陳啟艷，孫 媛，高春華，孟楚浛，隋海娟，于海英，張 玲*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121001； 4.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，遼寧 錦州 121001）

心肌肥厚是許多心血管疾病發(fā)展過程中一個重要的病理階段，持續(xù)性心肌肥厚最終會因心臟功能失常而出現(xiàn)心力衰竭，因此，探尋延緩或逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥厚的藥物已成為防治心力衰竭的重要策略之一。紅芪多糖是紅芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血糖、抗腫瘤等多種藥理作用［1-3］。在心血管疾病方面，已有研究顯示紅芪多糖對糖尿病心肌病小鼠和急性心肌梗死大鼠的心肌損傷具有保護作用［4-5］，但對心肌肥厚是否存在影響未見報道。本次研究運用異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO） 誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型，探討紅芪多糖對小鼠心肌肥厚的作用及相關(guān)信號通路的影響，以期為心肌肥厚的防治提供新的用藥方案。

1 材料

1.1 動物 SPF 級野生雄性C57BL/6N 小鼠，體質(zhì)量20～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司 ［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京）2021-0006］，飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)SPF 級實驗動物中心［實驗動物使用許可證號SYXK （遼） 2019-0007］，環(huán)境溫度20～24 ℃、相對濕度50% ～56%。動物實驗中的所有操作均符合錦州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會要求（倫理號2022029）。

1.2 試劑 紅芪多糖 （ 純度 90%，批號20210508，甘肅益生祥生物技術(shù)有限公司）。ISO、普萘洛爾 （貨號 I5627-5G、BCBB9359，美國Sigma 公司）； 游離脂肪酸（FFA）、腺苷三磷酸（ATP）、腺苷單磷酸（AMP） ELISA 試劑盒（貨號DY5848、DY4385-05、KGE011B，美國R＆D 公司）； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號R333-01，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）； 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、磷酸化-PI3K （p-PI3K） 一抗 （貨號ab182653、ab189401，英國Abcam 公司）； 蛋白激酶B （Akt）、磷酸化-Akt （p-Akt） 一抗 （貨號4691、4060，美國Cell Signaling Technology 公司）；β-actin （貨號210819，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 CISA-1000 計算機圖象分析系統(tǒng)（北京大恒圖像視覺有限公司）； Pclab 生物信號采集處理系統(tǒng)（南京易美科技有限公司）； 光學(xué)顯微鏡及照相機 （日本Olympus 公司）； Bio-Rad Model 1000/500 型電泳儀 （ 美國 Bio-Rad 公司）；ChampGelTM3000 凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組 50 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、普萘洛爾組（40 mg/kg） 和紅芪多糖低、高劑量組 （60、120 mg/kg），每組10 只。普萘洛爾組灌胃給予40 mg/kg普萘洛爾； 紅芪多糖組灌胃給予60、120 mg/kg 紅芪多糖； 空白組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)15 d。模型組和各給藥組均在灌胃藥物1 d 后開始造模，前3 d 于小鼠背部皮下分別注射40、20、10 mg/kg ISO，第4 天皮下注射5 mg/kg ISO，持續(xù)10 d； 空白組小鼠皮下注射等量生理鹽水。

2.2 小鼠心臟指數(shù)測定 給藥結(jié)束后24 h，稱定小鼠體質(zhì)量； 取血處死后，開胸取出心臟，剪去周圍血管及組織，生理鹽水洗盡殘血，濾紙吸干，稱定心臟質(zhì)量； 再剔除心房和右心室，稱定左心室質(zhì)量。計算全心指數(shù)（心臟質(zhì)量/體質(zhì)量） 和左心指數(shù)（左心室質(zhì)量/體質(zhì)量）。

2.3 Masson 染色觀察心肌組織形態(tài)變化 左心室心肌組織塊于4% 多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，制備組織切片，行Masson 染色，于光鏡下觀察，而后采用CISA-1000 計算機圖象分析系統(tǒng)測定心肌細胞橫徑 （cardiomyocyte diameter，TDM） 和心肌膠原百分比 （cardiac ventricle fibrosis，CVF），每張切片隨機選取3 個視野，每個視野檢測10 個細胞。

2.4 ELISA 法檢測心肌組織FFA、ATP、AMP 水平 取出于液氮灌中凍存的心肌組織，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液，勻漿，收集勻漿液于離心管中，按ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠心肌組織FFA、ATP和AMP 水平。

2.5 RT-qPCR 法檢測心肌組織ANP、BNPmRNA表達 取出于液氮灌中凍存的心肌組織，經(jīng)裂解、抽提、RNA 沉淀和清洗，提取心肌總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。通過Primer Bank 網(wǎng)站在線設(shè)計引物序列，由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，引物序列見表1。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus） 試劑盒行RT-qPCR 反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 Western blot 法檢測心肌組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達 取100 mg 凍存的心肌組織，加入胞漿蛋白抽提試劑于勻漿器中充分勻漿，按試劑盒說明書以BCA 法檢測蛋白濃度。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），蛋白樣本經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜后，封閉液封閉1 h，加入稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 和β-actin 一抗，4 ℃雜交孵育過夜，洗滌后再加二抗進行孵育，ECL 法顯影，通過Image J 軟件分析條帶灰度值，各目的蛋白表達量以內(nèi)參β-actin 進行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，有差別者組間兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法（LSD 法） 檢驗； 偏態(tài)或方差不齊時采用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅芪多糖對心肌肥厚小鼠心臟指數(shù)的影響由表2 可知，與空白組比較，模型組全心指數(shù)和左心指數(shù)均升高（P＜0.01），分別升高了19.75%和23.03%，說明小鼠心臟指數(shù)增大，造模成功； 與模型組比較，紅芪多糖低、高劑量組和普萘洛爾組全心指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01），分別降低了5.26%、7.37% 和13.15%，左心指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01），分別降低了6.15%、9.36%和14.97%，表明紅芪多糖能抑制ISO 引起的小鼠心臟指數(shù)變大。

表2 各組小鼠心臟指數(shù)比較（mg/g，±s，n＝10）Tab.2 Comparison of mouse cardiac indices levels in each group （mg/g，±s，n＝10）

表2 各組小鼠心臟指數(shù)比較（mg/g，±s，n＝10）Tab.2 Comparison of mouse cardiac indices levels in each group （mg/g，±s，n＝10）

注： 與空白組比較，**P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別全心指數(shù)左心指數(shù)空白組4.76±0.283.04±0.21模型組5.70±0.32**3.74±0.24**紅芪多糖低劑量組5.40±0.31＃3.51±0.23＃紅芪多糖高劑量組5.28±0.26＃＃3.39±0.21＃＃普萘洛爾組4.95±0.31＃＃3.18±0.18＃＃

3.2 紅芪多糖對心肌肥厚小鼠心肌組織形態(tài)及TDM、CVF 值的影響 如圖1 所示，空白組小鼠心肌細胞未見明顯肥大及壞死，無膠原纖維增生； 與空白組比較，模型組可見小鼠心肌細胞變大，有局灶性壞死，膠原纖維呈大斑片狀增生（圖中綠色部分）； 與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌細胞肥大程度減輕，心肌纖維排列較整齊，偶有點片狀壞死，膠原纖維增生較少，其中以普萘洛爾組小鼠心肌病變的改善程度最好，紅芪多糖高劑量組次之。

圖1 各組小鼠心肌組織形態(tài)變化（Masson，×200）Fig.1 Morphological changes of mouse myocardial tissue in each group （Masson，×200）

由表3 可知，與空白組比較，模型組小鼠TDM 和CVF 值升高 （P＜0.01），分別升高了29.13%和90.43%； 與模型組比較，紅芪多糖低、高劑量組和普萘洛爾組小鼠TDM 值降低 （P＜0.01），分別降低了7.06%、13.97% 和19.34%，CVF 值也降低（P＜0.01），分別降低了14.1%、25.93%和74.96%。

表3 各組小鼠TDM 和CVF 值比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of mouse TDM and CVF values in each group （±s，n＝10）

表3 各組小鼠TDM 和CVF 值比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of mouse TDM and CVF values in each group （±s，n＝10）

注： 與空白組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TDM/μmCVF/%空白組10.09±0.523.34±0.58模型組13.03±0.59**17.77±1.34**紅芪多糖低劑量組12.11±0.56＃＃13.00±1.57＃＃紅芪多糖高劑量組11.21±0.49＃＃7.57±0.98＃＃普萘洛爾組10.51±0.52＃＃4.45±0.87＃＃

3.3 紅芪多糖對心肌肥厚小鼠心肌組織FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值的影響 由表4可知，與空白組比較，模型組小鼠心肌能量代謝利用底物FFA 水平升高（P＜0.01），反應(yīng)心肌能量生成水平的ATP、AMP 和ATP/AMP 比值降低（P＜0.01）； 與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌組織FFA 水平降低 （P＜0.01），ATP、AMP 和ATP/AMP 值升高 （P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組小鼠心肌組織FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of FFA，ATP，AMP levels and ATP/AMP ratio in mouse myocardial tissue of each group （±s，n ＝10）

表4 各組小鼠心肌組織FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of FFA，ATP，AMP levels and ATP/AMP ratio in mouse myocardial tissue of each group （±s，n ＝10）

注： 與空白組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別FFA/（nmol·L-1）ATP/（mg·g-1）AMP/（mg·g-1）ATP/AMP空白組10.09±0.520.49±0.040.74±0.030.70±0.06模型組13.03±0.59**0.21±0.03**0.48±0.05**0.45±0.06**紅芪多糖低劑量組12.11±0.56＃＃0.30±0.03＃＃0.60±0.06＃＃0.50±0.05＃紅芪多糖高劑量組11.21±0.49＃＃0.36±0.03＃＃0.64±0.04＃＃0.56±0.04＃＃普萘洛爾組10.51±0.52＃＃0.43±0.03＃＃0.69±0.05＃＃0.63±0.06＃＃

3.4 紅芪多糖對心肌肥厚小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達的影響 在心臟處于應(yīng)激狀態(tài)，心室肌牽張會釋放ANP 和BNP 以對抗心肌肥厚，因此ANP 和BNP 被認為是心肌肥厚的重要標(biāo)志［6］。如圖2 所示，與空白組比較，模型組小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達均升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達均降低 （P＜0.01）。

圖2 各組小鼠心肌組織ANP、BNP mRNA 表達比較（±s，n＝10）Fig.2 Comparison of ANP and BNP mRNA expressions in mouse myocardial tissue of each group （±s，n＝10）

3.5 紅芪多糖對心肌肥厚小鼠心肌組織PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組小鼠心肌組織p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白表達比值均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌組織p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白表達比值均有升高（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠心肌組織PI3K 和Akt 蛋白表達比較（±s，n＝5）Fig.3 Comparison of of PI3K and Akt protein expressions in mouse myocardial tissue of each group （±s，n＝5）

4 討論

神經(jīng)體液因素是引起心肌肥厚的多種因素之一。交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活，釋放的兒茶酚胺可激動腎上腺素受體引起心肌肥厚。ISO 激動β 受體可引起心肌細胞肥大、膠原纖維增生，故常作為基礎(chǔ)研究誘導(dǎo)心肌肥厚模型的藥物［7-8］。

全心指數(shù)是心肌肥厚的重要檢測指標(biāo)，左心指數(shù)更是人類心肌肥厚的診斷指標(biāo)［9］。心肌肥厚病理表現(xiàn)為心肌細胞肥大和心肌間質(zhì)纖維化。心肌細胞表面積可以衡量心肌細胞肥大程度，間質(zhì)纖維化則會導(dǎo)致心室重構(gòu)進而引起心律失常、心衰和猝死等。CVF 可反映膠原的沉積程度。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠全心指數(shù)和左心指數(shù)均較空白組增加； 心肌組織切片觀察和TDM、CVF 結(jié)果也證實了模型組小鼠心肌細胞肥大和間質(zhì)纖維化，說明模型制備成功。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞能量代謝紊亂可能是導(dǎo)致心肌肥厚和心肌組織重構(gòu)的潛在機制［10］。ATP 作為細胞活力標(biāo)志，其水平高低可衡量心肌能量儲備狀態(tài)。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細胞處于病理狀態(tài)下，ATP 和AMP 水平均會發(fā)生變化［11］，因此ATP/AMP 的改變是能量變化的綜合體現(xiàn)。本實驗結(jié)果顯示，ISO 可引起小鼠心肌細胞FFA 水平升高和ATP/AMP 比值降低，說明模型小鼠心肌細胞已出現(xiàn)能量代謝紊亂、能量供應(yīng)及儲備不足情況。同時，ISO 還會使作為心肌肥厚標(biāo)志的ANP、BNPmRNA 表達升高，這些結(jié)果也間接反映了ISO 對心肌組織的不良影響。

本研究以“正氣虧虛” 為心肌肥厚的中醫(yī)病機［9］，運用紅芪的“補氣升陽、生津養(yǎng)血” 之功效［12］，觀察紅芪主要活性成分紅芪多糖對ISO 誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型的干預(yù)作用。結(jié)果表明，紅芪多糖可降低ISO 引起全心指數(shù)、左心指數(shù)、TDM和CVF 值的升高，改善心肌組織病理性改變，降低ISO 誘導(dǎo)的心肌組織FFA 水平和ANP、BNPmRNA 表達，提高ATP/AMP 比值。這些結(jié)果表明紅芪多糖可通過改善FFA 的氧化代謝、提高心肌組織能量供應(yīng)和儲備而使小鼠的心肌肥厚指標(biāo)趨于正常。

已有報道指出，ISO 可通過多條信號通路誘導(dǎo)心肌肥厚，PI3K/Akt 信號通路便是其中重要的一條［13］。作為一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，PI3K 可被胞外多種信號激活，其活性產(chǎn)物促使Akt 轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面活化，并進一步磷酸化下游因子（多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等），發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、分化、凋亡等作用［14-16］，調(diào)控心肌細胞的生存和功能，進而干預(yù)心肌肥厚［17-18］。它還是調(diào)控線粒體的通路之一，而線粒體是細胞的“能量供應(yīng)器”［19-20］。本研究顯示，ISO 能抑制PI3K/Akt 信號通路中PI3K 和Akt 的磷酸化，而紅芪多糖可上調(diào)ISO 引發(fā)的p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比值降低。

綜上所述，本次研究證實紅芪多糖對ISO 誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚具有改善作用，該作用可能與提升PI3K/Akt 信號通路活性有關(guān)。