陳 曦，朱 玲，李 靖，許國(guó)瑩，葉耘峰

（江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，在所有惡性腫瘤中的死亡率排名第四。結(jié)直腸癌在治療效果和預(yù)后方面存在高度異質(zhì)性，即使是病理類(lèi)型和臨床分期相同，其療效和預(yù)后也可能存在顯著差異［1］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT） 是一類(lèi)生物調(diào)控過(guò)程，是正常發(fā)育中所必需的。但EMT 也在纖維化的發(fā)生等多種病理?xiàng)l件下發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包含改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖等［2］。腫瘤的侵襲與遷移是導(dǎo)致腫瘤患者出現(xiàn)不良預(yù)后的主要原因之一，是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征。越來(lái)越多的研究證明EMT 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。

積雪草酸是一種已知的三萜類(lèi)物質(zhì)，具有抗炎、降低血糖血脂、神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁等多種重要的生物活性［3］。目前已有研究報(bào)道積雪草酸對(duì)舌癌、乳腺癌等的惡性腫瘤具有良好的體外抑制作用［4-5］，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)積雪草酸能夠增強(qiáng)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞對(duì)臨床常規(guī)化療藥物奧沙利鉑的敏感性。本研究以結(jié)腸癌HCT116、SW480 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討積雪草酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，并基于Wnt/β-catenin 信號(hào)通路初步探討其作用機(jī)制，為積雪草酸用于結(jié)腸癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌HCT116 與SW480 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度95%的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 積雪草酸（批號(hào)JXCS20200603） 購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司； 胎牛血清 （ 貨號(hào)SH30084.02）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（貨號(hào)SH30809.01B） 購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司； CCK-8 試劑（貨號(hào)CA1210） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司； 二甲基亞砜 （DMSO，貨號(hào)276855）、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激動(dòng)劑 LiCl （貨號(hào)L9650） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司； Giemsa 染液（貨號(hào)C0133）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； Transwell 小室（貨號(hào)3422a） 購(gòu)自美國(guó)Corning 公司； Matrigel 基質(zhì)膠 （貨號(hào)356234） 購(gòu)自美國(guó)BD 公司； SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（貨號(hào)BL502B）、4% 多聚甲醛（貨號(hào)BL539A） 購(gòu)自合肥白鯊生物科技有限公司； NC 膜（貨號(hào)HF13502S25） 購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司； 波形蛋白（Vimentin，貨號(hào)5741T）、β-連環(huán)蛋白 （β-catenin，貨號(hào) 8480T）、c-myc （貨號(hào)18583S）、細(xì)胞周期蛋白1 （cyclin D1，貨號(hào)55506T）、存活蛋白（survivin，貨號(hào)2808T）、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)32935S） 購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；肌動(dòng)蛋白抗體（β-actin，貨號(hào)BS6007M） 抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld 公司； 神經(jīng)性鈣粘附蛋白 （N-Cadherin，貨號(hào)A19083）、Snail （貨號(hào)A5243）、上皮性鈣粘附蛋白 （ECadherin，貨號(hào)A3044）、基質(zhì)金屬蛋白酶2 （MMP2，貨號(hào)A11144）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （MMP9，貨號(hào)A0289） 抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。

1.3 儀器 TS100 型倒置顯微鏡（日本尼康公司）； 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）； MINI-4 小型垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京凱元信瑞儀器有限公司）； iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 藥物配制 精密稱(chēng)取積雪草酸適量溶于無(wú)菌DMSO中，配制成積雪草酸溶液（母液20 mmol/L，-20 ℃保存），給藥時(shí)以培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需劑量； 精密稱(chēng)量LiCl溶于無(wú)菌培養(yǎng)基中，給藥劑量為20 mmol/L。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔5 000 個(gè)接種于96 孔板，約70% ～80% 細(xì)胞貼壁后加入含0.1%DMSO （對(duì)照組） 及10、20、30、40、50、60 μmol/L積雪草酸溶液的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清） 分別處理24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育2 h，于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞均勻接種于6 孔板中，貼壁后設(shè)置積雪草酸低、中、高劑量組（10、20、30 μmol/L），另設(shè)置對(duì)照組給予含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞均勻接種于6 孔板中，按“2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行分組給藥。使用無(wú)菌槍頭垂直劃線，PBS 洗滌2 次后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別于0、48 h 觀察并拍照，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率，公式為細(xì)胞劃痕愈合率＝ ［（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積） /0 h劃痕面積］ ×100%。

2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后使用無(wú)FBS 培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后接種于小室上層，每孔200 μL （細(xì)胞密度為2.5×105/mL），小室下層加入600 μL 含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，按“2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行分組給藥。48 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3次，Giemsa 染液染色30 min，PBS 洗滌3 次，擦去小室上層細(xì)胞。隨機(jī)選擇3 個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)則用無(wú)血清培養(yǎng)基按1 ∶10 比例稀釋Matrigel 膠，并將其均勻平鋪在Transwell 小室上層（每孔50 μL），培養(yǎng)箱水化2 h后，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

2.6 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，均勻接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合率達(dá)70% ～80% 后，按“2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行分組給藥，作用24 h 后，收集各組細(xì)胞，提取總蛋白。使用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液封閉30 min，TBST 洗膜3 次，每次5 min，一抗（1 ∶1 000） 4 ℃過(guò)夜孵育，TBST 洗膜3次，每次5 min，二抗（1 ∶10 000） 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次5 min，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，Image J 軟件分析蛋白灰度值，β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.7 Wnt/β-cantenin 通路在積雪草酸調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲中的作用 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116 細(xì)胞，均勻接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組（0.1% DMSO）、積雪草酸組（20 μmol/L）、積雪草酸+LiCl 組（積雪草酸20 μmol/L，LiCl 20 mmol/L），Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)步驟同“2.5” 項(xiàng)，Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟同“2.6” 項(xiàng)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組比較，給藥劑量高于20 μmol/L 時(shí)，積雪草酸對(duì)HCT116、SW480 細(xì)胞的增殖均具有抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），且隨著給藥劑量的增加，增殖抑制效果增強(qiáng)。積雪草酸處理HCT116 與SW480 細(xì)胞24 h 后的IC50值分別為45.34、34.97 μmol/L，故選擇10、20、30 μmol/L 劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝3）

3.2 積雪草酸對(duì)SW480 和HCT116 細(xì)胞形態(tài)的影響 對(duì)照組SW480、HCT116 細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞觸角明顯； 積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細(xì)胞隨著藥物劑量逐漸增加，部分細(xì)胞觸角變短，形狀逐漸規(guī)則，細(xì)胞失去間質(zhì)型細(xì)胞形態(tài)特征，呈現(xiàn)上皮型細(xì)胞形態(tài)特征，見(jiàn)圖2。提示積雪草酸對(duì)SW480 和HCT116 細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程產(chǎn)生抑制作用。

圖2 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）

3.3 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞遷移能力的影響與對(duì)照組比較，積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖3。與對(duì)照組比較，積雪草酸各劑量組SW480 與HCT116 細(xì)胞遷移率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖4。提示積雪草酸能夠有效抑制SW480、HCT116 細(xì)胞的遷移。

圖3 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞劃痕愈合能力的影響（×40，±s，n＝3）

圖4 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞遷移能力的影響（×100，±s，n＝3）

3.4 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞侵襲能力的影響與對(duì)照組比較，積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細(xì)胞侵襲率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖5。提示積雪草酸能降低SW480 和HCT116 細(xì)胞侵襲能力。

圖5 積雪草酸對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞侵襲能力的影響（×100，±s，n＝3）

3.5 積雪草酸對(duì) HCT116 細(xì)胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)細(xì)胞劃痕與Transwell 遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，積雪草酸對(duì)HCT116 細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移抑制效率較高，故選擇其進(jìn)行蛋白表達(dá)驗(yàn)證。與對(duì)照組比較，積雪草酸各劑量組HCT116 細(xì)胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖6。

圖6 積雪草酸對(duì)HCT116 細(xì)胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.6 積雪草酸對(duì)HCT116 細(xì)胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，積雪草酸各劑量組HCT116 細(xì)胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖7。

圖7 積雪草酸對(duì)HCT116 細(xì)胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.7 Wnt/β-cantenin 通路在積雪草酸調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲中的作用 與積雪草酸組比較，LiCl+積雪草酸組HCT116 細(xì)胞遷移、侵襲率升高（P＜0.05，P＜0.01），Ncadherin、β-catenin 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖8。提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號(hào)通路激動(dòng)劑LiCl 處理可逆轉(zhuǎn)積雪草酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用。

圖8 LiCl 逆轉(zhuǎn)積雪草酸對(duì)HCT116 細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（×100，±s，n＝3）

4 討論

結(jié)直腸癌是目前發(fā)病率較高的臨床惡性腫瘤，預(yù)計(jì)到2030 年全球負(fù)擔(dān)將增加60%［6］。伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的5 年生存率較低，50%的轉(zhuǎn)移患者會(huì)在5 年內(nèi)復(fù)發(fā)并死亡［7-8］，并且?guī)缀跛械慕Y(jié)直腸癌患者都會(huì)產(chǎn)生化療藥物的耐藥性，限制其療效，最終導(dǎo)致治療失?。?-10］。因此，為改善結(jié)直腸癌患者的臨床治療效果及提升預(yù)后，開(kāi)發(fā)安全有效的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床新藥物勢(shì)在必行，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化已被報(bào)道為上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的重要生物學(xué)過(guò)程［11］。

研究證實(shí)，積雪草酸對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移具有抑制作用。積雪草酸可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯，有效抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 的生長(zhǎng)，還能夠通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制WAVE3 的激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的侵襲［12］。積雪草酸通過(guò)介導(dǎo)線粒體損傷促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的肺癌A549 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［13-14］。積雪草酸還可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活Grp78/IRE1α/JNK 和Calpain 通路抑制舌癌的生長(zhǎng)［15］。同時(shí)，也有研究初步證實(shí)積雪草酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移具有抑制作用［16］。本研究深入探討了積雪草酸抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制。

金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs） 家族能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，與腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)高度相關(guān)，在人類(lèi)結(jié)腸癌中MMP-2 與MMP-9均過(guò)量表達(dá)［17-18］。MMP-9 和MMP-2 的高表達(dá)會(huì)減弱基底膜的屏障作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［19］。本研究通過(guò)劃痕愈合與Transwell 遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)積雪草酸對(duì)HCT116 與SW480 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，并通過(guò)Western blot 結(jié)果證實(shí)積雪草酸可抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞的MMP-9、MMP-2 表達(dá)，并劑量依賴(lài)性地抑制間質(zhì)指標(biāo)N-cadherin、Vimentin、Snail 表達(dá)，促進(jìn)上皮指標(biāo)E-cadherin 表達(dá)，從而抑制細(xì)胞EMT 進(jìn)程。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路主要由細(xì)胞外因子（Wnt）、跨膜受體卷曲蛋白、β-catenin 和T 細(xì)胞因子等組成，已被證實(shí)在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)過(guò)度激活，這一異常激活增加Snail 的轉(zhuǎn)錄，并抑制E-cadherin，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加［15］。且Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異常激活可調(diào)控其下游靶基因cyclinD1、c-myc 和survivin，進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、增殖、遷移和侵襲［17，20］。本研究顯示，積雪草酸可有效抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞Wnt/βcatenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-myc、cyclin D1 和survivin 的表達(dá)，抑制效果呈劑量依賴(lài)性，且Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑可逆轉(zhuǎn)積雪草酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT 相關(guān)蛋白與β-catenin 蛋白表達(dá)的作用。

綜上所述，積雪草酸能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 與SW480 的遷移、侵襲及EMT 進(jìn)程，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，而這一作用機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活化有關(guān)。