張苗苗, 李雪, 陸仁飛, 張義全, 周敏

(1. 南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院檢驗(yàn)科, 江蘇 南通 226006; 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 3. 南通市疾病預(yù)防控制中心微生物科, 江蘇 南通 226007)

在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究中,通常需要測定調(diào)控蛋白質(zhì)是否能與靶基因啟動(dòng)子區(qū)DNA序列相互作用并確定對應(yīng)的作用位點(diǎn),常用的實(shí)驗(yàn)方法為凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和DNase I足跡實(shí)驗(yàn)[1]。然而,EMSA和DNase I足跡實(shí)驗(yàn)均屬于體外實(shí)驗(yàn),不能準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)的準(zhǔn)確結(jié)合序列,而且常出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外,DNase I足跡實(shí)驗(yàn)還需要特殊的設(shè)備(如測序儀)或原材料(如放射性同位素),不適合作為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。因此,急需要一種替代實(shí)驗(yàn)方法來解決上述問題。

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immuno-precipitation,ChIP)是利用特異性抗原抗體反應(yīng),在基因組水平上研究生命體組織或者細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)方法[2]。ChIP技術(shù)在真核生物中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用,具有多種相應(yīng)的試劑盒,但是這些試劑盒并不適用于原核生物[3]。

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭陰性嗜鹽性弧菌,廣泛存在于近海海水、海底沉淀物以及海產(chǎn)品中,感染后可引起以腹瀉、腹痛、低燒、嘔吐等為主要癥狀的急性腸胃炎[4]。副溶血弧菌可分泌多種毒力因子包括耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)、耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)和Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)等[5-6]。AphA和OpaR分別是副溶血弧菌密度感應(yīng)系統(tǒng)在低密度和高密度下的核心調(diào)控子,參與調(diào)控生物膜形成、毒力因子、運(yùn)動(dòng)等生命活動(dòng)[7-9]。QsvR是AraC家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,與密度感應(yīng)系統(tǒng)協(xié)同調(diào)控毒力基因的表達(dá)[1]。在低密度條件下,AphA間接抑制qsvR的轉(zhuǎn)錄;高密度時(shí),OpaR間接激活qsvR的轉(zhuǎn)錄[1]。QsvR在高密度條件下表達(dá)量較高,主要在高密度條件下發(fā)揮調(diào)控作用,直接抑制和激活aphA和opaR的轉(zhuǎn)錄[1]。QsvR直接激活T3SS1相關(guān)基因exsBAD-vscBCD,T3SS2相關(guān)基因vtrA(vpa1332-1333)、vopB2(vpa1362-1358)和tdh2,T6SS2相關(guān)基因vpa1027-1024、vpa1043-1028和vpa1044-1046的轉(zhuǎn)錄[1,10]。此外,QsvR抑制相關(guān)極鞭毛基因的表達(dá),而對側(cè)鞭毛基因無調(diào)控作用,對生物膜的形成也具有一定的調(diào)控作用[11-12]。

本研究旨在建立副溶血弧菌中ChIP-qPCR的方法,為后續(xù)研究原核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA序列相互作用的調(diào)控通路提供可靠的實(shí)驗(yàn)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副溶血弧菌RIMD2210633qsvR非極性突變株(ΔqsvR)、大腸埃希菌S17 λpir和重組質(zhì)粒pBAD33-qsvR-2×Flag由南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院檢驗(yàn)科保存。

1.1.2 主要試劑 HI培養(yǎng)基(2.5%腦心浸肉湯培養(yǎng)基)購自美國BD Bioscience公司;抗Flag M2磁珠購自美國SigmaAldrich公司;即用型溶菌酶購自美國Epicentre Biotechnologies公司;蛋白酶抑制劑(PIC)購自瑞士Roche Applied Sciences公司;SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版(SYBR Green)和FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑購自天根生化科技(北京)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自QIAGEN公司;TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司;抗Flag標(biāo)簽單克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 pBAD33-qsvR-2×Flag重組質(zhì)粒的熱激轉(zhuǎn)化

取100 μL大腸埃希菌S17 λpir感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化,加入100 ng pBAD33-qsvR-2×Flag重組質(zhì)粒,冰上孵育30 min。42 ℃、90 s進(jìn)行熱休克,立即冰浴2 min,加入900 μL事先預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基(1% NaCl、1%胰蛋白胨和0.5%酵母粉),于37 ℃靜置孵育1 h。4 ℃、4 000 r/min離心5 min,棄去900 μL上清液,將剩下100 μL菌液混勻,均勻涂布于含20 μg/mL氯霉素的LB平板(1% NaCl、1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉和1.5%瓊脂)上,37 ℃培養(yǎng)出單克隆。選取3個(gè)單克隆以qsvR-RT-F/R和pBAD33-F/R為引物(表1),進(jìn)行PCR鑒定[13],此時(shí)菌株記為S17/pBAD33-qsvR-2×Flag。

表1 所用引物序列

1.3 pBAD33-qsvR-2×Flag重組質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移

取10 μL S17/pBAD33-qsvR-2×Flag和副溶血弧菌ΔqsvR甘油菌株分別接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min,培養(yǎng)12～14 h。分別取500 μL S17/pBAD33-qsvR-2×Flag和ΔqsvR,4 000 r/min離心5 min收集菌體,然后用1 mL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,每次4 000 r/min離心3 min。分別用100 μL LB液體培養(yǎng)基重懸菌體,并混合在一起,取100 μL混合菌液點(diǎn)種在LB平板上。待菌液干燥后,將LB平板30 ℃靜置培養(yǎng)6～8 h。用1 mL無菌PBS刮取LB平板上的菌斑,取100 μL涂布于含有5 μg/mL氯霉素和100 μg/mL氨芐西林的LB平板上,37 ℃靜置培養(yǎng)至分離出單克隆。選取3個(gè)單克隆以toxR-RT-F/R、qsvR-RT-F/R和pBAD33-F/R為鑒定引物(表1),作PCR鑒定[13],此時(shí)菌株記為ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

取10 μLΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag甘油菌種接種于5 mL的HI肉湯中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。50倍稀釋轉(zhuǎn)接至5 mL HI肉湯中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至D(600 nm)為1.2～1.4。1 000倍稀釋轉(zhuǎn)接至50 mL HI肉湯中,設(shè)置加阿拉伯糖誘導(dǎo)組(Ara+),未加阿拉伯糖誘導(dǎo)(Ara-)作為對照,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至D(600 nm)為1.0。氯霉素工作濃度為5 μg/mL,阿拉伯糖為0.1%。

1.5 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測QsvR-2×Flag蛋白

ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag菌株按照“1.4”方法培養(yǎng)后,分別取加阿拉伯糖和不加阿拉伯糖誘導(dǎo)的5 mL菌液,用PBS緩沖液懸起菌體并超聲碎菌,4 ℃、12 000 r/mim離心10 min后,取上清液,用Micro BCATMProtein Assay Kit測定上清液中的總蛋白含量。取等量總蛋白的阿拉伯糖誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的裂解上清液進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,而后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,以抗Flag標(biāo)簽單克隆抗體為一抗,HRP標(biāo)記的IgG為二抗,進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)[14],通過比較特異性條帶的差異來判斷QsvR-2×Flag的表達(dá)量。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測qsvR mRNA的表達(dá)

ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag菌株按照“1.4”方法培養(yǎng)后,采用TRIzol法提取阿拉伯糖誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)菌體的總RNA。分別取1 μg的總RNA,利用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版(SYBR Green)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR分析[15]。以16S rRNA基因作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法對qsvR的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量,所用引物見表1。

1.7 DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)

ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag菌株按照“1.4”方法培養(yǎng)后,分別取阿拉伯糖誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的菌液40 mL,添加1.1 mL 37%的甲醛溶液,置30 ℃、100 r/min下作用10 min。10 mL/管分裝至無核酸酶離心管中,向每管中添加2.5 mol/L的甘氨酸溶液1 mL,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。4 ℃、4 649×g離心10 min,沉淀用10 mL預(yù)冷的PBS洗滌2次,重懸于1 mL預(yù)冷的PBS中,隨后補(bǔ)加25×蛋白酶抑制劑40 μL和100 mmol/L苯基甲基磺酰氟10 μL,混勻。4 ℃、16 000×g離心5 min,棄上清液,沉淀保存至-80 ℃冰箱中。

1.8 超聲裂菌

分別取一管加阿拉伯糖誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的交聯(lián)后菌體,用0.5 mL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、EDTA、14.5 kU/mL溶菌酶和20 μg/mL RNase A)重懸,37 ℃孵育30 min。加入0.5 mL 2×IP緩沖液(200 mmol/L Tris-HCl、600 mmol/L NaCl、4% Triton X-100、0.2×蛋白酶抑制劑和2 mmol/L苯基甲基磺酰氟),渦旋混勻。100 W超聲裂菌,裂菌參數(shù)為超聲裂解6 s、間隔6 s,共9 min。4 ℃、16 000×g離心10 min,每管上清液200 μL分裝至無核酸酶EP管中。分別取出一管超聲上清液添加4 μL 5 mol/L NaCl,65 ℃孵育4 h,充分渦旋混勻后,16 000×g離心3 min。將上層水相利用酚氯仿法提取總DNA,進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,DNA片段應(yīng)均在100～1 000 bp之間。

1.9 ChIP反應(yīng)

分別取阿拉伯糖誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的超聲裂解液上清液0.4 mL,其中0.2 mL用作Input樣品,0.2 mL用作IP。用裂解液將IP樣品補(bǔ)加到1 mL,加入到50 μL經(jīng)平衡的抗Flag磁珠中,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。用1 mL洗滌液1(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、250 mmol/L LiCl和2% Triton X-100)、洗滌液2(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、600 mmol/L NaCl和2% Triton X-100)和洗滌液3(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、300 mmol/L NaCl和2%Triton X-100)分別洗滌3次,再用TE洗滌液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0和1 mmol/L EDTA)洗滌3次。將磁珠重懸于0.2 mL洗脫液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L EDTA和1%十二烷基硫酸鈉)中。洗脫產(chǎn)物于65 ℃孵育2 h,3 100×g離心30 s,上清液轉(zhuǎn)移至無核酸酶EP管中。

1.10 去交聯(lián)和qPCR

向Input和IP DNA中加入5 mol/L NaCl 8 μL,65 ℃孵育4 h,以去交聯(lián)。加入0.5 mol/L EDTA 5 μL、10 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.0和10 mg/mL蛋白酶K 2 μL,45 ℃孵育1 h。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化Input和IP樣品,用0.1～0.2 mL的無菌去離子水洗脫DNA。參考文獻(xiàn)[16]的方法,實(shí)時(shí)定量PCR檢測目標(biāo)DNA(aphA、opaR、exsB和vtrA)的IP量,計(jì)算公式為2(Ct Input-Ct IP)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 9.4.1和Visio Professional 2019進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并進(jìn)行繪圖。qPCR實(shí)驗(yàn)至少形成3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pBAD33-qsvR-2×Flag重組質(zhì)粒的鑒定

將pBAD33-qsvR-2×Flag重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸埃希菌S17 λpir,PCR鑒定結(jié)果見圖1,相較于pBAD33空質(zhì)粒,陽性克隆的pBAD33質(zhì)粒中克隆入了qsvR基因片段,分子量較大,電泳條帶滯后。

A:引物對為pBAD33-F/R;B:引物對為qsvR-RT-F/R;A4:pBAD33空質(zhì)粒;B4:WT基因組DNA;A5和B5:無模板對照

2.2 ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)菌株的鑒定

將pBAD33-qsvR-2×Flag重組質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移入ΔqsvR中,獲得ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag,PCR驗(yàn)證后,保存菌種用作實(shí)驗(yàn)菌株。提取ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag的總蛋白,蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)顯示,未加阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌株中QsvR-2×Flag蛋白的表達(dá)低于檢測下線,而經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌株QsvR-2×Flag蛋白大量表達(dá)。提取ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag的總RNA,qPCR結(jié)果可見,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌株中qsvR的mRNA豐度是未加阿拉伯糖的130多倍。見圖2。由此可見,阿拉伯糖誘導(dǎo)與否qsvR的表達(dá)量存在顯著差異,可用無阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌株ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag作為本研究的對照組。

Ⅰ:PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)菌株,A:引物對為pBAD33-F/R;B:引物對為qsvR-RT-F/R;C:引物對為toxR-RT-F/R;A4:pBAD33空質(zhì)粒;B4和C4:WT基因組DNA;A5、B5和C5:無模板對照。Ⅱ:蛋白質(zhì)印跡。Ⅲ:qPCR,*:P<0.05

2.3 副溶血弧菌中QsvR的ChIP-qPCR

將pBAD33-qsvR-2×Flag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ΔqsvR中,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)后表達(dá)QsvR-2×Flag蛋白,在副溶血弧菌中可以與基因組DNA交聯(lián)形成2×Flag-QsvR-DNA復(fù)合體,通過抗原抗體特異性反應(yīng)將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體沉淀出來,解交聯(lián)后獲得與QsvR直接結(jié)合的DNA,利用qPCR分析可獲得QsvR與DNA相互作用的信息。結(jié)果如圖3所示,相較于未經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌株,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)菌株的aphA、opaR、exsB和vtrA的IP量明顯較高,分別高3.68、8.02、9.44和8.05倍,表明在副溶血弧菌體內(nèi)QsvR與aphA、opaR、exsB和vtrA具有結(jié)合作用。對于16S rRNA,二者之間沒有明顯的差異,表明QsvR與16S rRNA不結(jié)合。

*:P<0.05

3 討論

ChIP是在活細(xì)胞狀態(tài)下分析蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù),可以彌補(bǔ)常用實(shí)驗(yàn)方法的不足。其原理是,靶蛋白質(zhì)氨基酸序列末端標(biāo)記特定標(biāo)簽,在菌體內(nèi)與DNA進(jìn)行交聯(lián),形成蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物;提取菌體基因組DNA并將其裂解為100～1 000 bp大小不等的片段,經(jīng)特定單克隆抗體與蛋白質(zhì)中的標(biāo)簽進(jìn)行特異性抗原抗體反應(yīng)沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,解交聯(lián)后收集DNA,利用qPCR檢測蛋白質(zhì)結(jié)合靶DNA的量[3]。ChIP不僅可以與qPCR相結(jié)合分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控子與特定靶基因的相互作用信息,也可以結(jié)合測序技術(shù)來探究蛋白質(zhì)的未知靶基因或者識別特定蛋白質(zhì)在整個(gè)基因組中的所有靶基因[3]。目前,在原核生物中,已有ChIP應(yīng)用的案例,例如,利用ChIP-qPCR確定了在大腸埃希菌體內(nèi)與σ因子RpoE直接相互作用的靶基因[16];ChIP與測序技術(shù)相結(jié)合分析出溶藻弧菌(V.alginolyticus)基因組內(nèi)DNA結(jié)合蛋白ToxR和LuxR的結(jié)合位點(diǎn)[17-18]。本研究對交聯(lián)、免疫沉淀反應(yīng)和解交聯(lián)等步驟進(jìn)行了優(yōu)化,以副溶血弧菌中調(diào)控子蛋白QsvR為研究對象,成功建立了ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù),并驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

QsvR是AraC家族的DNA結(jié)合蛋白,在副溶血弧菌中與密度感應(yīng)系統(tǒng)的兩個(gè)核心調(diào)控子AphA和OpaR協(xié)同調(diào)控毒力和生物膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[1,11]。體外的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和DNase Ⅰ足跡實(shí)驗(yàn)表明QsvR與aphA(-312…-175)、opaR(-190…-72)、exsB(-200…-88)和vtrA(-148…-67)啟動(dòng)子區(qū)DNA片段具有結(jié)合作用,與16S rRNA片段無結(jié)合作用[1]。本研究建立了副溶血弧菌中的ChIP-qPCR,并且驗(yàn)證了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌株aphA、opaR、exsB和vtrA的IP量比未誘導(dǎo)菌株明顯升高,表明QsvR與aphA、opaR、exsB和vtrA具有直接的結(jié)合作用,解決了沒有相應(yīng)試劑盒的困境,為后續(xù)研究原核生物體內(nèi)調(diào)控通路提供了可靠的實(shí)驗(yàn)手段。