李艷霞，李益萍，王肖龍

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病共同的病理學基礎，我國心腦血管疾病患病率及死亡率仍處于上升階段，心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，占居民疾病死亡構成的40%以上［1］。盡管人們一直在努力改善動脈粥樣硬化的臨床治療，但對其治療的巨大需求仍未得到滿足。無論遵循何種治療方案，20%的患者在首次臨床表現(xiàn)出現(xiàn)后的三年內都會出現(xiàn)復發(fā)性心肌梗死［2］。研究表明，中醫(yī)藥具有一定的抗動脈粥樣硬化作用，并因其作用靶點多、不良反應少等優(yōu)點已成為研究熱點［3-4］。

盾葉冠心寧片為薯蕷根莖提取制成的膏片，具有活血化瘀、行氣止痛、養(yǎng)血安神的功效。臨床研究表明盾葉冠心寧片治療動脈粥樣硬化效果顯著，可改善臨床心絞痛、急性缺血性腦卒中癥狀，還具有調節(jié)血脂異常及降低同型半胱氨酸水平的作用［5］。近期發(fā)現(xiàn)，多種非編碼RNA，如微小RNA （microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 在動脈粥樣硬化病理生理過程中起到重要的調節(jié)作用，可影響細胞的活化、增殖、脂質代謝和炎性因子分泌等。隨著高通量測序技術的發(fā)展，其已經成為疾病發(fā)生發(fā)展機制研究常用技術手段之一。利用其信息量大、指標客觀而又層次深、同時具有網絡關聯(lián)性的特點，可以從多角度深入挖掘盾葉冠心寧片抗動脈粥樣硬化的本質。本研究觀察盾葉冠心寧片對抗動脈粥樣硬化的作用，同時利用高通量全基因轉錄組測序數(shù)據(jù)構建lncRNA-miRNA-mRNA 共表達網絡，并篩選其中的關鍵通路。

1 材料與方法

1.1 盾葉冠心寧片抗ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的作用

1.1.1 動物 40 只8 周齡SPF 級ApoE-/-雄性小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2016-0011］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，環(huán)境干燥、通風，溫度20 ～26 ℃，相對濕度40% ～70%，自由獲取水和食物。所有動物實驗經上海中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員會批準 （倫理號PZSHUTCM18113010），并嚴格遵守動物護理和使用指南。

1.1.2 高脂飼料配方 高脂飼料由78.8%繁殖鼠料、10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇、0.2%膽鹽組成，購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司［生產許可證號蘇飼證（2014） 01008］。

1.1.3 試劑與藥物 蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE） 染色劑購自南京建成生物工程研究所； 油紅O 購自美國Sigma 公司； 馬松（Masson） 染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司； 異丙醇購自國藥集團化學試劑有限公司。瑞舒伐他汀鈣片［可定，阿斯利康藥業(yè)（中國） 有限公司，規(guī)格10 mg/片，國藥準字H20160547］； 盾葉冠心寧片（江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z32020309，0.16 g/片）。

1.1.4 分組、造模及給藥 將40 只ApoE-/-雄性小鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、模型組、可定組、盾葉組。空白組予以基礎飼料，其余各組予以高脂飼料，造模的同時可定組、盾葉組按人-動物藥物劑量換算表分別灌胃給予相應可定片0.76 mg/kg、盾葉冠心寧片146 mg/kg，空白組、模型組分別灌胃給予等量蒸餾水。

1.1.5 標本采集及檢測 連續(xù)喂養(yǎng)12 周后取材，各組小鼠禁食不禁水12 h。眼底靜脈叢取血，靜置2 h 以上，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠脫頸椎處死后固定，剪開腹腔，移除腹腔內臟器，暴露腹主動脈，再剪開胸腔，暴露整個腹腔與胸腔，沿著腹主動脈向上分離直至心臟，向下分離直至髂總動脈分叉處，保留主動脈及心臟。每組取10 只小鼠心臟用OCT 包埋，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。將主動脈經石蠟包埋切片后按試劑盒說明書分別進行HE 染色、油紅O 染色、Masson 染色，于光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件分析HE 染色病變面積與整個管腔面積的比值； 油紅O 染色著色區(qū)的病變面積占比； Masson染色膠原纖維面積占比。

1.2 生物信息分析 對空白組、模型組、盾葉組小鼠主動脈組織樣本進行高通量測序，數(shù)據(jù)包含各個樣本的lncRNA、mRNA、miRNA 測序結果。數(shù)據(jù)經過Illumina CASAVA Version 2.20 軟件［6］、Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcript Version 0.1.6 軟件［7］、cufflinks Version 2.2.1 軟件［8］處理后，用Cuffcompare 和已知的基因模型進行比較，得到每個樣本中編碼基因的表達。

1.2.1 差異表達RNAs 的篩選 采用R3.4.1 中的limma（Version 3.32.5）［9］篩選每個組間差異表達RNAs，設定為FDR 值＜0.05 且|log2FC|＞1，對篩選出的組間差異表達RNAs 進行基于DAVID6.8 在線分析工具的GO 生物學過程和KEGG 通路的富集分析，篩選的標準為P＜0.05。

1.2.2 構建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 調控網絡 首先用miRanda 本地化工具［10］對lncRNA-miRNA 的結合關系進行預測，miRanda 比對參數(shù)設置為Gap Open Penalty ＝-8，Gap Extend＝-2，Score Threshold ＝80%，Energy Threshold ＝-20，同時計算目標lncRNA-miRNA 表達相關性系數(shù)，并只保留呈負相關的作用對，以此構建lncRNA-miRNA 網絡，然后再利用starBase Version 2.0 數(shù)據(jù)庫［11］對目標miRNAs所調控的靶基因進行搜索同時計算目標miRNA-mRNA 表達相關性系數(shù)，并只保留負相關的作用對，構建miRNAmRNA 調控關系連接，最后采用R3.4.1 語言中的cor.test函數(shù)計算lncRNA-mRNA 之間的皮爾森相關系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC），保留高于0.9 的作用對，構建lncRNA-mRNA 網絡。對上述lncRNA-miRNA、miRNAmRNA、lncRNA-mRNA 連接關系進行綜合整理，最終構建lncRNA-miRNA-mRNA 調控網絡，并對其進行GO 生物學過程和KEGG 通路的富集分析。

1.2.3 WGCNA 及STEM 分析重疊基因 首先運用WGCNA分析得到與疾病狀態(tài)顯著相關模塊所包含的RNAs 其次利用STEM 分析，得到顯著的表達模式變化聚類包含的RNAs，最后將上述2 種分析方法得到的重疊RNAs 進行GO生物學過程和KEGG 通路富集分析。

權重基因共表達網絡分析方法 （weighed gene coexpression network analysis，WGCNA） 是一種構建基因共表達網絡的典型系統(tǒng)生物學算法。為了符合無尺度網絡分布，首先需要確定加權系數(shù)power，即R2≥0.8 時的加權系數(shù)。利用R3.4.1 中的WGCNA 包Version 1.61［12］對目標RNAs并集集合進行分析，得到與疾病狀態(tài)顯著相關的模塊及其中包含的RNAs。

利用STEM［13］軟件對空白組、模型組、盾葉組表達模式顯著相似性聚類。以相似性閾值0.8，顯著性閾值P＜0.05，篩選得到集合中包含的RNAs。最后對2 種方法篩選出來的重疊基因進行GO 生物學過程和KEGG 通路的富集分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，計量資料符合正態(tài)分布的以（±s） 表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 盾葉冠心寧片對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠主動脈竇病理學的影響 HE 染色顯示，與空白組比較，模型組主動脈竇處的病變面積增加（P＜0.05），提示造模成功； 與模型組比較，可定組、盾葉組主動脈竇處的病變面積減少（P＜0.05），但盾葉組抗主動脈竇斑塊面積效果不如可定組（P＜0.05），見圖1。

油紅O 染色顯示，空白組主動脈竇處僅見少量脂質蓄積； 與空白組比較，模型組主動脈竇處的脂質蓄積增加（P＜0.05）； 與模型組比較，可定組、盾葉組主動脈竇處的脂質蓄積減少，油紅O 染色面積降低（P＜0.05），盾葉組與可定組無差異（P＞0.05），見圖1。

膠原纖維的水平與斑塊的穩(wěn)定性密切相關。Masson 染色顯示，與空白組比較，模型組主動脈竇斑塊內膠原纖維減少（P＜0.05）； 與模型組比較，盾葉組主動脈竇斑塊內膠原纖維增加（P＜0.05），見圖1。

2.2 差異表達RNAs 通過高通量測序對9 例ApoE-/-小鼠主動脈組織樣本的進行測序。得到363 個miRNAs、15 513個lncRNAs 和11 162 個mRNAs。經比對共發(fā)現(xiàn)1 623 個顯著差異表達基因，其中與空白組比較，模型組共有602 個RNAs 表達下調，593 個RNAs 表達上調，總計1 195 個差異基因，分別為441 個lncRNAs、33 個miRNAs、721 個mRNAs。與模型組比較，盾葉組共有131 個RNAs 表達下調，391 個RNAs 表達上調，總計522 個差異基因，分別為275 個lncRNAs、3 個miRNAs、244 個mRNAs，見表1～2。

表1 差異表達RNAs 個數(shù)統(tǒng)計（個）

表2 差異表達RNAs 類型個數(shù)統(tǒng)計（個）

為驗證差異表達結果的準確性，將全部1 623 個差異基因的表達進行聚類分析，結果顯示不同組別的樣本能完全區(qū)分開，見圖2A。對組間差異表達的RNAs 進行GO 功能和KEGG 分析，可知模型組與空白組顯著差異表達基因可富集到脂肪酸代謝（P＜0.001）、有機酸合成（P＜0.001）、PPAR 信號通路（P＜0.001） 等信號通路； 盾葉組與模型組顯著差異表達基因可富集到與細胞外基質組織 （P＜0.001）、細胞骨架組織（P＜0.001）、血管平滑肌收縮（P＜0.001）、心律失常性右心室心肌病通路（P＜0.001） 等信號通路，見圖2B。

2.3 構建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 調控網絡 通過miRanda 本地化工具、starBase 資源及cor.test 函數(shù)計算對lncRNA、miRNA 和mRNA 之間的關系進行預測，共篩選得到96 對lncRNA-miRNA 連接、88 對miRNA-mRNA 連接、1 304對lncRNA-mRNA 連接，對連接關系進行整理并構建成共表達網絡，見圖3A。通過GO 功能和KEGG 分析可知，共表達部分可分別富集到轉錄調控（P＜0.001）、RNA 代謝過程的正調控（P＜0.001）、心律失常性右心室心肌病通路（P＜0.001） 等信號通路，見圖3B。

2.4 WGCNA 及STEM 分析重疊基因 首先運用WGCNA 分析，為使網絡接近無尺度分布，計算參數(shù)power 取值為1～30R2。如果模型R2越接近1，則模型越符合無尺度分布，一般情況下應R2≥0.8，本研究以0.9 為標準。當power＝24 時R2首次達到0.9，見圖4A。剪枝高度設定為cutHeight ＝0.995，共篩選得到9 個相關模塊，見圖4B。計算每個模塊與不同狀態(tài)的關聯(lián)性，共發(fā)現(xiàn)了4 個與樣本狀態(tài)顯著正相關的模塊，分別為green、blue、pink 和red，見圖4C，其中green 包含124 個RNAs，blue 包含138 個RNAs，pink 包含93 個RNAs，red 包含123 個RNAs，總計478 個RNAs。

圖4 WGCNA 分析圖

其次利用STEM 對之前的1 623 個并集RNAs 進行表達變化趨勢聚類，共得到了2 個顯著的表達模式變化聚類，Cluster 1、2 分別包含了496、341 個RNAs （圖5）。

圖5 STEM 表達譜分析聚類圖

最后比較WGCNA 算法獲得的478 個RNAs 和STEM 分析中cluster 1、2 中包含的RNAs，分別有36、120 個重疊RNAs，見圖6A。通過GO 功能和KEGG 分析可知，以上重疊RNAs 可分別富集到PPAR 信號通路（P＜0.001），脂質生物合成過程（P＜0.001），脂肪酸代謝過程（P＜0.001）等信號通路，見圖6B。

圖6 重復基因韋恩圖（A） 及富集分析（B） 圖

3 討論

心腦血管疾病是人類首要致死因素，動脈粥樣硬化是其主要病理基礎［14］。中醫(yī)學中并沒有動脈粥樣硬化病名，而是根據(jù)其臨床癥狀將該病歸屬于“頭痛” “眩暈” “中風” “胸痹” 等范疇。中醫(yī)學認為本病的病機為本虛標實，氣血陰陽虧虛為本，氣滯、血瘀、痰濕為標。盾葉薯蕷俗稱黃姜，以根狀莖入藥，其性味甘、苦、涼，具有清肺止咳、利濕通淋、解毒消腫和通經絡等功效。盾葉冠心寧片的主要成分為盾葉薯蕷，具有活血化瘀、行氣止痛、養(yǎng)血安神的功效。臨床研究也表明盾葉冠心寧片治療動脈粥樣硬化效果顯著，可減少臨床心腦血管疾病發(fā)作數(shù)、調節(jié)血脂、降低同型半胱氨酸水平，但作用機制不明［15-17］。

載脂蛋白E （ApoE） 基因敲除小鼠因缺乏清除血漿中膽固醇的殘粒的能力，所以可以在短期內通過高脂飼料喂養(yǎng)形成動脈粥樣硬化模型［18］。本研究中為了探究盾葉冠心寧片抗動脈粥樣硬化的機制，采用ApoE-/-小鼠作為模型，觀察盾葉冠心寧片對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠的作用，同時構建lncRNA-miRNA-mRNA 共表達網絡并篩選其中的關鍵通路來探究其作用機制。病理結果表明，與模型組比較，盾葉組小鼠主動脈竇處粥樣斑塊面積減小，提示盾葉冠心寧片可減少小鼠主動脈壁內的斑塊形成。據(jù)目前研究認為，減少斑塊脂質核心的大小是穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的主要策略之一［19］。根據(jù)Masson 染色結果顯示，與模型組比較，盾葉組小鼠斑塊中膠原纖維水平增加，提示盾葉冠心寧片可增強斑塊穩(wěn)定性。本實驗結果表明，盾葉冠心寧片具有減少動脈粥樣硬化斑塊形成的同時穩(wěn)定斑塊的作用。

研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 和lncRNAs 在動脈粥樣硬化的發(fā)病和發(fā)展中扮演重要角色。miRNAs 已經成為一些生理和病理生理過程的關鍵調節(jié)者，包括膽固醇外流、脂質代謝、平滑肌增殖、炎癥反應。lncRNAs 被認為是一組新的表觀遺傳調控因子，調節(jié)巨噬細胞、脂質代謝、炎癥和免疫反應［20］。本研究在既往研究基礎上，通過構建lncRNAmiRNA-mRNA 調控網絡對盾葉冠心寧片抗動脈粥樣硬化的發(fā)病機制進行研究。動脈粥樣硬化是一種脂蛋白驅動的疾病，脂質代謝障礙為其的病變基礎。本研究發(fā)現(xiàn)，盾葉冠心寧片抗動脈粥樣硬化的機制可能主要與脂質代謝有關，如脂肪酸代謝、脂質代謝過程、脂類生物合成、PPAR 信號通路。PPAR 信號通路參與膽固醇逆轉運，可有效促進細胞排出過量的脂質，是正常機體維持脂代謝平衡的重要通路之一［21］，本研究結果與之一致。

綜上所述，本研究中構建的盾葉冠心寧片抗動脈粥樣硬化相關的lncRNA-miRNA-mRNA 共表達網絡為后續(xù)更深入研究動脈粥樣硬化的關鍵基因及基因間的調控關系提供了參考和方向。然而本研究未對網絡中的調控關系進行驗證，將在后續(xù)研究中進一步分析并予以證實。