杭文璐，李婉君，邵 青，尹楠楠，周賢梅，趙 杰

（1.徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，徐州 江蘇 221000； 2.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，南京 江蘇 210000； 3.徐州醫(yī)科大學第一臨床學院，徐州 江蘇 221000； 4.徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院塵肺科，徐州 江蘇 221000； 5.徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，徐州 江蘇 221000）

塵肺是全球主要的職業(yè)健康危害，以肺部炎癥和彌漫性纖維化為主要病理表現(xiàn)。研究表明，30 年內塵肺的發(fā)病率增加了66%［1］，重癥患者的發(fā)病率也持續(xù)上升，預后差，治療手段極其有限［2］。鑒于塵肺患者在脫離粉塵環(huán)境后病情仍會進展，現(xiàn)有治療措施均未能顯著改善臨床結局，探索塵肺發(fā)病和病情進展的關鍵靶點及藥物療效評價是重要的研究方向。通過利用現(xiàn)代科學技術，以藥物和疾病的交互靶點為核心，在臨床應用為導向的關聯(lián)整合分析下，獲得有價值的作用靶點和機制，促進藥物及疾病的精準結合和合理應用［3］。

已有研究證實補肺活血膠囊可以改善塵肺患者的臨床癥狀［4］。該藥以黃芪、赤芍、補骨脂組方，提取補骨脂素、沒食子酸、黃芪甲苷Ⅳ等多種有效成分［5］，以益氣活血、補肺固腎為治則。本研究通過網(wǎng)絡藥理學技術探索補肺活血膠囊治療塵肺的藥效機制，并進一步根據(jù)富集分析結果驗證藥物的臨床療效，以期為中成藥制劑的臨床應用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學

1.1.1 獲取補肺活血膠囊藥物成分靶點 通過TCMSP（http： / /tcmspw.com/） 檢索“黃芪” “赤芍”，基于口服生物利用度（OB） 和類藥性（DL） 參數(shù)，篩選出OB≥30%和DL≥0.18 的藥物成分及其對應的靶點。通過文獻檢索篩查補骨脂的化學成分及藥動學參數(shù)。通過ETCM（http： / /www.tcmip.cn/ETCM/） 數(shù)據(jù)庫檢索 “黃芪”“赤芍” “補骨脂”，把藥物靶點名錄入Uniprot 數(shù)據(jù)庫（ https： / /www.uniprot.org/） 中，通 過 Retrieve/ID mapping，檢索對象設定為“homosapiens”，獲得去重后靶點的標準基因名。

1.1.2 構建藥物-疾病靶點關系網(wǎng)絡 通過GeneCards（ https： / /www.genecards.org/） 檢 索 關 鍵 詞“pneumoconiosis”，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫轉換標準基因名并去重后，與補肺活血膠囊的標準基因名通過韋恩圖匹配，獲得藥物-疾病交互基因，導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https： / /string-db.org/，Version： 11.5），對象設定為 “homo sapiens”，構建蛋白質互作網(wǎng)絡，將TSV 格式文件導入Cytoscape 3.9.1 進行網(wǎng)絡拓撲學分析，獲得度值（degree）在平均值以上的靶點信息。

1.1.3 富集分析 在微生信平臺 （ http： / /www.bioinformatics.com.cn/） 對核心靶點進行GO 和KEGG 富集分析，獲得生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）、KEGG 通路富集分析及相關通路的靶點映射。

1.2 臨床研究

1.2.1 一般資料 采用徐州礦務集團總醫(yī)院藥劑科的“智能規(guī)則引擎處方前置審核系統(tǒng)” 篩選2019 年至2022 年于塵肺科、呼吸與危重癥醫(yī)學科應用補肺活血膠囊超過12 個月的氣虛血瘀型塵肺患者及常規(guī)治療的塵肺患者。符合氣虛血瘀型塵肺者156 例，其中治療組101 例患者，對照組55 例患者。通過病歷查看、電話隨訪、面訪等方式采集患者的資料信息，其中5 例患者未提供吸煙信息，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，兩組的一般資料見表1。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（ ［2018］ 120501）。

表1 兩組患者一般資料比較（n＝156）

1.2.2 診斷標準

1.2.2.1 西醫(yī)診斷標準 依照GBZ 70-2015 《職業(yè)性塵肺病的診斷》 中塵肺患者診斷原則及分期標準［6］。

1.2.2.2 中醫(yī)診斷與辯證標準 按照國家中醫(yī)藥管理局醫(yī)政司頒布的中醫(yī)診療方案肺萎病氣虛血瘀證［7］，設定診斷標準。主癥為咳嗽、痰少，胸悶氣短，動則加重，心慌乏力； 次癥為口唇爪甲紫暗，肌膚甲錯，杵狀指； 舌脈為舌質暗或有瘀點、瘀斑，脈沉細或澀。滿足主癥中2 項及次癥中1 項或主癥中1 項及次癥中2 項內容者，結合舌脈則可診斷。

1.2.3 納入標準 ①具有明確的粉塵接觸史，并符合中西醫(yī)診斷的Ⅰ期至Ⅲ期塵肺患者； ②脫離粉塵時間超過6 個月； ③累計應用補肺活血膠囊12 個月及以上。

1.2.4 排除標準 ①妊娠期或哺乳期婦女，精神病患者；②與塵肺并發(fā)癥無關的嚴重、未控制器質性病變或感染，如失代償?shù)男摹⒎巍⒛I功能衰竭等； ③長期使用糖皮質激素或者免疫抑制劑等導致的免疫功能減退者。

1.2.5 治療手段 采用回顧性隊列研究方法。根據(jù)塵肺氣虛血瘀證的診斷標準及納入、排除標準，將患者分為西醫(yī)對照組和補肺活血膠囊聯(lián)合治療組。對照組治療遵循現(xiàn)有臨床指南和診療方案，治療包括①按需氧氣吸入； ②化痰、抗氧化藥物； ③解痙平喘藥物； ④如患者在病程中出現(xiàn)病情急性加重，合并下呼吸道感染、肺部感染等情況，根據(jù)病情給予抗感染治療； ⑤高血壓、2 型糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、前列腺增生等穩(wěn)定期基礎疾病按需治療。治療組在對照組的基礎上，聯(lián)合應用補肺活血膠囊（廣東雷允上藥業(yè)有限公司，0.35 g/粒，每次4 粒，每天3次） 累計超過12 個月。

1.2.6 補肺活血膠囊治療的中醫(yī)證候積分和療效比較 將主癥（咳嗽次數(shù)、咳嗽程度） 和次癥（憋喘、咳痰、氣短） 賦分，在入院基線期、治療后6 月、治療后12 月時根據(jù)中醫(yī)證候積分量表（表2） 對患者進行中醫(yī)癥候評價。根據(jù)治療前后患者的中醫(yī)癥狀差值與治療前的評分比進行療效評價。治療后中醫(yī)癥狀評分減少≥95% 為臨床控制，評分減少≥70%且＜95%為顯效，評分減少≥30%且＜70%為有效，評分減少＜30%為無效。

表2 中醫(yī)證候積分量表

1.2.7 補肺活血膠囊對塵肺核心靶基因的影響 采集塵肺患者清晨空腹靜脈血5 mL，采用細胞因子聯(lián)合檢測試劑盒（免疫熒光法，杭州賽基生物科技有限公司），以流式微球陣列術檢測TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

1.2.8 補肺活血膠囊對HBP 水平的影響 采集塵肺患者清晨空腹靜脈血5 mL，采用肝素結合蛋白（HBP） 測定試劑盒（中翰盛泰生物技術股份有限公司） 以免疫熒光干式定量法檢測HBP 水平。

1.2.9 安全性指標檢測 通過對比治療前后血常規(guī)、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素、直膽紅素、肌酐、尿素、凝血功能等指標，評價藥物治療安全性。

1.2.10 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s） 表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內治療前后比較采用配對樣本t檢驗； 不符合正態(tài)分布的資料以中位數(shù)（四分位數(shù)） 表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，組內治療前后比較采用Wilcoxon符號秩檢驗； 分類計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 網(wǎng)絡藥理學研究

2.1.1 補肺活血膠囊和塵肺病的靶點信息 通過TCMSP以OB≥30%且DL≥0.18 為閾值篩選出藥物潛在活性成分，得到黃芪20 個，赤芍29 個，文獻檢索補骨脂活性成分4個，具有靶點的活性化合物信息見表3。篩選得到黃芪相關靶點462 個，赤芍157 個，補骨脂39 個，匯總去重后余229 個。通過ETCM 數(shù)據(jù)庫，篩選出候選靶基因共598 個，其中黃芪272 個，赤芍105 個，補骨脂221 個，匯總刪除重復項后余324 個。合并靶基因后通過UniProt 數(shù)據(jù)庫將487個候選靶點轉為標準基因名。在Genecards 中收集到238 個疾病基因，疾病相關性排名前三位的蛋白質編碼為TNF、IL1β、IL6，將補肺活血膠囊潛在的作用靶點通過韋恩圖映射到塵肺病相關靶點中，得到共同靶點40 個，見圖1。

圖1 補肺活血膠囊活性成分靶點與塵肺病靶點韋恩圖

表3 補肺活血膠囊的活性化合物信息

2.1.2 補肺活血膠囊治療塵肺病的PPI 網(wǎng)絡構建 將靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫的multiple proteins 檢索條目，構建靶點蛋白互作（PPI） 網(wǎng)絡，見圖2。網(wǎng)絡中共包含40 個節(jié)點，414 條邊。把輸出結果tsv 文件導入Cytoscape 軟件，通過網(wǎng)絡拓撲學對作用靶點進行分析，degree 均值41.4，大于均值的靶點共24 個，均值排名前三的核心靶點為TNFα、IL-1β、IL-6。

圖2 PPI 網(wǎng)絡圖

2.1.3 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析根據(jù)補肺活血膠囊的BP、CC、MF 的前十位條目排序，見圖3A。生物過程涉及對生物刺激的細胞應答、對細胞因子的正向調節(jié)等（圖3B）； 細胞組分主要涉及細胞膜上的膜筏、膜微結構域、分泌顆粒腔等（圖3C）； 分子功能靶點涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、信號受體激活劑活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合等（圖3D）。KEGG 分析顯示，補肺活血膠囊治療塵肺病的關聯(lián)通路包括IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等，其在細胞因子-細胞因子受體相互作用中的靶點映射見圖4。

圖3 GO 富集分析

圖4 靶點在細胞因子-細胞因子受體相互作用中的映射圖

2.2 臨床研究

2.2.1 中醫(yī)證候積分和療效比較 兩組患者治療前后中醫(yī)證候積分經(jīng)雙因素重復測量方差分析結果顯示，不同時點、時點與分組的交互效應均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而不同分組之間的比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療前、治療后6 個月、治療后12 個月，治療組和對照組之間的中醫(yī)證候積分比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）； 治療后6 個月，治療組和對照組中醫(yī)證候積分低于治療前（P＜0.05）； 治療后12 個月，治療組和對照組中醫(yī)證候積分低于治療前（P＜0.05），也低于治療后6 個月（P＜0.05），治療組中醫(yī)證候積分低于對照組（P＜0.05），見表4。治療組總有效率高于對照組（P＜0.05），見表5。

表4 兩組中醫(yī)證候積分比較（分，±s）

表4 兩組中醫(yī)證候積分比較（分，±s）

注： 與同組治療前比較，*P＜0.05； 與同組治療后6 個月比較，＃P＜0.05； 與同時間點對照組比較，△P＜0.05。

組別例數(shù)/例治療前治療后6 個月治療后12 個月治療組10111.44±3.8810.27±2.86*9.26±2.40*＃△對照組5511.65±3.9111.24±3.23*10.84±3.32*＃

表5 兩組中醫(yī)證候療效比較［例（%）］

2.2.2 補肺活血膠囊對核心靶點TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影響 兩組治療前TNF-α、IL-1β、IL-6 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療組和對照組治療后TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于治療前（P＜0.05），兩組間的治療效果無顯著差異（P＞0.05），見表6。

表6 兩組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（pg/mL，±s）

注： 與同組治療前比較，*P＜0.05。

組別例數(shù)/例TNF-α IL-1β IL-6治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療組1012.23（1.17，4.41） 1.65（0.94，2.90）* 2.21（1.11，4.19） 1.56（1.04，2.16）* 5.47（3.06，10.11） 3.20（2.27，4.65）*對照組551.96（1.23，3.84） 1.40（0.94，2.33）* 2.10（1.13，4.22） 1.58（1.12，3.94） 4.47（3.10，7.83） 2.27（2.18，4.31）*

2.2.3 補肺活血膠囊對HBP 水平的影響 156 例患者的回顧性研究中，具有有效HBP 結果的共128 例，其中治療組97 例，對照組31 例。治療前兩組HBP 水平無顯著差異（P＞0.05）。治療后，治療組HBP 水平低于治療前（P＜0.05），也低于對照組（P＜0.05）。對照組治療前后HBP水平無顯著差異（P＞0.05），見表7。

表7 兩組HBP 水平比較［M （P25，P75）］

2.2.4 安全性評價 觀察兩組治療后的血常規(guī)、肝功能、腎功能和血凝變化，記錄超出正常值范圍的數(shù)量，并計算發(fā)生率，見表8。由此可知，治療期間對照組和治療組均未發(fā)生嚴重不良反應，治療組乳酸脫氫酶活性升高比例高于對照組。

表8 兩組安全性評價匯總表

3 討論

金石長期從口鼻吸入，損傷肺氣的宣發(fā)肅降，逐漸形成“正虛” “血瘀” 等病理狀態(tài)，因此，氣虛血瘀是塵肺病機的關鍵。補肺活血膠囊中黃芪補氣固表、健脾和中；赤芍清熱涼血、散瘀止痛； 補骨脂納氣平喘、補腎壯陽，體現(xiàn)中醫(yī)藥“益氣活血，補肺固腎” 的重要治則。已有多項研究證實了以上藥物成分在塵肺相關疾病中的療效，如黃芪甲苷可抑制成纖維細胞膠原的表達和向肌成纖維細胞的轉化［8］，可增強機體對缺氧和應激的抵抗力病發(fā)揮抗炎作用［9］； 赤芍能夠降低IL-6 和TNF-α 水平，通過抗氧化、抑制血栓素生成和擴張肺血管有效改善微循環(huán)［10］； 補骨脂素可抑制肌成纖維細胞活化、膠原沉積減輕肺纖維化［11］。而通過對塵肺致病靶點的深入探索，聯(lián)合中藥復方制劑發(fā)揮多靶點、多通路的協(xié)同作用，可能是塵肺病治療的新方向。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，補肺活血膠囊治療塵肺病在細胞因子的調節(jié)及細胞因子受體相互作用中發(fā)揮關鍵作用。臨床研究對塵肺患者進行治療前后中醫(yī)證候積分和療效比較，結果表明，患者在常規(guī)西藥治療的情況下，經(jīng)12 個月補肺活血膠囊聯(lián)合治療，能夠顯著改善患者的咳嗽、喘息、咳痰、氣短等癥狀，但低于6 個月治療周期的效果并不顯著。因此，在中醫(yī)辨證論治的基礎上，長療程補肺活血膠囊治療協(xié)同西藥對氣虛血瘀型塵肺患者具有良好的治療效果，可有效改善患者的臨床癥狀。網(wǎng)絡藥理學結果表明，補肺活血膠囊治療塵肺的核心靶點為TNF、IL-1β、IL-6 等促炎、促肺纖維化細胞因子。TNF-α 具有多種生物活性，高表達的TNF-α 可刺激成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白，導致纖維化和矽塵結節(jié)形成［12］。IL-1β 可增強炎癥微環(huán)境包圍沉積的粉塵晶體，驅動肺部炎癥和相關病理［13］。粉塵暴露可作用于肺泡巨噬細胞，被模式識別受體識別激活含NLR 家族Pyrin 域蛋白3 （NLRP3），引起IL-1β 的釋放［14］，增加肺力學參數(shù)，誘導彌漫性肺實質炎癥，增加中性粒細胞浸潤及膠原沉積［15］。IL-6 免疫過程和炎癥趨化方面發(fā)揮重要作用，其過度表達可以降低肺彈性，導致細胞外基質和肌成纖維細胞積聚［16］，并與塵肺患者的生命狀態(tài)相關［17］。本研究選用TNF-α、IL-1β、IL-6 作為評價塵肺治療效果的主要療效指標，結果表明，塵肺患者聯(lián)合補肺活血膠囊口服可降低TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，其中IL-1β的下降程度優(yōu)于常規(guī)治療，或可延緩長期粉塵吸入引起的肺部炎癥及肺纖維化進展。

HBP 是一種多功能蛋白，可誘導血管滲漏，增加通透性，引起水腫，并具有促炎作用［18］，此外，還可增加M1巨噬細胞的浸潤和促進炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的分泌［19］。本研究采用HBP 作為次要療效指標，結果表明，補肺活血膠囊可降低HBP 水平，可能在調節(jié)塵肺引起的感染、炎癥反應及疾病進展方面具有一定價值。

補肺活血膠囊的安全性評價表明，用藥后個別患者可出現(xiàn)血常規(guī)、肝功能、腎功能、血凝異常，乳酸脫氫酶升高例數(shù)高于對照組，其余指標變化考慮與疾病正常進展及基礎疾病、高齡等因素相關。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶有助于了解塵肺的疾病進展［20］，總乳酸脫氫酶活性和乳酸脫氫酶比率（血漿/細胞） 是SiO2粉塵暴露誘導毒性的標志物［21］。因此，在用藥過程中，需監(jiān)測患者乳酸脫氫酶的變化情況，評估藥物療效及安全性。

綜上所述，補肺活血膠囊可通過多靶點多通路干預塵肺病，緩解機體的炎癥反應。本研究闡述了補肺活血膠囊治療塵肺病的關鍵成分及作用靶點，并通過臨床應用驗證了網(wǎng)絡藥理學的預測結果，為中醫(yī)藥治療塵肺病提供了一定思路和方向。