謝建寰，李冬春，劉春鳳，肖小斌

（1.江西省贛州市中醫(yī)院，江西 贛州 341000； 2.江西省井岡山市笫二人民醫(yī)院，江西 井岡山 343600）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 指的是由酒精及已知的能夠?qū)е赂螕p傷的確定因子之外的其他因子引起的臨床綜合病癥。NAFLD 是一種分布范圍較為廣泛的慢性疾病，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化，甚至可能發(fā)展為肝癌，對(duì)人類生命健康造成了極大的困擾［1-2］。NAFLD 發(fā)病率較高，全球發(fā)病人口占總?cè)丝诘?5%［3-4］。其發(fā)病機(jī)制涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等，較為復(fù)雜，目前臨床對(duì)于NAFLD 患者的治療大多只能從生活方式進(jìn)行干預(yù)，而缺乏有效治療藥物，由此可見，研究NAFLD 的有效治療方案或藥物是當(dāng)今時(shí)代的迫切要求。人參皂苷Rg1 為五加科植物人參以及三七中的有效活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用廣泛，具有抗炎癥、抗纖維化、保護(hù)神經(jīng)、抗腫瘤、保護(hù)心血管等作用［5-7］。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1 對(duì)脂肪肝內(nèi)的脂肪堆積具有明顯的改善作用［8］。本研究主要探究人參皂苷Rg1 對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠的干預(yù)作用，并從肝細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、炎癥反應(yīng)3 個(gè)方面對(duì)其作用機(jī)制作進(jìn)一步分析。

1 材料

1.1 動(dòng)物 102 只SPF 級(jí)健康成年雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （川） 2015-030，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （川） 2014-189］，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后用于實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.2 藥物與試劑 人參皂苷Rg1 （貨號(hào)G909436，純度≥98%，上海麥克林生化科技股份有限公司）。普通飼料（貨號(hào)CS-102，遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司）； 二甲雙胍（批號(hào)wkq-02823，四川省維克奇生物科技有限公司）； 高脂飼料（83%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油+5%蔗糖，貨號(hào)XTHF60，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司）； 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細(xì)胞介素-6 （IL-6）、白細(xì)胞介素-1β （IL-1β） 檢測試劑盒 （貨號(hào)H052、H007、H002，南京建成生物工程研究所）； 兔源CAT1、CoASH1、ACOX1、Bcl-2、Bax、caspase-3、β-actin 一抗、山羊抗兔lgG 二抗（貨號(hào)ab37588、ab129012、ab184032、ab182858、ab32503、ab32351、ab8226、ab205718，英國Abcam 公司）。

2 方法

2.1 造模與分組 102 只大鼠隨機(jī)分為5 組，分別為正常組、模型組、二甲雙胍組（陽性對(duì)照） 及人參皂苷低、高劑量組，正常組和模型組每組21 只，其余組每組20 只。正常組給予普通飼料，其余組大鼠均給予高脂飼料，共喂養(yǎng)12 周。于12 周末，正常組和模型組分別隨機(jī)選1 只大鼠，取肝臟進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE） 染色，觀察是否造模成功，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠肝組織有大量脂肪空泡。造模成功后給藥干預(yù)，正常組和模型組灌胃給予20 mL/kg 生理鹽水，人參皂苷低、高劑量組灌胃給予20、40 mg/kg 人參皂苷Rg1［9］，二甲雙胍組灌胃給予20 mg/kg 二甲雙胍，連續(xù)8 周。

2.2 樣本采集 給藥結(jié)束后，大鼠禁食12 h，經(jīng)水合氯醛麻醉，心臟取血，處死后取肝臟。全血3 000 r/min 離心15 min，取上層血清，將血清及肝臟置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠血清肝功能、脂質(zhì)及炎癥因子水平檢測 取大鼠血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血清肝功能指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT） 水平，以及血脂指標(biāo)甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C） 水平。采用酶聯(lián)免疫試劑盒，按照說明書要求檢測大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

2.4 大鼠肝組織細(xì)胞凋亡、脂肪酸β 氧化相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 取大鼠部分肝組織，根據(jù)BCA 蛋白試劑盒說明書提取總蛋白。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉溶液在室溫下封閉1 h，洗膜后加入 Bcl-2、Bax、caspase-3、CAT1、CoASH1、ACOX1、β-actin 一抗（1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗lgG （1 ∶5 000） 室溫孵育1 h，曝光顯影，根據(jù)目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 大鼠肝組織病理及細(xì)胞凋亡檢測 取大鼠肝組織，用10%甲醛進(jìn)行固定3 d，石蠟包埋，常規(guī)切片（5 μm），脫蠟水化后分別進(jìn)行HE、TUNEL 染色，顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)及細(xì)胞凋亡情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠血清肝功能的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT 水平均升高（P＜0.05）； 與模型組比較，人參皂苷Rg1 各劑量組和二甲雙胍組大鼠血清AST、ALT 水平均降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清AST、ALT 水平比較（IU/L，±s，n＝20）

表1 各組大鼠血清AST、ALT 水平比較（IU/L，±s，n＝20）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別ASTALT正常組36.46±4.29128.90±23.09模型組69.12±2.09*206.16±39.40*人參皂苷Rg1 低劑量組45.31±2.46＃149.82±29.05＃人參皂苷Rg1 高劑量組42.71±2.69＃157.47±27.80＃二甲雙胍組43.22±2.51＃154.39±28.07＃

3.2 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠血清脂質(zhì)水平的影響 如表2 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平均升高（P＜0.05）； 與模型組比較，人參皂苷Rg1 低劑量組和二甲雙胍組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平均降低（P＜0.05），人參皂苷Rg1 高劑量組大鼠血清TG、TC 水平均降低（P＜0.05），HDL-C、LDL-C 水平無明顯變化（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平比較（mmol/L，±s，n＝20）

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平比較（mmol/L，±s，n＝20）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別TGTCHDL-CLDL-C正常組0.46±0.192.05±0.371.52±0.190.26±0.08模型組1.05±0.24*4.32±0.40*3.06±0.17*0.51±0.08*人參皂苷Rg1 低劑量組0.73±0.20＃3.61±0.33＃2.93±0.11＃0.41±0.15＃人參皂苷Rg1 高劑量組0.76±0.23＃3.62±0.29＃2.95±0.220.48±0.09二甲雙胍組0.75±0.21＃3.61±0.30＃2.94±0.19＃0.45±0.11＃

3.3 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠血清炎癥因子水平的影響 如表3 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均升高（P＜0.05）； 與模型組比較，人參皂苷Rg1各劑量組和二甲雙胍組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比較（ng/mL，±s，n＝20）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比較（ng/mL，±s，n＝20）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別TNF-αIL-6IL-1β正常組1.35±0.230.17±0.080.22±0.06模型組4.87±0.25* 0.48±0.10* 0.53±0.11*人參皂苷Rg1 低劑量組 3.06±0.27＃0.31±0.08＃ 0.39±0.13＃人參皂苷Rg1 高劑量組 2.90±0.37＃0.30±0.12＃ 0.41±0.17＃二甲雙胍組2.99±0.30＃0.30±0.09＃ 0.40±0.15＃

3.4 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠肝組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如表4、圖1 所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與模型組比較，人參皂苷Rg1 各劑量組和二甲雙胍組大鼠肝組織Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白條帶圖

表4 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝20）

表4 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝20）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別Bcl-2Baxcaspase-3正常組1.05±0.050.47±0.060.27±0.04模型組0.35±0.03* 0.98±0.04* 1.04±0.04*人參皂苷Rg1 低劑量組 0.70±0.05＃0.67±0.04＃ 0.51±0.03＃人參皂苷Rg1 高劑量組 0.71±0.03＃0.63±0.08＃ 0.50±0.04＃二甲雙胍組0.70±0.06＃0.64±0.06＃ 0.50±0.03＃

3.5 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠肝組織脂肪酸β 氧化相關(guān)蛋白酶表達(dá)的影響 如表5、圖2 所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織 CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）； 與模型組比較，人參皂苷Rg1 各劑量組和二甲雙胍組大鼠肝組織CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝組織CAT1、CoASH1、ACOX1蛋白條帶圖

表5 各組大鼠肝組織CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝20）

表5 各組大鼠肝組織CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝20）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別CAT1CoASH1ACOX1正常組1.23±0.071.19±0.07 1.21±0.09模型組0.33±0.05* 0.29±0.08* 0.33±0.06*人參皂苷Rg1 低劑量組 0.88±0.07＃ 0.86±0.09＃ 0.92±0.04＃人參皂苷Rg1 高劑量組 0.86±0.05＃ 0.87±0.08＃ 0.88±0.06＃二甲雙胍組0.87±0.06＃ 0.86±0.08＃ 0.90±0.05＃

3.6 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 如圖3所示，正常組肝細(xì)胞排列整齊、形態(tài)正常，未見明顯的細(xì)胞變性、壞死，無大型脂肪空泡、炎性細(xì)胞浸潤； 模型組肝細(xì)胞排列混亂，可見大量細(xì)胞壞死，存在大量脂肪空泡及炎性細(xì)胞浸潤； 而人參皂苷Rg1 各劑量組和二甲雙胍組肝細(xì)胞形態(tài)趨向正常，脂肪空泡、炎性細(xì)胞浸潤情況均有不同程度的改善。

圖3 各組大鼠肝組織HE 染色（×400）

3.7 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠肝組織凋亡的影響 如圖4、表6 所示，棕黃色細(xì)胞為陽性凋亡的細(xì)胞，正常組大鼠肝組織幾乎未見凋亡細(xì)胞； 模型組大鼠肝組織凋亡細(xì)胞明顯增多，且細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）； 人參皂苷Rg1 各劑量組和二甲雙胍組肝組織凋亡細(xì)胞均有不同程度的減少，且細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肝組織TUNEL 染色（×400）

表6 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，n＝20）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別凋亡率/%正常組9.01±2.58模型組77.27±4.01*人參皂苷Rg1 低劑量組62.12±3.90＃人參皂苷Rg1 高劑量組40.07±3.54＃二甲雙胍組45.04±3.70＃

4 討論

早期專家認(rèn)為，NAFLD 的治療主要依靠生活方式的改變，但研究顯示生活方式的干預(yù)并不能逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞損傷［10］，因此對(duì)于NAFLD 藥物治療方面的研究是必不可少。本研究通過探討人參皂苷Rg1 對(duì)NAFLD 大鼠的干預(yù)作用，并從肝細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、炎癥反應(yīng)3 個(gè)方面初步解釋其作用機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是一種自然的程序性死亡過程。介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑主要有線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑。在線粒體途徑中，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一個(gè)關(guān)鍵途徑。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2 蛋白具有抗凋亡作用，Bax 蛋白具有促凋亡作用，在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。caspase-3 作為多種凋亡途徑中常見的下游作用部分，其底物多為細(xì)胞內(nèi)的功能蛋白，與DNA 修復(fù)、mRNA 切割、細(xì)胞骨架重建等相關(guān)。在正常情況下，caspase-3 作為一種無活性的前酶存在； 當(dāng)受到內(nèi)部或外部因素的刺激時(shí)，caspase-3 被激活。激活caspase-3 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并在細(xì)胞凋亡的早期階段啟動(dòng)和執(zhí)行。此外，研究發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)脂肪過度堆積會(huì)引起脂肪過氧化損傷及氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡激活肝星狀細(xì)胞的活化，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化、炎癥反應(yīng)等，進(jìn)一步加劇NAFLD 的發(fā)展進(jìn)程［11-13］。徐雅姝等［14］研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1 可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)NAFLD 起到明顯改善作用。NAFLD 發(fā)病的首要病因?yàn)楦闻K脂肪過度堆積，脂肪酸β-氧化是人體內(nèi)脂質(zhì)代謝的主要信號(hào)通路之一，正常條件下的脂肪酸進(jìn)入肝臟后可經(jīng)β-氧化分解后為人體提供能量，但NAFLD 患者體內(nèi)脂肪酸β-氧化途徑無法分解過量的脂肪酸，導(dǎo)致其在肝臟內(nèi)堆積，還會(huì)進(jìn)一步負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制β-氧化途徑相關(guān)酶的表達(dá)，形成惡性循環(huán)，使病情持續(xù)加重［15］。高月等［16］研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1 能夠降低脂質(zhì)形成、加速脂質(zhì)代謝，從而抑制肝細(xì)胞的脂肪堆積。有學(xué)者認(rèn)為炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷是NAFLD 發(fā)病的“二次打擊”［17］，因此炎癥反應(yīng)也是影響NAFLD 病情發(fā)展的重要機(jī)制之一。

二甲雙胍善具有調(diào)節(jié)血脂、降低體質(zhì)量等作用，本研究表明人參皂苷Rg1 調(diào)節(jié)血脂的作用與二甲雙胍相當(dāng)。與模型組比較，各給藥組大鼠肝功能指標(biāo)、血脂和炎癥因子水平降低，Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2、CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表達(dá)上調(diào)，肝組織損傷得到改善，表明人參皂苷Rg1 能緩解肝損傷，降低血脂、炎癥水平，減少凋亡表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸β-氧化，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。但由于本次實(shí)驗(yàn)樣本量過少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在局限性，未來可擴(kuò)大樣本量或通過臨床療效作進(jìn)一步分析。

綜上所述，人參皂苷Rg1 可能通過抑制肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)脂肪分解、抑制炎癥反應(yīng)抑制NAFLD 疾病的發(fā)展。