高 娟，譚 偉，陳桂芳，蘭家琴，張 祎*，王睿睿*，饒高雄

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500； 2.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

特應(yīng)性皮炎是一種常見的慢性皮膚炎癥性疾病，病程遷延難愈，其特征是皮膚持續(xù)瘙癢［1-2］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來其患病率在全世界范圍內(nèi)不斷上升，約25%的兒童和2% ～3%的成人受到影響［3-5］。

中醫(yī)藥治療特應(yīng)性皮炎可追溯至上千年前，病因多以患兒先天稟賦不足，后天脾胃虛弱，加之嗜食肥甘厚味，致脾胃受損，濕邪壅塞，進(jìn)而發(fā)病的皮膚疾患［6］。其治療多從健脾助運(yùn)和胃治濕，達(dá)木清心調(diào)暢情志，補(bǔ)氣固表宣肺，溫陽滋陰固本達(dá)到治療效果［7］。也有近代醫(yī)家從本滋養(yǎng)先天，顧護(hù)脾胃到標(biāo)祛風(fēng)止癢，清熱利濕，滋陰潤(rùn)燥，涼血止血，使患者全身氣機(jī)得以調(diào)達(dá)，三焦通暢［8］。皮敏消膠囊主要由苦參、白鮮皮、黃柏、黃芩、黃連等組成。濕邪易阻遏氣機(jī)夾雜他邪而入，濕邪與風(fēng)邪相合猶如水得風(fēng)行，助內(nèi)濕行于周身則癢見全身，苦參、白鮮皮、黃連、黃柏、黃芩清熱燥濕祛風(fēng)止癢，使三焦水道得以調(diào)達(dá)，濕邪不為水患，則病自消［9-10］，諸藥合用從濕論治，通過其祛風(fēng)除濕、清熱解毒、涼血止癢、消腫散結(jié)效果達(dá)到治療特應(yīng)性皮炎效果［11］。該制劑臨床療效顯著，常用于治療濕疹、銀屑病、慢性蕁麻疹等皮膚疾?。?2］。本研究主要探討皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠的初步作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠60 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （湘） 2019-0004］，飼養(yǎng)在溫度（22 ± 2）℃，相對(duì)濕度40% ～70%，噪音≤50 dB，晝夜12 h/12 h 循環(huán)的環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)R-062021001）。

1.2 試劑與藥物 皮敏消膠囊（國藥準(zhǔn)字Z10950057，四川德峰藥業(yè)有限公司） 溶于0.5% CMC-Na 溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.6 g/kg 的混懸溶液，即為低、中、高劑量。氯雷他定片（國藥準(zhǔn)字H20070030，西安楊森制藥有限公司），溶于0.5% CMC-Na 溶液，配制成質(zhì)量濃度為1.67 mg/kg 的混懸溶液。羧甲基纖維素鈉（CMCNa） （批號(hào)20200330，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）； PBS溶液（貨號(hào)AF29449009，美國HyClone 公司）； 小鼠免疫球蛋白E （IgE）、白細(xì)胞介素4 （IL-4）、白細(xì)胞介素13（IL-13）、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP） ELISA 試劑盒、BCA 蛋白試劑盒 （貨號(hào)210071406M、210071413M、210071416M、210071409M、210425B，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）； 實(shí)驗(yàn)相關(guān)抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 Spark 10M 型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）； Forma 902 型-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 5810R 型低溫高速離心機(jī) （德國Eppendorf 公司）； AR224CN 型電子分析天平［奧豪斯儀器（上海） 有限公司］； SQS-1000/SQS-1000 型玻片掃描影像系統(tǒng)（深圳市生強(qiáng)科技有限公司）； Metr-ISO 型游標(biāo)卡尺［上海美耐特實(shí)業(yè)（集團(tuán)） 有限公司］。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將60 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、氯雷他定（1.67 mg/kg） 組和皮敏消膠囊低、中、高（0.4、0.8、1.6 g/kg） 劑量組，每組10只。參照文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道方法進(jìn)行特應(yīng)性皮炎小鼠造模，實(shí)驗(yàn)前1 d 去除小鼠背部毛發(fā)（2 cm × 3 cm），實(shí)驗(yàn)第1、3 天，除對(duì)照組外，其余各組小鼠分別用100、50 μL 1%DNCB 涂于小鼠背部脫毛區(qū)及右耳，從第7 天開始改為0.5% DNCB 隔天涂抹1 次； 對(duì)照組涂抹相應(yīng)的基質(zhì)溶液（丙酮-橄欖油＝3 ∶1），小鼠背部出現(xiàn)脫屑、紅斑、水腫、結(jié)痂等情況視為造模成功。每次涂抹0.5% DNCB 后8 h，皮敏消膠囊各劑量組和氯雷他定組灌胃相應(yīng)劑量藥物； 對(duì)照組和模型組灌胃0.5%CMC-Na 溶液，每天1 次，持續(xù)給藥21 d。

2.2 小鼠皮炎評(píng)分 拍照并觀察各組小鼠背部皮損的大體表現(xiàn)，參考文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道評(píng)估小鼠背部皮損嚴(yán)重程度，以4 種癥狀（紅斑/出血、水腫/丘疹、表皮剝落/抓痕、磷屑/干燥） 進(jìn)行評(píng)判，嚴(yán)重程度分別為0 （無）、1 （輕度）、2 （中度）、3 （重度） 分。

2.3 小鼠耳片腫脹度及臟器系數(shù)測(cè)定 選取小鼠耳部正中部位，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量左耳和右耳厚度，每只耳部測(cè)量3 次，公式為腫脹度＝右耳厚度-左耳厚度，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。于實(shí)驗(yàn)第21 天，稱定小鼠體質(zhì)量，麻醉小鼠后，摘取脾臟和胸腺并稱定質(zhì)量，公式為臟器系數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.4 小鼠血清總IgE、IL-4、IL-13 水平檢測(cè) 小鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，分離得到血清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)血清總IgE、IL-4、IL-13 水平。

2.5 HE、TB 染色檢測(cè)皮膚組織病理變化及肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況 小鼠采血后，取背部皮膚經(jīng)打孔器制成大小一致的多塊皮膚組織，盡量展平皮膚，一部分置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，另一部分?%多聚甲醛溶液固定48 h，然后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色及甲苯胺藍(lán)（TB） 染色，封片后于顯微鏡下觀察，采用玻片掃描成像系統(tǒng)截圖分析。肥大細(xì)胞被染成藍(lán)紫色，隨機(jī)選擇同一放大倍數(shù)下8 個(gè)視野，并用Image J 軟件測(cè)量皮膚厚度，計(jì)算肥大細(xì)胞數(shù)目。

2.6 免疫組化法檢測(cè)皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 表達(dá)取“2.5” 項(xiàng)下石蠟切片，脫蠟、抗原修復(fù)后加入一抗，4 ℃孵育過夜，清洗后加二抗，室溫孵育30 min，DAB 顯色后封片，于顯微鏡下觀察，采用玻片掃描成像系統(tǒng)采集圖像并分析。

2.7 皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 水平檢測(cè) 取一塊小鼠背部皮損皮膚，加PBS 冰浴研磨，4 ℃、5 000 r/min 離心10 min，取組織上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)皮損組織勻漿TSLP、IL-4、IL-13 水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過Graphpad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠背部皮損表觀 對(duì)照組小鼠皮膚正常，毛發(fā)增生且光滑； 模型組小鼠出現(xiàn)不同程度的脫屑、紅斑、水腫且有滲出物、結(jié)痂； 氯雷他定組皮損程度減輕； 皮敏消膠囊各劑量組皮損也有所改善，高劑量組作用效果最明顯，見圖1。

圖1 各組小鼠皮損表觀

3.2 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮炎評(píng)分的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮炎評(píng)分增加（P＜0.01）； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消膠囊各劑量組小鼠皮炎評(píng)分均降低（P＜0.05，P＜0.01），且皮敏消膠囊的作用呈劑量依賴性，見表1。

表1 各組小鼠皮炎評(píng)分比較（±s，n＝8）

表1 各組小鼠皮炎評(píng)分比較（±s，n＝8）

注： 與對(duì)照組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別皮炎評(píng)分/分0 d4 d10 d18 d21 d對(duì)照組0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000模型組0.000±0.0004.308±0.480＃＃3.154±0.801＃＃2.846±0.801＃＃3.308±0.751＃＃氯雷他定組0.000±0.0003.615±0.650*1.692±0.751**1.308±0.480**1.462±0.519**皮敏消膠囊高劑量組0.000±0.0003.333±0.500**1.556±0.726**1.111±0.333**1.111±0.333**皮敏消膠囊中劑量組0.000±0.0003.385±0.506**1.846±0.689**1.308±0.480**1.231±0.439**皮敏消膠囊低劑量組0.000±0.0003.667±0.707*2.111±0.601**1.667±0.500**1.556±0.527**

3.3 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠耳腫脹度的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠耳腫脹度增加（P＜0.01）； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消膠囊各劑量組小鼠耳腫脹度降低（P＜0.01），見表2。

表2 各組小鼠耳腫脹度比較（±s，n＝8）

表2 各組小鼠耳腫脹度比較（±s，n＝8）

注： 與對(duì)照組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別耳腫脹度/mm 0 d4 d6 d18 d21 d對(duì)照組0.000±0.0000.000±0.0000.001±0.0030.002±0.0040.002±0.004模型組0.000±0.0000.026±0.014＃＃0.118±0.040＃＃0.102±0.030＃＃0.131±0.041＃＃氯雷他定組0.000±0.0000.010±0.0060.022±0.012**0.048±0.028**0.038±0.025**皮敏消膠囊高劑量組0.000±0.0000.013±0.0100.020±0.016**0.063±0.021**0.034±0.020**皮敏消膠囊中劑量組0.000±0.0000.018±0.0170.017±0.007**0.080±0.013*0.020±0.017**皮敏消膠囊低劑量組0.000±0.0000.014±0.0050.044±0.022**0.076±0.021*0.028±0.011**

3.4 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮損組織病理學(xué)的影響 對(duì)照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整； 與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚角化過度、角化不全，表皮增厚（P＜0.01），顆粒層、棘層肥大，基底層下移，真皮層淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)增加，細(xì)胞間炎性水腫等皮炎樣病變； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消膠囊各劑量組小鼠特應(yīng)性皮炎癥狀有所改善，表皮增厚減少（P＜0.01），真皮層炎癥細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤(rùn)減少，毛囊、皮脂腺等附屬結(jié)構(gòu)增加，見圖2。

圖2 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮損組織病理學(xué)的影響（HE，×200，±s，n＝8）

3.5 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮損組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠真皮層中肥大細(xì)胞浸潤(rùn)增加，肥大細(xì)胞數(shù)目增加（P＜0.01）； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消膠囊各劑量組小鼠肥大細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肥大細(xì)胞數(shù)目也減少（P＜0.01），見圖3。結(jié)果提示，皮敏消膠囊可能是通過調(diào)控肥大細(xì)胞干預(yù)小鼠特應(yīng)性皮炎。

圖3 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮損組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的影響（TB，×200，±s，n＝8）

3.6 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠臟器系數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)升高（P＜0.01），胸腺指數(shù)無明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消各劑量組小鼠脾臟指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01），而胸腺指數(shù)則無明顯變化（P＞0.05），見圖4。結(jié)果提示，皮敏消膠囊可能通過T 細(xì)胞調(diào)節(jié)特應(yīng)性皮炎小鼠體液免疫而發(fā)揮作用。

圖4 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠臟器系數(shù)的影響（±s，n＝8）

3.7 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠外周血總IgE、IL-4、IL-13 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清總IgE、IL-4、IL-13 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消膠囊各劑量組小鼠血清總IgE、IL-4、IL-13 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），且皮敏消膠囊的作用呈劑量依賴性，見圖5。

圖5 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠外周血總IgE、IL-4、IL-13 水平的影響（±s，n＝8）

3.8 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 表達(dá)的影響 TSLP、IL-4、IL-13 陽性表達(dá)呈棕黃色染色，主要集中在表皮顆粒層、棘層，真皮層乳頭層、毛囊及皮脂腺，胞漿、胞核及胞膜少量著色。對(duì)照組陽性表達(dá)較少； 與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 表達(dá)增加； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消膠囊各劑量組小鼠皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 表達(dá)減少，見圖6。

圖6 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 表達(dá)的影響（IHC，×200）

3.9 皮敏消膠囊對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮損組織TSLP、IL-4、IL-13 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，氯雷他定組和皮敏消膠囊各劑量組小鼠皮損組織TSLP、IL-13 水平降低（P＜0.01），IL-4 水平無明顯變化（P＞0.05），見圖7。

4 討論

特應(yīng)性皮炎是一種以濕疹和嚴(yán)重瘙癢為特征的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制是宿主免疫系統(tǒng)、皮膚屏障缺陷和瘙癢等相互作用的結(jié)果［14-15］。當(dāng)抗原入侵，皮膚屏障會(huì)遭到破壞，外來抗原最初激發(fā)Th1，而重復(fù)激發(fā)會(huì)導(dǎo)致Th1型向Th2 型反應(yīng)轉(zhuǎn)變； 抗原還可通過皮膚表面朗格漢斯細(xì)胞上的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP） 受體直接誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞因子IL-4、IL-13 分泌。此外，TSLP 還能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的活化，增強(qiáng)IL-4、IL-13 的表達(dá)［16］。IL-4、IL-13也影響IgE 的合成和嗜酸性粒細(xì)胞的趨化［17］。特應(yīng)性皮炎患者常見血清中總IgE 水平升高，IgE 通過介導(dǎo)肥大細(xì)胞的激活，分泌Th2 細(xì)胞因子IL-4、IL-13。肥大細(xì)胞在急性特應(yīng)性皮炎中主要呈脫顆粒狀態(tài)，而在慢性期數(shù)量增加，積聚于乳頭狀真皮層中。在特應(yīng)性皮炎的發(fā)病過程中既是效應(yīng)細(xì)胞又是調(diào)節(jié)細(xì)胞，肥大細(xì)胞可通過其表面高親和力IgE受體（Fc-εRI） 致敏，當(dāng)與結(jié)合的IgE 特異性抗原相遇時(shí)，釋放顆粒介質(zhì)，由花生四烯酸合成前列腺素和白三烯，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IL-4、IL-13，增強(qiáng)T 細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)原代B 細(xì)胞發(fā)育并刺激B 細(xì)胞中IgE 的合成［18］。

抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等是目前臨床上常用的特應(yīng)性皮炎治療藥物，雖然臨床運(yùn)用廣泛，但長(zhǎng)期使用副作用明顯，復(fù)發(fā)率高，患者依從性較差［19］。中醫(yī)學(xué)對(duì)皮膚病的治療歷史悠久，不同學(xué)派治療特應(yīng)性皮炎的療效均較顯著。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為特應(yīng)性皮炎多由先天胎毒遺熱，后天臟腑失調(diào)及外感風(fēng)濕熱邪，三者交叉錯(cuò)雜而引起，病性屬本虛標(biāo)實(shí)。但其核心病機(jī)乃脾虛和心火，脾虛生內(nèi)濕，浸淫肌膚，心火致郁熱，瘡生癢甚，與外邪相合終致疾病反復(fù)發(fā)作，臨證可以從健脾清心祛邪角度進(jìn)行論治［20］。皮敏消膠囊源自古方“消風(fēng)散”，由苦參、蒼術(shù)、防風(fēng)、荊芥、白鮮皮、蜈蚣、地黃、蒲公英、黃芩、牡丹皮、蟬蛻、紫草、地骨皮等21 味中藥材組成，全方具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、瀉火止癢的功效，還可以促進(jìn)血流運(yùn)轉(zhuǎn)、鞏固中氣、外透風(fēng)邪、內(nèi)清里熱、驅(qū)邪外出，調(diào)和陰陽。皮敏消膠囊在臨床治療成人特應(yīng)性皮炎效果良好，不良反應(yīng)發(fā)生率低，在臨床治療中具有很好的推廣價(jià)值［21］。

本研究采用DNCB 誘導(dǎo)BALB/c 小鼠建立特應(yīng)性皮炎模型，結(jié)果顯示皮敏消膠囊一方面能改善特應(yīng)性皮炎小鼠皮損病理特征，降低皮損組織TSLP 水平，調(diào)控Th2 型細(xì)胞因子IL-4、IL-13 的分泌； 另一方面還能降低特應(yīng)性皮炎小鼠脾臟系數(shù)，調(diào)控B 細(xì)胞分化，降低血清總IgE 水平，減少肥大細(xì)胞活化。