周喜燕，馬曉維，李 彬，張?chǎng)析?，?聯(lián)，于 淼，王 群

［青島市中醫(yī)醫(yī)院（市海慈醫(yī)院） 神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266033］

帕金森病又稱震顫麻痹，是第二常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于中老年人［1］。帕金森病臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵硬、平衡障礙和姿勢(shì)不穩(wěn)； 非運(yùn)動(dòng)癥狀包括嗅覺(jué)功能障礙、疼痛、疲勞、睡眠障礙、自主神經(jīng)功能障礙和認(rèn)知功能障礙等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［2］。大量證據(jù)表明，中腦黑質(zhì)部位發(fā)生多巴胺能神經(jīng)元凋亡是帕金森病的主要病因和癥結(jié)［3］。因此，探索帕金森病發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療策略已迫在眉睫。

獐牙菜苦苷是一種從龍膽科藥用植物中分離出的裂環(huán)烯醚萜苷［4］，可預(yù)防多種炎癥相關(guān)疾病。研究報(bào)道，獐牙菜苦苷可通過(guò)增強(qiáng)α-synuclein 抑制基因和MAPK 通路激活SKN-1/NRF-2 抑制帕金森病相關(guān)神經(jīng)毒性［5］。但獐牙菜苦苷治療帕金森病的藥理分子機(jī)制尚不清楚。微小RNA（microRNA） 是一類長(zhǎng)度僅為18～25 bp 的非編碼RNA，研究表明，miR-351-5p 可通過(guò)靶向MAPK13 和sirtuin-6 促進(jìn)腸黏膜氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡，從而加重腸缺血/再灌注損傷［6］。在脂多糖（LPS） 誘導(dǎo)的急性肺損傷中，miR-351-5p表達(dá)升高，抑制miR-351-5p表達(dá)可減輕肺氧化應(yīng)激和炎癥，過(guò)表達(dá)miR-351-5p則相反［7］。然而，miR-351-5p在帕金森病中的作用尚未可知。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究獐牙菜苦苷對(duì)6-羥基多巴（6-OHDA） 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響，探究其對(duì)miR-351-5p 的調(diào)控作用，為帕金森病的治療提供新方向。

1 材料

PC12 細(xì)胞購(gòu)自無(wú)錫欣潤(rùn)生物科技有限公司。獐牙菜苦苷（純度＞98%，貨號(hào)110785-201904，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。6-OHDA （美國(guó)Sigma 公司）； 胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）； MTT 試劑盒（上海美軒生物科技有限公司）； LDH、SOD 和MDA 檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）； Annexin V-FITC / PI 法試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司）； RIPA 蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA） 試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒 （日本TaKaRa 公司）； Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑 （ 美國(guó)Invitrogen 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞分組與處理 以含100 μmol/L 6-OHDA 的細(xì)胞培養(yǎng)液處理PC12 細(xì)胞24 h，記為6-OHDA 組［8］； 未經(jīng)6-OHDA 處理的記為對(duì)照組； 用30、60、120 μmol/L 獐牙菜苦苷［9］處理PC12 細(xì)胞24 h，再經(jīng)6-OHDA 處理，分別記為獐牙菜苦苷低、中、高劑量組； 分別將anti-miR-NC、antimiR-351-5p 轉(zhuǎn)染至PC12 細(xì)胞，再經(jīng)6-OHDA 處理，記為anti-miR-NC 組、anti-miR-351-5p 組； 分別將miR-NC、miR-351-5p 轉(zhuǎn)染至PC12 細(xì)胞，再經(jīng)120 μmol/L 獐牙菜苦苷和6-OHDA 處理，記為獐牙菜苦苷+miR-NC 組、獐牙菜苦苷+miR-351-5p 組。各組轉(zhuǎn)染操作按照Lipofectamine2000 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將各組PC12 細(xì)胞以2×105/mL 密度接種于96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD） 值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為細(xì)胞存活率＝ （OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組） ×100%。

2.3 LDH、SOD 活性和MDA 水平檢測(cè) 取各組PC12 細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，離心后收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)LDH、SOD 活性和MDA 水平。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 按照Annexin VFITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)PC12 細(xì)胞凋亡，收集各組細(xì)胞并用PBS 漂洗，0.25%胰蛋白酶消化液消化，用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 漂洗2 次，離心后收集細(xì)胞，195 μL 結(jié)合緩沖液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶（PI），37 ℃孵育15 min 后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá) 收集各組PC12 細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液200 μL，于冰上裂解，離心收集上清蛋白樣品，采用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將Loading buffer 與蛋白樣品充分混勻，沸水浴加熱5 min致蛋白變性。取60 μg 變性蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，而后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入Bcl-2、Bax 一抗（1 ∶1 000） 4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 洗滌3次，加入二抗（1 ∶2 000） 室溫孵育2 h，PBS 洗滌3 次，滴加ECL 顯色液，暗室中曝光顯影，定影，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達(dá)量以其與內(nèi)參的灰度值比值表示。

2.6 RT-qPCR 法檢測(cè)miR-351-5p表達(dá) 采用TRIzol 試劑提取各組PC12 細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6 為內(nèi)參，用cDNA 作為模板進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-351-5p相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞存活率的影響 如表1 所示，與對(duì)照組比較，6-OHDA 組PC12 細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細(xì)胞存活率升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表1 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝9）

表1 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝9）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別存活率/%對(duì)照組100.00±0.00 6-OHDA 組42.04±3.29*獐牙菜苦苷低劑量組54.67±4.06＃獐牙菜苦苷中劑量組67.72±5.51＃獐牙菜苦苷高劑量組79.72±5.50＃

3.2 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 如表2 所示，與對(duì)照組比較，6-OHDA 組PC12 細(xì)胞LDH 活性和MDA 水平升高 （P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細(xì)胞LDH 活性和MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表2 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（±s，n＝9）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別LDH/（U·L-1） SOD/（U·mg-1）MDA/（nmol·mg-1）對(duì)照組24.57±2.3491.45±8.094.06±0.33 6-OHDA 組80.66±7.48* 32.57±3.17* 32.57±3.18*獐牙菜苦苷低劑量組 65.38±5.08＃49.03±4.12＃ 24.33±2.28＃獐牙菜苦苷中劑量組 50.02±4.86＃64.72±5.46＃ 16.21±1.34＃獐牙菜苦苷高劑量組 33.94±3.14＃83.68±6.05＃ 7.74±0.68＃

3.3 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響如圖1、表3 所示，與對(duì)照組比較，6-OHDA 組PC12 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖1 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響

表3 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝9）

表3 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝9）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別凋亡率/%Bcl-2 蛋白Bax 蛋白對(duì)照組5.43±0.470.63±0.050.23±0.02 6-OHDA 組32.72±2.96*0.14±0.02* 0.74±0.06*獐牙菜苦苷低劑量組 23.91±2.05＃0.26±0.02＃0.60±0.05＃獐牙菜苦苷中劑量組 15.96±1.23＃0.39±0.03＃0.46±0.04＃獐牙菜苦苷高劑量組 8.96±0.68＃0.54±0.04＃0.31±0.03＃

3.4 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞miR-351-5p表達(dá)的影響 如表4 所示，與對(duì)照組比較，6-OHDA 組PC12細(xì)胞miR-351-5p表達(dá)升高（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細(xì)胞miR-351-5p表達(dá)降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表4 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞miR-351-5p表達(dá)的影響（±s，n＝9）

表4 獐牙菜苦苷對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞miR-351-5p表達(dá)的影響（±s，n＝9）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別miR-351-5p對(duì)照組1.00±0.00 6-OHDA 組3.49±0.28*獐牙菜苦苷低劑量組2.55±0.22＃獐牙菜苦苷中劑量組1.92±0.18＃獐牙菜苦苷高劑量組1.31±0.12＃

3.5 干擾miR-351-5p表達(dá)對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響 如圖2、表5 所示，與anti-miR-NC 組比較，antimiR-351-5p 組PC12 細(xì)胞miR-351-5p表達(dá)降低（P＜0.05），存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），LDH活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖2 干擾miR-351-5p 表達(dá)對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響

表5 干擾miR-351-5p 表達(dá)對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響（±s，n＝9）

表5 干擾miR-351-5p 表達(dá)對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響（±s，n＝9）

注： 與anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05。

組別miR-351-5p存活率/%LDH/（U·L-1） SOD/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1）凋亡率/%Bcl-2 蛋白Bax 蛋白anti-miR-NC 組1.00±0.0040.05±4.0885.16±7.4331.17±3.1133.57±3.1733.19±2.380.13±0.020.77±0.05 anti-miR-351-5p 組0.38±0.03* 70.01±5.59* 40.96±4.02* 74.47±6.56*13.13±1.04*14.04±1.16* 0.46±0.04*0.37±0.03*

3.6 上調(diào)miR-351-5p表達(dá)對(duì)獐牙菜苦苷干預(yù)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響 如圖3、表6 所示，與6-OHDA+獐牙菜苦苷+miR-NC 組比較，6-OHDA+獐牙菜苦苷+miR-351-5p 組PC12 細(xì)胞中miR-351-5p 表達(dá)升高（P＜0.05），細(xì)胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），LDH活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖3 上調(diào)miR-351-5p 表達(dá)對(duì)獐牙菜苦苷干預(yù)6-OHDA誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響

表6 上調(diào)miR-351-5p 表達(dá)對(duì)獐牙菜苦苷干預(yù)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響（±s，n＝9）

表6 上調(diào)miR-351-5p 表達(dá)對(duì)獐牙菜苦苷干預(yù)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響（±s，n＝9）

注： 與獐牙菜苦苷+miR-NC 組比較，*P＜0.05。

組別miR-351-5p存活率/% LDH/（U·L-1） SOD/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1） 凋亡率/%Bcl-2 蛋白Bax 蛋白獐牙菜苦苷+miR-NC 組1.00±0.00 81.48±6.41 31.68±3.0284.28±6.787.27±0.678.27±0.620.56±0.050.30±0.03獐牙菜苦苷+miR-351-5p 組 2.78±0.24* 51.06±4.23* 70.97±5.77* 45.23±4.09*23.16±2.26*21.75±2.13* 0.25±0.03*0.63±0.05*

4 討論

為研究帕金森病細(xì)胞損傷分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用100 μmol/L 6-OHDA 處理PC12 細(xì)胞24 h，構(gòu)建PC12 細(xì)胞損傷模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，6-OHDA 組PC12 細(xì)胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，LDH 活性、MDA水平、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)升高，提示6-OHDA 可誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

傳統(tǒng)療法和草藥療法由于其副作用較低或無(wú)副作用的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越得到重視。獐牙菜苦苷是龍膽科植物的主要生物活性成分，具有抗菌、抗炎、抗糖尿病等多種藥理作用。獐牙菜苦苷可通過(guò)降低腎細(xì)胞中阿格嘧啶、氧化應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化水平來(lái)預(yù)防甲基乙二醛介導(dǎo)的糖尿病發(fā)病機(jī)制［10］。獐牙菜苦苷可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量、葡萄糖不耐受、氧化應(yīng)激和胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素信號(hào)，預(yù)防肥胖相關(guān)的慢性炎癥［11］。獐牙菜苦苷可改善香煙煙霧誘導(dǎo)的前列腺膠原沉積，減輕氧化應(yīng)激和局部炎癥，抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的前列腺纖維化［12］。獐牙菜苦苷可通過(guò)TLR4/PARP1/NF-κB 途徑減弱ROS 水平，抑制細(xì)胞凋亡，緩解氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y損傷［13］。獐牙菜苦苷可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)緩解四氯化碳引起的肝損傷［14］。與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷以劑量依賴方式升高PC12 細(xì)胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達(dá)，降低LDH 活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)，提示獐牙菜苦苷可緩解6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，microRNA 的異常表達(dá)與帕金森病發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。在1-甲基-4-苯基吡啶 （MPP） 處理的SHSY5Y 細(xì)胞中，miR-29c-3p 表達(dá)下調(diào)，miR-29c-3p 可通過(guò)下調(diào)TET2 表達(dá)抑制SH-SY5Y 細(xì)胞自噬過(guò)程［15］。在帕金森病細(xì)胞模型中，miR-133b 表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-133b 可抑制MPP 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡［16］。在MPP 處理的SH-SY5Y細(xì)胞中miR-497-5p 表達(dá)升高，下調(diào)miR-497-5p 可抑制MPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡［17］。抑制miR-6862 表達(dá)可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受MPP 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［18］。miR-421k 可通過(guò)直接靶向MEF2D 加重帕金森病模型神經(jīng)毒性并促進(jìn)細(xì)胞死亡［19］。與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，6-OHDA 組miR-351-5p表達(dá)升高，干擾miR-351-5p表達(dá)升高了PC12 細(xì)胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達(dá)，降低了LDH 活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)，提示干擾miR-351-5p表達(dá)可抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

研究表明，天然藥物提取物可通過(guò)調(diào)控microRNA 表達(dá)緩解帕金森病細(xì)胞損傷。如蝦青素可通過(guò)靶向miR-7/SNCA軸抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并保護(hù)帕金森病引起的神經(jīng)元損傷［20］。迷迭香酸可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155-5p 減輕帕金森病小鼠模型中炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激，上調(diào)miR-155-5p 可抑制迷迭香酸對(duì)帕金森病小鼠運(yùn)動(dòng)障礙的緩解作用［21］。與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，獐牙菜苦苷以劑量依賴方式降低6-OHDA 組miR-351-5p表達(dá)，上調(diào)miR-351-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了獐牙菜苦苷處理對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的作用，使PC12 細(xì)胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，LDH活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)升高，提示獐牙菜苦苷可通過(guò)調(diào)控miR-351-5p表達(dá)影響6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷。

綜上所述，miR-351-5p表達(dá)在6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷中上調(diào)，獐牙菜苦苷可通過(guò)下調(diào)miR-351-5p表達(dá)抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激，為獐牙菜苦苷治療帕金森病提供新思路。