，150040；2.黑龍江雙河國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，塔河，165204）

線粒體基因組是線粒體中的遺傳物質(zhì)，參與蛋白質(zhì)合成，能自主轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和翻譯成蛋白質(zhì)，具有進(jìn)化速率快、分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡單和母系遺傳等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在物種的起源、進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育研究中［1-2］，對研究物種系統(tǒng)進(jìn)化和分類地位、物種遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)等也都具有十分重要的意義。

貂熊（Gulo gulo）是食肉目（Carnivora）鼬科（Mustelidae）貂熊屬（Gulo）下的唯一物種，列入國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動物名錄。貂熊是環(huán)北極型動物，分布同寒溫帶針葉林分布一致，廣泛分布在北美和歐亞大陸北部［3］。貂熊僅在中國東北大興安嶺部分區(qū)域和新疆北部阿勒泰地區(qū)有分布，種群數(shù)量估計為300 只左右［4］。由于貂熊在國內(nèi)分布面積和數(shù)量均較少，屬于研究較少的物種，目前只在貂熊的種群［5-6］、生境［7-8］、食性［8］和線粒體［9-10］等方面有研究。而在歐洲和北美，對貂熊的全面研究工作都較為重視，在分布區(qū)擁有完善的保護(hù)和管理措施。貂熊與其他鼬科動物無論是形態(tài)還是習(xí)性差異都較大，分類地位也一直存在爭議。貂熊和貂屬動物雖同屬于鼬科，但由于生態(tài)和形態(tài)差異，長期以來被認(rèn)為是遠(yuǎn)親，分屬于不同的亞科［11］，而部分形態(tài)學(xué)和行為學(xué)觀察［12］及分子研究［13-14］則認(rèn)為貂熊和貂屬（Martes）動物親緣關(guān)系更為密切。本研究對中國的貂熊進(jìn)行線粒體基因組全序列測定和生物信息學(xué)分析，并結(jié)合GenBank 中其他21 種鼬科動物線粒體基因組數(shù)據(jù)，對鼬科部分物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行研究，以期為貂熊的分類、進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育提供基因依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貂熊DNA 提取于貂熊血液，樣品來自救助于大興安嶺地區(qū)飼養(yǎng)在齊齊哈爾龍沙動植物園的1 只雌性個體。采后肢靜脈血液5 mL 放置于含抗凝劑的采血管內(nèi)，冰箱內(nèi)4 ℃保存?；蚪MDNA 的提取參考從哺乳動物血液中提取DNA 的方法［15］，使用酚-氯仿法提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取GenBank 已公布的日本貂（Martes melampus）（登錄號：AB291076）和分布于瑞典的貂熊（登錄號：AM711901）線粒體基因組全序列，設(shè)計可覆蓋貂熊線粒體基因組全序列引物。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳回收，純化后利用ABI 3730xl 測序儀測序。

1.2 序列分析

測序得到的序列通過Chromas 和DNAman（LynnonBiosoft，Canada）分析，人工校正后拼接，最后得到貂熊線粒體基因組全序列，通過與近緣物種線粒體基因組比較及通過ClustalX 和DNAman 軟件分析定位蛋白編碼基因、tRNA 基因、rRNA 基因和非編碼控制區(qū)。DNAstar統(tǒng)計序列全長、堿基含量等信息。利用在線軟件OGDRAW（http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/index.shtml）繪制貂熊線粒體基因結(jié)構(gòu)圖。使用RNAfold 在線預(yù)測網(wǎng)站RNAfold web server（http：//rna.tbi.univie.ac.at）對rRNA 二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫，通過BLAST相互比對，下載21種相關(guān)鼬科動物線粒體基因全序列，結(jié)合本研究測定的貂熊線粒體基因全序列，組成22種鼬科動物序列庫，以棕熊（Ursus arctos）為外群，序列信息見表1。通過MEGA11采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中NJ 法經(jīng)Bootstrap 法檢驗，共1 000 次循環(huán)，根據(jù)置信度選擇模型maximum composite likelihood。ML 進(jìn)化樹經(jīng)Bootstrap 法檢驗，共1 000 次循環(huán)，比對后最優(yōu)模型為GTR+G+I，進(jìn)化樹模型選擇general time reversible model，點(diǎn)位進(jìn)化率（rates among sites）選擇G+I，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)。

表1 進(jìn)化分析物種的線粒體全基因組序列信息Tab.1 Information on samples for phylogenetic analysis

2 結(jié)果

2.1 基因組組成與基因排列

獲得的貂熊線粒體基因組全序列全長為16 575 bp，序列提交NCBI 基因數(shù)據(jù)庫，GenBank 登錄號為KR611313。與大多數(shù)哺乳動物相似，貂熊的線粒體基因組成包括13種蛋白質(zhì)編碼基因、22種轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、2 種核糖體RNA（rRNA）和1 個非編碼控制區(qū)（D-loop）。在整個基因組中只有ND61個蛋白質(zhì)編碼基因和tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Glu和tRNA-Pro8 個tRNA基因位于L鏈，其余基因均位于H鏈（圖1）。

圖1 貂熊線粒體結(jié)構(gòu)Fig.1 Mitochondria structure of wolverine

整個貂熊線粒體基因排列十分緊密，在編碼區(qū)37 個基因之間共有11 個間隔，間隔總長度為33 bp，占DNA 總長的0.20%。7 個重疊區(qū)（75 bp）占DNA總長的0.45%，在tRNA-Ile與tRNA-Gln，COX1與tRNA-Ser，ATP8與ATP6，ATP6與COX3，ND4L與ND4，ND5與ND6，以及tRNA-Thr與tRNA-Pro之間，最大重疊為43 bp，位于ATP8與ATP6之間（表2）。在tRNA-Asn與tRNA-Cys之間有1 個長度為33 bp 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)保守序列Rep Origin，其二級結(jié)構(gòu)如圖2 所示，柄部有3個核苷酸，莖部由8對互補(bǔ)的堿基組成，環(huán)結(jié)構(gòu)由14個核苷酸組成。

圖2 貂熊Rep Origin的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 The Rep Origin secondary structure of wolverine

表2 貂熊線粒體基因組組成Tab.2 Gene contents of wolverine mitochondrial genome

2.2 核苷酸組成

由表3 可知，貂熊mtDNA 4 種堿基含量分別為：A=32.18%、G=14.26%、T=26.75%和C=26.81%；AT含量（58.93%）＞CG 含量（41.07%），存在顯著的AT富集。蛋白質(zhì)編碼基因包括3 782 個密碼子，其AT含量為58.58%，與全基因組相似，密碼子的堿基組成是第3位點(diǎn)密碼子AT含量最高（60.80%），且明顯高于D-loop 區(qū)AT 含量（55.62%），而密碼子第1位點(diǎn)和第2位點(diǎn)的AT含量均低于全序列。

表3 貂熊線粒體基因組核苷酸組成Tab.3 Nucleotide composition of wolverine mitochondrial genome

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因

貂熊線粒體基因組同其他脊椎動物相同，有13 個蛋白質(zhì)編碼基因，包括1 個細(xì)胞色素b基因（Cyt b），2個ATP酶亞基基因ATP8和ATP6，3個細(xì)胞色素氧化酶亞基基因，即COX1、COX2和COX3，以及7 個NADH 脫氫酶亞基基因ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6。貂熊蛋白質(zhì)編碼基因總長度為11 346 bp，編碼3 739 個氨基酸，堿基組成A=31.01%、G=13.16%、T=27.57% 和C=28.27% ；AT 含量（58.58%）＞CG 含量（41.42%），與全序列堿基組成相似。在貂熊蛋白質(zhì)編碼基因中，H鏈上有5個閱讀框重疊，COX1和tRNA-Ser有3個重疊，ATP8和ATP6有43 個重疊，ATP6和COX3有1 個重疊，ND4L和ND4有7 個重疊，ND5和ND6有17 個重疊，與紫貂（Martes zibellina）線粒體基因組非常相似［16］，僅COX1和tRNA-Ser間的重疊數(shù)不同。

在貂熊的13 種蛋白編碼基因中，共有4 種起始密碼子，ND6以TTA為起始密碼子，ND3以ATA為起始密碼子，ND2和ND5兩個蛋白質(zhì)基因均是以ATT為起始密碼子，其余9 個蛋白質(zhì)編碼基因COX1、COX2、COX3、ATP6、ATP8、ND1、ND4、ND4L和Cyt b均以ATG 為起始密碼子，具有明顯的多樣性。終止密碼子方面，貂熊的13個蛋白質(zhì)編碼基因中，6個蛋白質(zhì)編碼基因COX1，COX2、ATP8、ATP6、ND4L和ND5以TAA 為終止密碼子，Cyt b以TGA 為終止密碼子，這7 種蛋白質(zhì)編碼基因具有完全終止密碼子，其余6 個蛋白質(zhì)編碼基因ND1、ND2、COX3、ND3、ND4和ND6均以不完全終止密碼子T 為終止密碼子（表2）。不完全終止密碼子T 的使用頻率也比較高。在已知的鼬科動物中，日本貂出現(xiàn)不完全終止密碼子4 次，紫貂有7 次，而貂熊有 6 次，使用較頻繁。在其他貂屬動物線粒體DNA中，使用T或TA的不完全終止密碼子的現(xiàn)象也十分常見［17］，其3'端通常與tRNA緊密相連，甚至發(fā)生重疊，通過在3'端添加Poly A 來完成轉(zhuǎn)錄過程。

2.4 tRNA

tRNA 即轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA），貂熊線粒體基因組包括22 個tRNA 基因（表2），長度為61～75 bp，排列順序與其他鼬科動物相同，其中tRNAGln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNASer、tRNA-Glu和tRNA-Pro由L 鏈編碼，其余14 種tRNA均由H鏈編碼。

對貂熊22 個tRNA 基因的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示除了tRNA-Lys二氫尿嘧啶環(huán)缺失外，其余21 個tRNA 基因均為標(biāo)準(zhǔn)的三葉草二級結(jié)構(gòu)。部分tRNA 基因的二級結(jié)構(gòu)見圖3。在22 個tRNA 基因二級結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了35 處堿基錯配的情況，其中U—G錯配最多，有25 處，U—U 錯配5 處，A—A 錯配3 處，以及A—C 錯配2 處。通常認(rèn)為這些錯配符合擺動配對原則，有利于維持tRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［18］。

圖3 貂熊部分tRNA二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of some tRNA of wolverine

2.5 rRNA

貂熊核糖體RNA 基因即rRNA 基因（12S rRNA和16S rRNA）長度分別為961、1 569 bp，分別位于tRNA-Phe和tRNA-Val之間，tRNA-Val與tRNA-Leu之間，2 個rRNA 基因間由tRNA-Val相隔。2個rRNA 的AT 含量分別為59.00%和59.85%，均略高于全序列含量。利用RNAfold 軟件預(yù)測12S rRNA 和16S rRNA 基因二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，rRNA 的二級結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，形成多個復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖4 貂熊rRNA二級結(jié)構(gòu)Fig.4 rRNA secondary structure of wolverine

2.6 D-loop控制區(qū)

D-loop 區(qū)是線粒體DNA 上的主要非編碼區(qū)，受到的進(jìn)化壓力較小，有較高的變異性，在整個線粒體基因組中屬于進(jìn)化速度較快的區(qū)域［19-20］。貂熊的控制區(qū)序列長1 129 bp，位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之間。堿基組成A=30.12%、G=14.35%、T=25.51%、C=30.03%；AT含量（55.62%）＞CG含量（44.38%）。

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化

在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST比對，下載21種相關(guān)鼬科動物線粒體基因全序列組成基因組全序列數(shù)據(jù)，以棕熊為外群物種，分別采用鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）構(gòu)建鼬科22種動物的進(jìn)化樹（圖5，圖6）。結(jié)果顯示，2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相似，且各個節(jié)點(diǎn)都具有較高支持率。外群棕熊單獨(dú)一支，位于最底部，22種鼬科動物分為5個大支，鼬屬（Mustela）的黑足鼬（M.nigripes）、林鼬（M.putorius）、黃鼬（M.sibirica）、香鼬（M.altaica）、伶鼬（M.nivalis）、白鼬（M.erminea）和黃腹鼬（M.kathiah）聚為一支；鼬屬的長尾鼬（M.frenata）同美洲水鼬屬（Neovison）的美洲水鼬（N.vison）聚為一支；水獺亞科（Lutrinae）的水獺（Lutra lutra）和海獺（Enhydra lutris）則構(gòu)成另一分支；狗獾屬（Meles）的狗獾（M.meles）和豬獾屬（Arctonyx）的豬獾（A.collaris）聚為一支；紫貂和松貂（Martes martes）先聚為一支，后依次與日本貂、美洲貂（M.americana）、石貂（M.foina）、黃喉貂（M.flavignla）、貂熊和漁貂（M.pennanti）聚合形成一個大的分支。2種方法測得的結(jié)果均顯示，貂熊同漁貂和黃喉貂的關(guān)系較近。這同Marmi等［21］基于線粒體Cyt b基因數(shù)據(jù)對貂類系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究時所獲結(jié)果相似。張洪海等［22］通過對線粒體DNA控制區(qū)全序列數(shù)據(jù)的分析也確定了鼬亞科（Mustelinae）和貂熊屬的分類地位；此外，徐純柱等［16］基于部分線粒體控制區(qū)基因序列構(gòu)建的貂類進(jìn)化樹，顯示貂熊同漁貂和黃喉貂親緣關(guān)系最近。

圖5 22種鼬科動物NJ進(jìn)化樹Fig.5 NJ evolution tree of 22 species of Mustelidae

圖6 22種鼬科動物ML進(jìn)化樹Fig.6 ML evolution tree of 22 species of Mustelidae

3 討論

鼬科是食肉目中一個多樣性較高的科，各成員之間無論是形態(tài)，還是生活習(xí)性都有很大差異，多數(shù)鼬科動物是動作敏捷的小型食肉動物，也有體型略大的，如貂熊和海獺等，既有陸棲動物，也有水棲或半水棲動物。而貂熊是體型最大的鼬科動物，并且是貂熊屬下唯一種，是一種特化的物種，能夠捕食大中型動物且有腐食性。貂熊分類地位和親緣關(guān)系的研究具有重要意義，研究人員已從不同方向?qū)ζ溥M(jìn)行了研究。依據(jù)形態(tài)學(xué)研究，Miller［23］認(rèn)為，雖然貂熊齒形與鼬亞科其他屬動物相似，但是它的牙齒十分粗鈍，上裂齒特別強(qiáng)大，而小前臼齒在上下頜緊閉時不能接觸，加上半蹠行性的足等特點(diǎn)，這些差異足以構(gòu)成亞科特征。而Ellerman 等［24］認(rèn)為，貂熊齒形和頭骨結(jié)構(gòu)等主要特征與鼬科各屬動物相近，認(rèn)為應(yīng)該將其歸并在鼬科內(nèi)。目前，后一種觀點(diǎn)得到了較多支持。

隨著測序技術(shù)越來越先進(jìn)，研究人員可以通過GenBank 簡便快速獲取大量的分子數(shù)據(jù)，這對系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究非常有利，因為更多的分類單元采樣可以提高系統(tǒng)發(fā)育的準(zhǔn)確性［25］。本研究基于mtDNA全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹支持貂熊歸為鼬科動物的觀點(diǎn)。采用NJ 和ML 法構(gòu)建的鼬科22 種動物的進(jìn)化樹基本一致，表明結(jié)果可靠。進(jìn)化樹顯示貂熊先同鼬科貂屬的7 種動物聚成一支，再與鼬屬動物和豬獾、狗獾聚合，說明貂熊同貂屬動物進(jìn)化關(guān)系較近。2 種進(jìn)化樹均顯示貂熊系統(tǒng)分化節(jié)點(diǎn)位于黃喉貂和漁貂之間。這也同近年來分子系統(tǒng)學(xué)研究認(rèn)為貂熊同貂屬的關(guān)系更近，應(yīng)該歸為貂亞科（Martinae）［26］或者貂熊亞科（Guloninae）［27-30］的結(jié)論一致。貂屬動物的進(jìn)化樹中，紫貂和松貂先聚為一支，再與日本貂聚合，然后與美洲貂聚合，再同石貂聚合這一拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，也同形態(tài)學(xué)研究認(rèn)為的松貂、紫貂、日本貂和美洲貂的親緣關(guān)系較近，而與石貂的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)［31］相一致。

本研究通過貂熊線粒體基因組全序列對貂熊與鼬科動物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了探索，但為了更準(zhǔn)確地反映其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，后續(xù)還需結(jié)合動物地理學(xué)、形態(tài)學(xué)及古生物學(xué)等方法進(jìn)行綜合分析。