孫 悅，李劍峰，張明海

（1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，貴陽，550018；2.貴州省高等學(xué)校林火生態(tài)與管理重點實驗室，貴陽，550018；3.貴州省高等學(xué)校生物資源開發(fā)利用重點實驗室，貴陽，550018；4.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護地學(xué)院，哈爾濱，150040）

腎上腺皮質(zhì)分泌的糖皮質(zhì)激素對動物的應(yīng)激性具有指示作用，其含量常用于動物應(yīng)激反應(yīng)的監(jiān)測［1］。多數(shù)哺乳動物糖皮質(zhì)激素的主要生理活性成分是皮質(zhì)醇，它能調(diào)節(jié)機體多項生理功能及影響野生動物行為的表達，因此也經(jīng)常被作為判斷機體對于刺激因素，即應(yīng)激源的應(yīng)激反應(yīng)程度的重要因子［2］。血液激素的測定一直被認(rèn)為是測定動物生殖激素最直接有效的方法，然而對于野生動物而言，血液樣品往往較難獲得，因此，基于尿樣或糞樣監(jiān)測動物的內(nèi)分泌指標(biāo)，在不觸及動物的前提下測定個體生理狀態(tài)，越來越成為準(zhǔn)確、實用的新方法［3］。

環(huán)境壓力是指影響生物體行為和健康的一種狀態(tài)［4］，其影響可能發(fā)生在從分子水平（如糖皮質(zhì)激素生產(chǎn)）到種群水平（如豐度、年齡結(jié)構(gòu)的變化）等一系列范圍內(nèi)［5］。環(huán)境壓力主要有3 種類型：第1 種是非生物壓力，它來自環(huán)境的非生物方面，如溫度、降水、海拔和坡度等；第2 種是生物壓力，是物種內(nèi)部或物種之間的相互作用的壓力［5］；第3 種，棲息地喪失、狩獵和氣候變化等人為干擾壓力［5］。面對環(huán)境的不確定性，應(yīng)激反應(yīng)在使動物應(yīng)對棲息生境變化和挑戰(zhàn)方面起著關(guān)鍵作用［6］。目前一些研究集中在棲息地破碎化和棲息地質(zhì)量對糖皮質(zhì)激素的影響上［7］。研究表明［8-9］，人為干擾與糖皮質(zhì)激素之間存在正相關(guān)關(guān)系，生活在受干擾棲息地的動物比生活在未受干擾地區(qū)的動物具有更高的糖皮質(zhì)激素水平。為了盡量減少暴露在人為壓力源中，野生動物也傾向于將它們的活動模式轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟囊归g活動［10］。量化個體健康或生理狀態(tài)（如糖皮質(zhì)激素）的指標(biāo)可為了解人為活動和生境特征如何影響種群動態(tài)提供一種主動機制。目前，對于人類活動和棲息地環(huán)境因子如何影響馬鹿（Cervus elaphus）的糞便皮質(zhì)醇激素水平知之甚少。

馬鹿隸屬于哺乳綱（Mammalia）偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）鹿屬（Cervus），國家二級重點保護野生動物，是棲息在中國東北森林中的典型哺乳動物，在森林生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)地位［11］。本研究基于內(nèi)蒙古高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)內(nèi)不同東北馬鹿（C.e.xanthopygus，以下簡稱“馬鹿”）個體糞便中皮質(zhì)醇水平及棲息地環(huán)境因子，分析不同馬鹿個體糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物（faecal cortisol metabolites，F(xiàn)CM）水平，利用多元線性回歸模型闡明人為干擾及棲息地環(huán)境因子與野生馬鹿糞便皮質(zhì)醇濃度水平之間的關(guān)系，探討棲息地環(huán)境因子如何影響馬鹿個體糞便皮質(zhì)醇，以期為保護區(qū)野生馬鹿的管理政策和保護策略的制定提供理論基礎(chǔ)。

1 研究區(qū)概況

內(nèi)蒙古赤峰市高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)（44°41'3″—45°8'44″ N，119°3'30″—119°39'8″ E）地處中緯度溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫3.8 ℃［11］，總面積1 062.84 km2（圖1），屬于大興安嶺典型的過渡帶森林—草原生態(tài)系統(tǒng)，包括森林、灌木、草地和濕地等。

圖1 赤峰地區(qū)高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)馬鹿研究區(qū)Fig.1 The geographic extent of the study area of the red deer in the Gaogesitai Hanwula National Nature Reserve in Chifeng

2 研究方法

2.1 野外數(shù)據(jù)收集

2019 年12 月—2020 年3 月，根據(jù)內(nèi)蒙古赤峰市高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)馬鹿分布情況，在馬鹿分布區(qū)域追蹤48 h 內(nèi)的新鮮雪地足跡鏈，每條足跡鏈長為2～5 km，發(fā)現(xiàn)新鮮的馬鹿糞便樣本后，記錄GPS 點，并用一次性手套收集，每堆新鮮糞便取30 粒樣本裝在封口袋內(nèi)，-20 ℃下保存。采用分子生物學(xué)方法對收集的82 份新鮮馬鹿糞便進行個體識別，確定82 份樣品均為馬鹿糞便，且均來自不同的個體。

2.2 GIS數(shù)據(jù)及環(huán)境變量

采用對馬鹿生境選擇有主要影響的環(huán)境變量：海拔、坡度、坡向、距森林邊緣距離、距道路距離、距村莊距離和歸一化植被指數(shù)（normalized difference vegetation index，NDVI）。

（1）植被類型：用研究地區(qū)1∶50 000林相圖進行掃描和矢量化處理，并將研究地區(qū)植被景觀類型劃分為森林、農(nóng)田、草地和灌叢4種類型。

（2）NDVI：通過地理空間數(shù)據(jù)云下載。

（3）地形因子：海拔、坡度和坡向以30 m 間隔的等高線為基礎(chǔ)，利用ArcGIS 10.2 空間分析功能提取。

（4）道路、河流和村莊根據(jù)林相地形圖矢量化獲得：馬鹿活動點到各變量（植被類型、道路和村莊等）的距離由ArcGIS 10.2 中的近鄰分析工具計算獲得。

2.3 馬鹿個體識別

使用QIAamp DNA 糞便試劑盒（QIAGEN，Hilden，Germany）提取馬鹿糞便樣本中DNA。采用微衛(wèi)星PCR 技術(shù)選取多態(tài)性良好的9 對微衛(wèi)星引物（BM848、BMC1009、BM1225、T123、T501、T530、DM45、BMS1248和ILSTS06）［12］。PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，51～60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 min，40個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存。擴增得到的PCR 產(chǎn)物與loading buffer 混合，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V 電壓下電泳約20 min，在凝膠成像系統(tǒng)中初步檢測結(jié)果［12］。使用Cervus 3.0 對微衛(wèi)星數(shù)據(jù)進行分析，完成基因分型。進行基因型比較來確定樣品是否來自同一個體。判斷同一個體不同樣本的原則是：（1）所有位點的基因型相同；（2）在一個位點上只有一個等位基因存在差異［12］。

2.4 激素分析

將糞便樣品解凍后，取180～200 g 放入10 mL 離心管中，加入體積為5 mL 的80%甲醇，在60 ℃恒溫水浴中渦旋1 min，孵育20 min。上清液以2 500g離心15 min，-20 ℃保存，提取皮質(zhì)醇。用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法評估糞便樣本中的皮質(zhì)醇濃度，使用含有該激素抗體的非特異性商業(yè)試劑盒（CORELISA 試劑盒；上海遠(yuǎn)屏生物科技有限公司），按說明書操作，皮質(zhì)醇提取物上清液用稀釋液按1∶20 釋液，50 μL 稀釋提取物用于激素定量。將樣品的光密度（OD）與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，并在室溫下，450 nm處測量樣品的OD值。

2.5 統(tǒng)計分析

多元線性回歸的基本原理是用最小二乘法對多個自變量之間的關(guān)系進行建模?；貧w模型的多重線性回歸模型

式中：Y表示被解釋變量；k表示變量個數(shù)；β0為回歸常數(shù)；βi為回歸系數(shù)（i=1，2，3，…，k）；ε為隨機誤差項。

使用Minitab 20 數(shù)據(jù)分析軟件（Minitab，LLC，State College，PA，USA），首先對因變量（糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物濃度）和自變量（距道路距離、距村莊距離、距森林邊緣距離、NDVI、坡度、坡向和海拔）通過減去均值再除以標(biāo)準(zhǔn)差的計算方法進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理；采用逆向消元法（刪除α=0.05）篩選進入構(gòu)建模型的自變量，采用方差分析（F檢驗）對進入模型的自變量構(gòu)成的回歸方程進行顯著性檢驗，如p＜0.05，則回歸方程通過了顯著性檢驗，即該回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義；采用t檢驗對構(gòu)建的回歸方程中回歸系數(shù)進行顯著性檢驗；對進入最終模型的自變量采用多重共線性分析，得出每個因子方差膨脹因子（VIF），如VIF 小于10，表明不存在多重共線性?；貧w模型的擬合優(yōu)度采用調(diào)整后的R2，是回歸方程對因變量的擬合程度。

3 結(jié)果

3.1 馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平

從內(nèi)蒙古高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)采集的82份糞便樣品中，共鑒定出82個獨特的基因型。82只不同馬鹿個體糞便樣品測定的皮質(zhì)醇激素水平為2.05～114.3 ng/g，平均水平為（37.56±24.25）ng/g。

3.2 環(huán)境應(yīng)激對馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平的影響

利用82 只馬鹿個體的糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平建立環(huán)境變量與激素水平的多元線性回歸模型。采用逆向消元法，利用方差分析（F檢驗），刪除距村莊距離、距森林邊緣距離、坡度和坡向4 個變量，最終保留對因變量（皮質(zhì)醇濃度）產(chǎn)生顯著影響的變量包括距道路距離、海拔和NDVI。通過表1 可以看出由距道路距離、海拔和NDVI構(gòu)建的回歸模型具有顯著性（p＜0.05）。

表1 糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物的多元線性回歸模型方差分析Tab.1 Multivariate linear regression model variance analysis of fecal cortisol metabolites

由多元線性回歸模型系數(shù)可知，距道路距離、NDVI 和海拔是影響馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平的主要因子，對3 個變量構(gòu)建的回歸方程的系數(shù)進行t檢驗，3 個變量的系數(shù)均顯著（p＜0.05），表明解釋因變量（皮質(zhì)醇濃度）具有解釋力，同時距道路距離、NDVI 值和海拔3 個變量通過了多重共線性的檢驗，即方差膨脹因子（VIF）均小于2（表2）。

表2 馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物的多元線性回歸模型系數(shù)Tab.2 Multiple linear regression model coefficients of cortisol metabolites in red deer faeces

構(gòu)建的最終回歸方程調(diào)整后的R2解釋率為78.08%，模型擬合程度高。Durbin-Watson值為1.1，檢驗回歸分析殘差項不存在自相關(guān)。模型回歸方程為：

FCM=27.5-0.414 6 距道路距離+0.057 97 海拔-165.1NDVI。

在模型的殘差分析圖（圖2）中，正態(tài)概率圖符合正態(tài)分布，在擬合值和序列圖中，正態(tài)概率圖在0 軸上下不規(guī)則波動。

圖2 馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物的多元線性回歸統(tǒng)計分析結(jié)果Fig.2 Statistical diagnoses of multiple linear regression model for fecal cortisol metabolites of red deer

從馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平主效應(yīng)圖（圖3）進一步可以看出，馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物與距道路距離、NDVI值呈負(fù)相關(guān)，與海拔呈正相關(guān)，隨著海拔的升高，馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物平均值水平呈上升趨勢。

圖3 馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物（FCM）擬合平均值與距道路距離、海拔、NDVI的主效應(yīng)分析結(jié)果Fig.3 The main effect plot analysis of fitted mean hormone fecal cortisol metabolites（FCM）to distance to roads，elevation，and normalized difference vegetation index（NDVI）

通過對馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平與距道路距離、海拔和NDVI 值之間的等值線圖分析得出，馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平隨NDVI值升高而下降，隨海拔值升高而上升，隨距道路距離值升高先下降后上升（圖4）。

圖4 糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物（FCM）與距道路距離、NDVI、海拔三維表面高程Fig.4 Fecal cortisol metabolites（FCM）and distance to roads，normalized difference vegetation index（NDVI），and elevation to village using threedimensional surface

4 討論

本研究確定了冬季馬鹿種群的糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平，并探究影響糞便皮質(zhì)醇激素水平變化的環(huán)境因子。根據(jù)目前關(guān)于生態(tài)應(yīng)激的研究和全面的理論框架，人為因素是皮質(zhì)醇激素水平變化的主要驅(qū)動力，道路往往通過棲息地喪失或破碎、噪音和直接死亡等方式對陸地野生動物產(chǎn)生負(fù)面影響［13］。道路通過改變動物的活動范圍、運動、繁殖成功率、逃跑反應(yīng)和生理狀態(tài)來改變行為［14］。本研究表明，隨著馬鹿的活動范圍接近道路，馬鹿糞便皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物水平增加，這與Zbyryt 等［15］研究結(jié)果一致，表明人為因素（狩獵、道路）與狼（Canis lupus）、猞猁（Lynx lynx）糖皮質(zhì)激素水平梯度呈正相關(guān)。Koemle 等［16］分析了高速公路建設(shè)對奧地利馬鹿、狍（Capreolus pygargus）和野豬（Sus scrofa）種群的影響，結(jié)果表明同一地區(qū)的狍和野豬種群數(shù)量均隨公路密度的增加而減少，而在鄰近區(qū)域呈上升趨勢。海拔高度作為諸多環(huán)境因子的綜合反映，是影響物種分布的關(guān)鍵性生境因子。海拔對狍生境選擇的影響主要表現(xiàn)在海拔為0～500 m 時，海拔越低，狍出現(xiàn)的頻率越高，海拔與狍的出現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)；當(dāng)海拔大于500 m 時，隨著海拔的不斷升高，狍出現(xiàn)次數(shù)也在不斷地增加［17］。近年來，NDVI被用于評價生境質(zhì)量與動物生活史性狀之間的關(guān)系［18］，大多數(shù)食草動物主要依賴于地面植被［19］。Shamon 等［20］建立了與NDVI 和NDVI 斜率（變化速率和方向）相關(guān)的有蹄類檢測模型，在局部尺度上，一些有蹄類動物選擇較高的食物數(shù)量，一些有蹄類動物選擇較高的食物質(zhì)量。野生動物物種的長期壓力水平可能與食物的可獲得性和豐度有關(guān)。研究表明灰熊（Ursus arctos）毛發(fā)的皮質(zhì)醇濃度與人為干擾、食物資源可用性和地形條件相關(guān)的景觀變量有關(guān)［21］。

本研究旨在反應(yīng)馬鹿對生境因素及人為干擾環(huán)境的生理應(yīng)激反應(yīng)。通過收集糞便樣本為測量未受干擾的馬鹿糞便皮質(zhì)醇激素濃度和應(yīng)激反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)，有助于識別內(nèi)蒙古高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)馬鹿棲息地的一些潛在壓力來源，觀察到的壓力空間模式可能與食物的可用性、分布與干擾的特征有關(guān)。了解環(huán)境因子對馬鹿糞便皮質(zhì)醇的影響可以對野生馬鹿的保護和管理工作提供理論依據(jù)。