郝 冰，趙志軒，趙玉梅，王久英

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院一分院，黑龍江 牡丹江 157000； 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院中西醫(yī)科，黑龍江 牡丹江 157000； 3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 牡丹江 157000； 4.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院門診預(yù)檢分診，黑龍江 牡丹江 157000）

糖尿病是一種終身性的內(nèi)分泌代謝障礙性疾病，以高血糖為特征，可慢性損害眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等各組織并引起功能障礙，近年來發(fā)病率不斷上升，已成為嚴(yán)重危害人類健康的慢性殺手［1-2］。胰島素抵抗指機(jī)體組織器官對胰島素的敏感性降低，進(jìn)而導(dǎo)致對葡萄糖的攝取、利用減少，引起血糖升高，是糖尿病最主要的致病因素及病理基礎(chǔ)［3］。目前已有的降糖藥在臨床治療中并非適用于所有患者，開發(fā)能改善胰島素抵抗的降糖藥物勢在必行。自噬是一種溶酶體依賴性的降解途徑，能降解受損細(xì)胞器、未折疊蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)成分，為細(xì)胞存活提供必需原料，提高細(xì)胞質(zhì)量［4］。自噬的過度激活會造成細(xì)胞不必要的損傷，而自噬反應(yīng)過弱可能無法有效保護(hù)細(xì)胞，以上情形均可能導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生［5-6］。金絲桃苷，又稱槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，為黃酮醇苷類化合物，具有護(hù)肝、抗氧化、抗炎、降血糖等作用［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能降低自噬，減輕H9c2 心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷［9］。AMP 活化蛋白激酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子1 （AMP-activated protein kinase/silent information regulator 1，AMPK/SIRT1）通路是介導(dǎo)自噬的常見途徑，在改善棕櫚酸誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗時發(fā)揮重要作用［10］。本研究通過基于AMPK/SIRT1 通路介導(dǎo)的自噬途徑探討金絲桃苷對糖尿病小鼠胰島素抵抗的改善作用。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性C57BL/6 小鼠40 只，7 ～8 周，體質(zhì)量22～24 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （魯） 2019-0003］，飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學(xué)院 ［實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK （黑） 2019-006］，室溫20 ～25 ℃，相對濕度55% ～65%，明暗交替12 h/12 h，攝食飲水自由，適應(yīng)3 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理號20210010218）。

1.2 試劑與藥物 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、金絲桃苷（純度≥98%，批號YZ-111521）、雷帕霉素、HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司； 小鼠空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS） ELISA 試劑盒購自上海梵態(tài)生物科技有限公司； Beclin 1 免疫組化試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司； 兔抗p-AMPK、兔抗AMPK、兔抗SIRT1、兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 （microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、兔抗p62、兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、兔抗caspase-6、兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG 購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 三諾安穩(wěn)優(yōu)加血糖儀（長沙三諾生物傳感股份有限公司）； Nikon Ti-S 顯微鏡（日本Nikon 公司）； Alpha View 凝膠成像儀（美國ProteinSimple 公司）。

2 方法

2.1 糖尿病小鼠模型制備 采用高脂飼料喂養(yǎng)及STZ 腹腔注射的方式誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型。小鼠用高脂飼料喂養(yǎng)5 周，禁食不禁水12 h，連續(xù)5 d 每天腹腔注射40 mg/kg STZ （用0.1 mmol/L 檸檬酸緩沖液溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，配制后0.5 h 內(nèi)用完），結(jié)束腹腔注射后7 d 測定空腹血糖（ fasting blood glucose，F(xiàn)BG ），當(dāng)小鼠 FBG 大于11.1 mmol/L 時判定糖尿病模型建立成功［11］，此時可觀察到小鼠攝食、飲水量增多。

2.2 分組與給藥 將成功建立糖尿病模型且無病重跡象的小鼠分為模型組，金絲桃苷低、高劑量組，自噬激活組，每組8 只。另取同期喂養(yǎng)普通飼料、腹腔注射等體積0.1 mmol/L 檸檬酸緩沖液的8 只小鼠為對照組。金絲桃苷低、高劑量組小鼠分別灌胃給予25、100 mg/kg 金絲桃苷［12］，自噬激活組小鼠灌胃給予100 mg/kg 金絲桃苷和1 mg/kg 雷帕霉素，對照組、模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)28 d。

2.3 小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 測定及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR） 計(jì)算 給藥結(jié)束后，小鼠空腹12 h，稱定體質(zhì)量。尾靜脈取血1 mL，在4 ℃下離心15 min，留取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用血糖儀測量FBG 水平，使用ELISA法測定FINS 水平，計(jì)算HOMA-IR，公式為HOMA-IR ＝（FBG×FINS） /22.5。

2.4 HE 染色檢測小鼠肝組織病理變化 小鼠斷頸處死，摘取肝臟，部分用4%甲醛固定，其余部分于-80 ℃冷凍保存，用于Western Blot 檢測。將4%甲醛固定的肝組織樣本經(jīng)石蠟包埋后切片（3 μm），切片脫蠟、水化后進(jìn)行HE 染色，封片，于顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化。

2.5 免疫組化染色檢測肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例 小鼠肝組織切片常規(guī)脫蠟至水，室溫下加0.2% Triton X-100孵育10 min，3% H2O2溶液孵育10 min，放入枸櫞酸鈉緩沖溶液中，微波爐加熱修復(fù)，常溫冷卻并用5%脫脂奶粉溶液孵育30 min，在4 ℃下加入兔抗Beclin 1 孵育過夜，室溫下加入羊抗兔IgG 孵育30 min，滴加SABC 反應(yīng)20 min，經(jīng)DAB 顯色、蘇木精襯染，封片，顯微鏡下觀察5 個視野的Beclin 1 陽性細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算Beclin 1 陽性細(xì)胞比例。

2.6 Western blot 法檢測小鼠肝組織AMPK/SIRT1 通路、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取冷凍保存的肝組織，于冰上加RIPA 裂解液（含有蛋白酶抑制劑） 研磨裂解，提取總蛋白，測定蛋白濃度。取10 μg 總蛋白沸水浴變性后上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入一抗（兔抗p-AMPK、兔抗AMPK、兔抗SIRT1、兔抗LC3、兔抗p62、兔抗Bax、兔抗caspase-6、兔抗GAPDH） 4 ℃下孵育過夜，加入二抗（山羊抗兔IgG） 37 ℃孵育1 min，用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠成像儀掃描成像，Image J 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 金絲桃苷對糖尿病小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 水平及HOMA-IR 的影響 與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05），F(xiàn)BG、FINS 水平及HOMA-IR 升高（P＜0.05）；與模型組比較，金絲桃苷各劑量組小鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05），F(xiàn)BG、FINS 水平及HOMA-IR 降低（P＜0.05），且高劑量組效果更佳； 與金絲桃苷高劑量組比較，自噬激活組小鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05），F(xiàn)BG、FINS 水平及HOMAIR 均升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 水平及HOMA-IR 比較（±s，n＝8）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 水平及HOMA-IR 比較（±s，n＝8）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與金絲桃苷高劑量組比較，▲P＜0.05。

組別體質(zhì)量/gFBG/（mmol·L-1）FINS/（ng·mL-1）HOMA-IR對照組31.85±1.127.86±0.433.77±0.381.32±0.25模型組26.89±1.25*25.67±4.22*11.14±1.04*12.73±1.14*金絲桃苷低劑量組28.46±0.95＃19.36±2.84＃8.80±0.76＃7.56±0.95＃金絲桃苷高劑量組30.04±1.03＃14.15±2.68＃7.26±0.79＃4.58±0.73＃自噬激活組26.56±0.87▲24.43±3.52▲10.58±0.93▲11.50±1.18▲

3.2 金絲桃苷對糖尿病小鼠肝組織病理形態(tài)的影響 對照組小鼠肝組織中細(xì)胞形態(tài)正常、邊界清晰、排列整齊； 模型組小鼠肝組織中細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、結(jié)構(gòu)不完整（黑箭頭），伴有空泡、水腫、壞死現(xiàn)象（紅箭頭）； 金絲桃苷各劑量組小鼠肝組織病理損傷減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整；與金絲桃苷高劑量組比較，自噬激活組小鼠肝組織病理損傷加重，見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織HE 染色（×200）

3.3 金絲桃苷對糖尿病小鼠肝組織中Beclin 1 陽性細(xì)胞比例的影響 與對照組比較，模型組小鼠肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例升高（P＜0.05）； 與模型組比較，金絲桃苷各劑量組小鼠肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例降低（P＜0.05），且高劑量組效果更佳； 與金絲桃苷高劑量組比較，自噬激活組小鼠肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例升高（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 各組小鼠肝組織Beclin 1 蛋白免疫組化染色（×200）

表2 各組小鼠肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例比較（%，±s，n＝8）

表2 各組小鼠肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例比較（%，±s，n＝8）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與金絲桃苷高劑量組比較，▲P＜0.05。

組別Beclin 1 陽性細(xì)胞比例對照組6.63±1.12模型組35.36±2.78*金絲桃苷低劑量組18.54±1.97＃金絲桃苷高劑量組12.05±1.59＃自噬激活組22.78±2.06▲

3.4 金絲桃苷對糖尿病小鼠肝組織AMPK/SIRT1 通路及自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組小鼠肝組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bax、caspase-6 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.05），p62 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與模型組比較，金絲桃苷各劑量組小鼠肝組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bax、caspase-6蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p62 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），且高劑量組效果更佳； 與金絲桃苷高劑量組比較，自噬激活組小鼠肝組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bax、caspase-6 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），p62 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織AMPK/SIRT1 通路及自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化（±s，n＝8）

4 討論

近年來，糖尿病在全球20～79 歲成人群體中患病率已達(dá)7.3%，預(yù)計(jì)2045 年將達(dá)8.3%［13］。改善胰島素抵抗可控制糖尿病患者血糖水平，減少并發(fā)癥發(fā)生，改善預(yù)后，但目前部分患者服用臨床常用藥物無法改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［14-15］。因而，尋找能改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的新藥物具有重要價值。本研究建立糖尿病小鼠模型后，可見小鼠體質(zhì)量降低，F(xiàn)BG、FINS 水平及HOMA-IR 升高，表明造模成功，小鼠存在胰島素抵抗。肝臟在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其異常與胰島素抵抗相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠肝組織中細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)異常，肝組織Bax、caspase-6表達(dá)升高，表明小鼠體內(nèi)高血糖狀態(tài)會影響凋亡蛋白表達(dá)，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，損傷肝組織，進(jìn)而促進(jìn)胰島素抵抗發(fā)生。

金絲桃苷具有抗炎、降脂等多種生理活性，是治療2型糖尿病的中藥方劑益氣滋陰飲中活性較高的小分子化合物［16-17］。研究表明，金絲桃苷能調(diào)控前脂肪細(xì)胞的糖脂代謝，改善糖尿病小鼠糖脂代謝及心肌損傷，減輕胰島素抵抗［18-19］。本研究結(jié)果顯示，金絲桃苷可降低糖尿病小鼠FBG、FINS 水平及HOMA-IR，提高體質(zhì)量，改善肝臟凋亡蛋白表達(dá)及組織病變，表明金絲桃苷可調(diào)控糖代謝，減輕肝組織損傷，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

自噬激活與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)升高，p62 蛋白表達(dá)降低，表明糖尿病小鼠肝組織中自噬蛋白LC3 轉(zhuǎn)化及自噬下游p62 降解順利，自噬流通暢，肝組織中自噬反應(yīng)增強(qiáng)。研究表明，金絲桃苷減輕H9c2 心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的機(jī)制與降低自噬有關(guān)［9］，而AMPK/SIRT1 是自噬反應(yīng)發(fā)生的上游通路，AMPK 磷酸化后激活SIRT1 可啟動自噬反應(yīng)［20］。本研究顯示，金絲桃苷可降低糖尿病小鼠肝組織Beclin 1 陽性細(xì)胞比例、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白及AMPK/SIRT1 通路激活水平，提高p62 蛋白表達(dá)，表明金絲桃苷降低自噬水平可能是改善糖尿病小鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的相關(guān)機(jī)制。此外，本研究發(fā)現(xiàn)自噬激活劑雷帕霉素可減輕金絲桃苷對AMPK/SIRT1 通路激活的降低作用，小鼠肝臟自噬及凋亡水平升高，肝組織病變及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)加重，小鼠體質(zhì)量降低，表明金絲桃苷改善糖尿病小鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的作用機(jī)制可能與抑制AMPK/SIRT1 通路介導(dǎo)的自噬途徑有關(guān)。

綜上所述，金絲桃苷能改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗及高血糖狀態(tài)，其機(jī)制可能與抑制AMPK/SIRT1 通路介導(dǎo)的自噬，減輕肝臟損傷狀況有關(guān)。但金絲桃苷是否還通過其他通路發(fā)揮作用，后續(xù)將設(shè)置不同濃度梯度及陽性藥物組進(jìn)行完善，探究其潛在機(jī)制。