常 悅，張玉立，鄭晗雪，盧夢瑤，吳沅臻，李達(dá)潔，楊 歡*，胡建慧

（1.如皋市人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500； 2.南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500；3.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 4.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鎮(zhèn)江醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212003）

小兒復(fù)方雞內(nèi)金散具有健脾開胃，消食化積的功效，主治小兒因脾胃不和引起的食積脹滿、飲食停滯等［1］，據(jù)報道其治療小兒厭食的總有效率達(dá)96.15%［2］。該方由雞內(nèi)金、六神曲以及淀粉和蔗糖制備而成，2020 年版《中國藥典》 規(guī)定雞內(nèi)金來源為家雞GallusgallusdomesticusBrisson 的干燥沙囊內(nèi)壁［3］，主要偽品為鴨內(nèi)金（來源于麻鴨Anasplatyrhynchos） 和鵝內(nèi)金（來源于家鵝Anseranser），具有與雞內(nèi)金較相似的形態(tài)特征［4］，然而藥典中對雞內(nèi)金的質(zhì)量評價主要依賴于性狀鑒別，缺乏專屬性更強(qiáng)的質(zhì)量控制方法。此外，雞內(nèi)金中主要成分為蛋白質(zhì)、多糖等［5-8］，植物源中藥常用的小分子檢測技術(shù)難以發(fā)揮作用。

目前的動物藥鑒別方法主要基于蛋白質(zhì)和DNA，一些基于色譜和質(zhì)譜的技術(shù)亦被開發(fā)用于動物藥的鑒定，但操作復(fù)雜，設(shè)備昂貴［9-10］。近幾十年來，基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 的技術(shù)已逐步成為動物藥鑒定的核心方法，在便利性等方面具有突出優(yōu)勢［11-16］。中成藥由飲片粉碎或提取后制成，難以通過性狀鑒別等鑒定所含成分。多重PCR 技術(shù)可在混合DNA 中同時分析多個物種，且無需昂貴設(shè)備和特殊試劑［17-20］。本文研究建立了三重PCR 技術(shù)以鑒定小兒復(fù)方雞內(nèi)金散中雞內(nèi)金的真?zhèn)巍?/p>

1 材料

1.1 儀器 AE240 型電子天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； TP-02W-0043 型恒溫金屬浴（寧波拓普森科學(xué)儀器有限公司）； UPT-I-5T 型純水機(jī)（南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司）； ND-1000 Nanodrop 型核酸蛋白分析儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； T100 型PCR 儀、Basic 型電泳電源、Gel Doc EZ 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；TGL-16C 型臺式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、氯化鈉、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、甲醇、三氯甲烷、無水乙醇、異戊醇、異丙醇、鹽酸（36.0～38.0%） 為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； Tris-平衡酚（生物級）購自北京索萊寶科技有限公司； 10 mmol/L dNTP Mix（PCR 級）、DreamTaqTMGreen DNA Polymerase （生物級）均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司； 三羥甲基氨基甲烷（Tris，分子生物級，純度99.9%） 購自德國BioFroxx GmbH 公司； Low DNA Marker （生物級） 購自武漢永璨生物科技有限公司； 瓊脂糖（Low EEO，生物級） 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 溴化乙錠（EB，生物級，純度≥95.0%）、Proteinase K （生物級） 購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.3 藥材 2019 年從國內(nèi)多地市場采集家雞、麻鴨、家鵝干燥胃內(nèi)膜15 批，信息見表1，經(jīng)鎮(zhèn)江市中醫(yī)院孫小祥主任中藥師鑒定為正品。通過COI 條形碼或已發(fā)表文獻(xiàn)特異性引物進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)NCBI 比對同源性均≥97%。從8 個廠家采購小兒復(fù)方雞內(nèi)金散，具體信息見表2，性狀見圖1。

圖1 小兒復(fù)方雞內(nèi)金散性狀

表1 胃內(nèi)膜基原信息

表2 小兒復(fù)方雞內(nèi)金散信息

2 方法

2.1 小兒復(fù)方雞內(nèi)金散及其偽品、陰性制劑制備

2.1.1 小兒復(fù)方雞內(nèi)金散 組方飲片雞內(nèi)金（34 g，自制）、六神曲（66 g，江蘇蘇州市天靈中藥飲片有限公司，批號180904）。根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑第十四冊） 制備，具體制法為2 味飲片分別粉碎成細(xì)粉，加白砂糖40 g、淀粉60 g，混勻，過篩，即得。

2.1.2 偽品 將雞內(nèi)金更換為鴨內(nèi)金或鵝內(nèi)金，按“2.1.1” 項下方法制備，即得。

2.1.3 陰性制劑 不加入雞內(nèi)金，按“2.1.1” 項下方法制備，即得。

2.2 DNA 提取 參考文獻(xiàn)［14］ 報道，稱取“2.1” 項下小兒復(fù)方雞內(nèi)金散及其偽品、陰性制劑各50.0 mg，采用甲醇預(yù)沉淀結(jié)合CTAB 法提取DNA，酚仿抽提法進(jìn)行純化，離心管內(nèi)殘留物以25 μL TE 緩沖液溶解，制得DNA 供試品溶液，-20 ℃保存。

2.3 特異性引物設(shè)計與合成 參考文獻(xiàn)［4］ 報道，從GenBank 數(shù)據(jù)庫中搜索并下載家雞、麻鴨、家鵝3 個物種的線粒體基因序列（登記號NC_001323.1、NC_009684.1、NC_011196.1），并采用Oligo 軟件（v.7.60） 設(shè)計物種特異性引物，由DNAMAN （v.8.0.8.789） 軟件進(jìn)行差異評估，由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，-20 ℃保存，引物序列見表3。

表3 特異性引物序列

2.4 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR 反應(yīng)體系為10×PCR 緩沖液（2.5 μL）、2.0 mmol/L MgCl2（2.5 μL）、0.2 mmol/L dNTPs （0.5 μL）、引物各0.5 μL、0.625 U Taq 聚合酶、10 ng/μL DNA 模板1 μL、蒸餾水補(bǔ)足至25 μL，其中引物濃度對反應(yīng)結(jié)果影響較大，對引物組合濃度進(jìn)行優(yōu)化，具體見表4。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后凝膠電泳成像儀紫外照射觀察。

表4 引物濃度優(yōu)化方案

PCR 反應(yīng)條件［4］為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行分離，溴化乙錠（EB）染色后凝膠電泳成像儀紫外照射觀察。為了考察反應(yīng)條件，在最優(yōu)引物組合下使用不同的自制小兒復(fù)方雞內(nèi)金散DNA模板，在33～35 次范圍內(nèi)對PCR 循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.5 特異性試驗 按“2.1” 項下方法制備小兒復(fù)方雞內(nèi)金散及其偽品、陰性制劑各10 批，采用三重PCR 法擴(kuò)增，考察方法特異性。

2.6 靈敏度試驗 以10 倍法依次稀釋小兒復(fù)方雞內(nèi)金散及其偽品的DNA 供試品溶液，在“2.4” 項反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。

2.7 雞內(nèi)金檢測 采用三重PCR 法，對來自8 個廠家的11 批小兒復(fù)方雞內(nèi)金散進(jìn)行真?zhèn)舞b定。

3 結(jié)果

3.1 PCR 反應(yīng)條件 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系的引物濃度優(yōu)化結(jié)果見圖2，從中選擇條帶亮度均勻、非特異性條帶弱的引物組合（H） 進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)條件的優(yōu)化。

圖2 引物濃度優(yōu)化多重PCR 條帶圖

循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果見圖3。由此可知，33 次循環(huán)得到的條帶清晰，無明顯非特異性條帶產(chǎn)生，而鴨內(nèi)金替代的偽品制劑DNA 樣品在34 次循環(huán)（泳道7）、35 次循環(huán)（泳道3） 后均在約155 bp 處觀察到了非特異性擴(kuò)增條帶。

圖3 循環(huán)數(shù)優(yōu)化多重PCR 條帶圖

3.2 特異性試驗 由圖4 可知，陽性制劑經(jīng)引物擴(kuò)增后僅出現(xiàn)雞內(nèi)金清晰的單一條帶，偽品制劑出現(xiàn)相應(yīng)位置的替代品條帶，而陰性制劑沒有出現(xiàn)條帶，表明該方法特異性良好。

3.3 靈敏度試驗 由圖5 可知，在0.1 ng/μL 質(zhì)量濃度下亮度均較弱，而進(jìn)一步降低至0.01 ng/μL 時無法觀察到條帶，故三重特異性引物PCR 方法的檢測限為0.1 ng/μL。

圖5 靈敏度試驗多重PCR 條帶圖

3.4 真?zhèn)舞b定 由圖6、表5 可知，9 批樣品只檢測出家雞DNA，鑒定為正品； 另外2 批在檢測出家雞DNA 的同時還檢出麻鴨DNA，鑒定為摻偽品，檢出率為18.2%。

圖6 真?zhèn)舞b定多重PCR 條帶圖

4 討論

準(zhǔn)確鑒別動物基原是保障動物藥用藥安全與有效的先決條件，但正品與偽品形態(tài)特征相似和從業(yè)人員缺乏專業(yè)經(jīng)驗，使得性狀鑒別難以區(qū)分正、偽品。本研究鑒于雞內(nèi)金的偽品、摻偽品較多，而傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別難以發(fā)揮作用的現(xiàn)狀，對其分子鑒別方法展開研究。

以DNA 分子為目標(biāo)的方法包括常規(guī)PCR、熒光定量PCR、微滴數(shù)字PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 分析、長度多態(tài)性分析等。其中常規(guī)PCR 具有簡便、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點，更適合中藥鑒定實踐，應(yīng)用最廣泛，因此本研究基于該技術(shù)建立小兒復(fù)方雞內(nèi)金散中雞內(nèi)金的關(guān)鍵鑒定手段。

本研究基于雞內(nèi)金正品與偽品線粒體基因序列差異，分別設(shè)計特異性引物，通過多重PCR 技術(shù)鑒定小兒復(fù)方雞內(nèi)金散中雞內(nèi)金的真?zhèn)危瑑?yōu)化了PCR 方法的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，并考察了所建立方法的靈敏度和特異性，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，當(dāng)退火溫度為60 ℃，引物組合（PGD ∶PAP ∶PAA） 濃度為0.28 μmol/L ∶0.16 μmol/L ∶0.08 μmol/L，循環(huán)數(shù)為33 次時，擴(kuò)增反應(yīng)特異性良好，引物間無交叉反應(yīng)，檢測限均為0.1 ng/μL。PCR 技術(shù)在中藥鑒定中發(fā)揮著重要作用，主要難點是對炮制品、中成藥中含量較低的成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，后續(xù)可對DNA 提取方法等進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高靈敏度。

本研究所建立的鑒定技術(shù)在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，較為便捷，并從小兒復(fù)方雞內(nèi)金散中檢出了鴨內(nèi)金，取得了較好的效果。但中成藥中動物藥的種類、含量差異很大，背景干擾亦有所不同，因而PCR 反應(yīng)的體系和條件需根據(jù)具體情況作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整與優(yōu)化，以便于更好地監(jiān)控中成藥的質(zhì)量。