駱園園 沈雨青 蘇奶助 龔君順 符虹 盧春敬 鄭艷玲

RhD 血型不合導(dǎo)致的新生兒溶血癥（hemolytic disease of newborn，HDN）通常發(fā)生在第二胎及以后，一般病情嚴(yán)重，很容易導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大，甚至死胎或新生兒死亡等，如治療不及時，病死率極高［1］。然而由于血液成分復(fù)雜多變，其中的纖維蛋白、藥物或相關(guān)抗體都可能干擾檢測結(jié)果［2-3］，因此如何準(zhǔn)確鑒定血型和快速有效地確診致病抗體類型對患兒的臨床救治尤為關(guān)鍵。我們在工作中遇到了1 例抗-D 效價高達(dá)2 048 的孕婦，新生兒出生后發(fā)生重度HDN 并出現(xiàn)RhD 抗原遮蔽現(xiàn)象，導(dǎo)致常規(guī)RhD 抗原檢測方法所得結(jié)果為陰性，通過酸放散試驗和血型基因檢測確診患兒血型，及時配型換血使其成功獲救，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患兒為女性，出生6 h 后因皮膚黃染進(jìn)行黃疸相關(guān)檢測，總膽紅素（total bilirubin，TBil）382.89 μmol/L。母親血型為RhD 陰性，有妊娠史，無輸血史。因患兒外院初檢ABO 和RhD 同血型而出現(xiàn)其他病情無法解釋的速發(fā)高膽紅素血癥而送檢至本院。本研究已通過本院倫理委員會審批（審批號：KY-2023-088-K01）。

1.2 儀器與試劑 THZ-82 恒溫震蕩水浴箱（常州國華儀器有限公司），KA-2200 細(xì)胞洗滌離心機(jī)（久保田中國投資有限公司），孵育器及離心機(jī)（北京斑珀斯技貿(mào)有限責(zé)任公司），Lab-Aid 824s 全自動核酸檢測儀（廈門致善生物科技股份有限公司），IH1000全自動血型檢測儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司）。單克隆抗-A、抗-B（批號：20201016）、抗-D（批號：20201810）、抗-E（批號：20203201）、抗-e（批號：20203301）、抗-C（批號：20203001）、抗-c（批號：20203101）、多特異性抗-IgG、C3d（批號：20201016）、抗體篩選細(xì)胞（批號：20217014）均由上海血液醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；抗體鑒定譜細(xì)胞（荷蘭三昆試劑有限公司，批號8000452946），ABO/Rh 正反定型血型定型試劑卡（達(dá)亞美有限責(zé)任公司，批號50093.91.16），微柱凝膠卡（北京斑珀斯技貿(mào)有限責(zé)任公司，批號：21072.01），血液基因組DNA 提取試劑（廈門致善生物科技股份有限公司，批號：21060901），Rh 血型分型檢測卡（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司，批號：202102014），紅細(xì)胞放散液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：20201014），人類紅細(xì)胞RhD 基因分型試劑盒（天津秀鵬基因科技有限公司，批號：K210525002），BX1020 抗IgG1、抗vgG3 抗人球蛋白檢測卡（長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.3 血清學(xué)檢測

1.3.1 血型鑒定、新生兒溶血病檢測、抗體鑒定及抗體效價檢測 ABO 血型鑒定、Rh 血型鑒定、Rh血型分型、直接抗球蛋白試驗、新生兒溶血病、抗體篩選與鑒定、抗體效價檢測中使用的鹽水試管法、聚凝胺法、抗人球蛋白法均參照輸血科（血庫）臨床技術(shù)操作規(guī)范操作［4］。不同品牌的凝膠卡及酸放散試劑使用方法參考試劑說明書。

1.3.2 患兒紅細(xì)胞熱放散處理 配制濃度為1%的患兒紅細(xì)胞，用37 ℃生理鹽水洗滌3 次后，于56 ℃水浴箱中熱放散10 min，取出后再用37 ℃生理鹽水洗滌3 次，配制濃度為3%的紅細(xì)胞與IgM 抗-D 試劑，采用鹽水試管法檢測RhD 抗原。

1.3.3 患兒紅細(xì)胞酸放散處理 酸放散試劑使用步驟參見試劑說明書。酸放散處理后的紅細(xì)胞配制成3%濃度，用37 ℃生理鹽水洗滌至少8 次，以洗滌液由淡紅色轉(zhuǎn)為清亮為節(jié)點，再配制成3%～5%紅細(xì)胞后，采用IgM 抗-D 試劑和鹽水試管法檢測紅細(xì)胞RhD 抗原。

1.4 血型基因的分子生物學(xué)鑒定 采用全自動核酸檢測儀提取DNA，送檢天津秀鵬生物有限公司，采用跨越斷裂點聚合酶鏈反應(yīng)（gap-polymerase chain reaction，GAP-PCR）分析RhD 基因盒子，再進(jìn)一步采用基因測序方法檢測血型，具體檢測方法及步驟參見文獻(xiàn)［5-6］。

1.5 抗體IgG 分型檢測 樣本送檢長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司，具體檢測步驟參見文獻(xiàn)［7］。

2 結(jié)果

2.1 患兒RhD 抗原血清學(xué)鑒定 采用酸放散試驗處理紅細(xì)胞后，結(jié)果為RhD 抗原陽性（2+）。見表1。

表1 不同方式處理紅細(xì)胞后與抗-D 試劑反應(yīng)結(jié)果

2.2 分子生物學(xué)鑒定 患兒的RhD 血型基因為RhD+/RhD-雜合型（陽性）。

2.3 血型鑒定結(jié)果 母親和患兒的血型鑒定結(jié)果分別為O、dccee 和O、DccEe。

2.4 抗體鑒定 將母親和患兒的血漿及放散液分別與抗體鑒定譜細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示母親和患兒血清中均存在抗-D，反應(yīng)格局見表2。

表2 母親與患兒抗體鑒定表

2.5 抗體效價結(jié)果 母親及患兒IgG 抗-D 效價測定結(jié)果均為2 048。

2.6 致病抗體IgG 分型 母親和患兒體內(nèi)存在高效價IgG1 和低效價IgG3 抗體。

2.7 患兒換血及輸血前后血紅蛋白（hemoglobin，Hb）和TBil 水平變化 患兒出生6 h 內(nèi)Hb 僅為82 g/L，TBil 為382.89 μmol/L。使用3 U 去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞（O 型，Rh 血型為dccee）和200 mL 血漿，于24 h內(nèi)進(jìn)行換血治療。3 h 后復(fù)查TBil 降為221.5 μmol/L，Hb 升至129 g/L，指標(biāo)明顯改善，與其他文獻(xiàn)報道一致［8］。持續(xù)進(jìn)行光照和藥物治療，換血48 h 后，復(fù)查Hb 為132 g/L。每日監(jiān)測經(jīng)皮膽紅素，1 周后患兒體征平穩(wěn)，已出院。

3 討論

HDN 的發(fā)病率和嚴(yán)重程度除了與母親IgG 抗體效價呈正相關(guān)，也與致病抗體IgG 類型相關(guān)［9-11］，一般認(rèn)為Rh 血型不合抗體效價在16 時具有臨床意義，需在孕期密切監(jiān)測胎兒相關(guān)指標(biāo)的變化［12］。IgG 抗體是唯一能通過胎盤的抗體，胎盤上含有新生兒Fc 受體（FcRn），IgG 可選擇性地與FcRn 結(jié)合，從而轉(zhuǎn)運到胎兒的血液循環(huán)中［13］。根據(jù)r 鏈抗原性差異，IgG 抗體可分為4 個亞型，在血漿中的濃度由高至低依次為IgG1＞IgG2＞IgG3＞IgG4［14］。Rh系統(tǒng)的血型抗體以IgG1 和IgG3 為主，而IgG1、IgG3較易通過胎盤，并具有細(xì)胞毒作用，可以促使巨噬細(xì)胞接觸和吞噬紅細(xì)胞，并促使K 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞破壞紅細(xì)胞，因此由其引起的HDN 發(fā)展迅速，溶血程度嚴(yán)重，病死率高［15-16］。臨床應(yīng)積極對產(chǎn)前孕婦體內(nèi)的IgG1、IgG3 水平進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，為進(jìn)一步保障RhD 抗原陰性孕產(chǎn)婦生育和再次生育質(zhì)量與輸血安全，在《RhD 陰性孕產(chǎn)婦血液安全管理專家共識》［17］中，制定詳細(xì)的孕期抗-D Ig 使用指南，減少RhD 陰性婦女由于懷孕、輸血和有創(chuàng)診療導(dǎo)致的抗-D 抗體產(chǎn)生，降低孕產(chǎn)婦與圍產(chǎn)兒死亡率。

本病例中，母親體內(nèi)的抗-D 效價高達(dá)2 048，考慮與其多次妊娠相關(guān)。母親為非廈門本地產(chǎn)婦，在初次妊娠時未能注射抗-D Ig 進(jìn)行有效保護(hù)。腹中胎兒能存活至分娩，可能與胎盤的屏障作用、胎兒紅細(xì)胞抗原強(qiáng)弱以及母體人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）抗體等因素有關(guān)。孕期胎兒體內(nèi)的膽紅素可經(jīng)胎盤進(jìn)入母體，由母親肝臟處理后排出。當(dāng)胎兒娩出后，新生兒產(chǎn)生的膽紅素?zé)o法通過母體排出，而新生兒本身不成熟的肝臟缺少結(jié)合酶，導(dǎo)致其體內(nèi)未結(jié)合膽紅素升高，引起黃疸［18］。也有可能是因為患兒母親多次妊娠后，體內(nèi)產(chǎn)生的抗HLA 抗體封閉了胎兒巨噬細(xì)胞的FcRn，阻止了胎兒致敏紅細(xì)胞被破壞［7］。胎兒分娩后，失去了母源性HLA 抗體的保護(hù)，因此在出生6 h 后TBil 水平急速升至382.89 μmol/L，Hb 降為82 g/L。患兒血型鑒定采用鹽水法、試管法、血型卡檢測RhD 抗原均為陰性，鑒于其高膽紅素血癥的臨床表現(xiàn)、直接抗人球蛋白試驗強(qiáng)陽性，結(jié)合母親及其血漿抗-D 效價為2 048，考慮疑似出現(xiàn)RhD 抗原“遮蔽現(xiàn)象”，即新生兒D抗原陽性紅細(xì)胞完全被抗-D 抗體封閉，導(dǎo)致紅細(xì)胞上沒有D 位點與血清試劑反應(yīng)，從而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果［2］。本研究采用熱放散處理患兒紅細(xì)胞后進(jìn)行RhD 抗原檢測，結(jié)果卻仍為陰性，考慮是由于該患兒紅細(xì)胞上高效價IgG 型抗-D 抗體數(shù)量多，結(jié)合力強(qiáng)所致。因患兒病情危急，遂采取酸放散試劑對患兒紅細(xì)胞進(jìn)行洗脫，檢測結(jié)果為RhD 抗原陽性（2+）。在隨后的血型基因檢測中也證實該試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)患兒、母親的血型和血站的血庫情況急診換血時，可直接選用O、dccee 紅細(xì)胞和血漿進(jìn)行操作。

綜上所述，RhD 陰性孕產(chǎn)婦應(yīng)及早納入高危妊娠管理系統(tǒng)，在孕期建立完備的產(chǎn)檢資料，將Rh 分型鑒定納入必檢項目，并持續(xù)定期監(jiān)測Rh 抗體效價。有文獻(xiàn)指出常規(guī)檢測Rh 血型的必要性［19］，有條件的孕產(chǎn)婦應(yīng)根據(jù)《RhD 陰性孕產(chǎn)婦血液安全管理專家共識》［17］進(jìn)行抗D Ig 的預(yù)防注射。隨著我國“三孩政策”的放開，RhD 陰性女性的妊娠概率將明顯增高，醫(yī)院在此類特殊孕產(chǎn)婦及新生兒的規(guī)范管理能力和實驗室檢測水平方面亟需加強(qiáng)。實驗室應(yīng)根據(jù)母嬰就診狀況，及時選用合適的試劑和檢測方法，快速正確地鑒定血型，為臨床救治爭取時間。有條件的實驗室可根據(jù)2021 年發(fā)布的《胎兒新生兒溶血病實驗室檢測專家共識》［20］進(jìn)行檢測方法的指導(dǎo)，通過血型基因檢測、孕母出血情況監(jiān)測、IgG 亞型檢測、母親外周血非侵入性胎兒血型基因檢測（cff-DNA）等方法來驗證新生兒血型，預(yù)測胎兒血型，分析HDN 的嚴(yán)重程度，制定個性化的診療方法，減少胎兒HDN 的發(fā)病率，從而提高HDN 新生兒的救治率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突