林柳任，竇 晨，張 昆，王 葳，鄭永仁，程 欣*

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500； 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)科技處，云南 昆明 650500）

惡性腫瘤（即癌癥） 是嚴(yán)重威脅我國居民生命健康的重大疾病之一［1-2］。目前常見的治療手段為化療、放療、微創(chuàng)治療等，但易引起全身性的不良反應(yīng)，使得臨床療效常不盡人意。羥基喜樹堿是一種活性生物堿，常用于治療膀胱癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥，但因其難溶于水、半衰期短、副作用大等問題影響臨床療效［3-5］。為解決上述缺陷，研究者們?cè)诓挥绊懟钚缘幕A(chǔ)上將其制成多種劑型。包載液態(tài)氟碳（liquid fluorocarbon，PFP） 的納米粒，近年來常作為藥物靶向制劑用于腫瘤診療，其通過超聲靶向遞送（ultrasound mediated targeted delivery，UMTD） 技術(shù)，可通過超聲介導(dǎo)可控的釋放包載藥物，實(shí)現(xiàn)靶向及緩釋雙重作用［6-8］。課題組在前期成功制備了羥基喜樹堿納米粒，為進(jìn)一步探討羥基喜樹堿納米粒在超聲介導(dǎo)下對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的增殖活性抑制能力，本研究以鼠源性肝癌細(xì)胞H22、乳腺癌細(xì)胞4T1、人正常肝臟細(xì)胞LO2 及人源性肝癌細(xì)胞Bel-7402 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較超聲輻照前后的細(xì)胞增殖活性變化，考察自制納米粒未超聲時(shí)的安全性及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，以期為超聲介導(dǎo)藥物體內(nèi)靶向治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Discovery 電子分析天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］； 4750E 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國NuAire 公司）； DMil LED 倒置顯微鏡（德國Leica 公司）； L550 型臺(tái)式離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； HH-2 型恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）； SW-CJ-1FD 型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； Multiskan 酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； DP-50 型便攜式超聲診斷儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.2 藥物與試劑 羥基喜樹堿（純度≥99%，彭州市茂源生物科技有限公司，批號(hào)170401）； 羥基喜樹堿注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)19010510）； 1640 培養(yǎng)基、FBS （胎牛血清）、青霉素-鏈霉素（雙抗）、0.25%EDTA-胰蛋白酶 （以色列Bioland 公司，批號(hào)0010120、2001003、2017039、0055019）； 噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO） （北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)30975057、D8370）； MTS 細(xì)胞增殖試劑盒（美國Promega 公司，批號(hào)394203）。

1.3 細(xì)胞 鼠源性肝癌細(xì)胞（H22）、鼠源性乳腺癌細(xì)胞（4T1）、人源性肝癌細(xì)胞（Bel-7402） 由華中科技大學(xué)贈(zèng)予，云南中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室傳代培養(yǎng)得； 人正常肝細(xì)胞（LO2） 由云南白藥公司藥物實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予，云南中醫(yī)藥大學(xué)藥物分析教研室傳代培養(yǎng)得。

2 方法

2.1 羥基喜樹堿納米粒的制備 羥基喜樹堿納米粒的制備方法同前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9］。

2.2 羥基喜樹堿原藥、注射液及納米粒的制備 分別精密稱取適量羥基喜樹堿原藥、注射液及納米粒于10 mL 離心管中，加入少量DMSO 溶液搖勻后，以含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋即得不同質(zhì)量濃度的羥基喜樹堿各制劑。

2.3 細(xì)胞超聲條件 超聲條件為FH 8.5M，D 3.7，G 66，F(xiàn)R 23，IP 5，DR 100，MI 0.2，焦點(diǎn)位置2。超聲方式為將超聲探頭垂直對(duì)準(zhǔn)96 孔板底部，其間用耦合膠填充隔絕空氣干擾，進(jìn)行間歇式超聲，每孔超聲8 min，暫停1 min，重復(fù)2 次后，最后1 次超聲7 min，共超聲25 min。

2.4 細(xì)胞超聲輻照損傷實(shí)驗(yàn) 超聲組，取對(duì)數(shù)期生長的H22 細(xì)胞、4T1 細(xì)胞、LO2 細(xì)胞、Bel-7402 細(xì)胞，分別按照每孔1×104、5×103、1×104、1×104個(gè)的密度接種于96 孔板中（100 μL），每種細(xì)胞設(shè)置10 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后外部添加超聲輻照，Bel-7402 細(xì)胞、4T1 細(xì)胞和LO2 細(xì)胞繼續(xù)孵育24、48 h 后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，輕微振搖10 min 溶解甲臜顆粒，于酶標(biāo)儀490 nm 波長處檢測(cè)光密度（OD） 值； H22 細(xì)胞分別孵育24、48 h 后每孔加入20 μL MTS 溶液，繼續(xù)孵育1 h 后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測(cè)定OD 值。未超聲組，除不添加超聲外，其余條件與超聲組相同。超聲刺激后細(xì)胞損傷率計(jì)算公式為細(xì)胞損傷率＝［（OD未超聲組-OD超聲組） /OD未超聲組］ ×100%。

2.5 H22 細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的H22、4T1、LO2 細(xì)胞，胰酶消化并離心，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，每孔100 μL 接種至96 孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后待細(xì)胞貼壁。超聲組分別給予100 μL 不同質(zhì)量濃度的羥基喜樹堿原藥、注射液及納米粒（羥基喜樹堿質(zhì)量濃度均為 800、400、200、100、50、25、5、1 μg/mL），并設(shè)置陰性組（含細(xì)胞，不含羥基喜樹堿）、空白組（不含細(xì)胞，不含羥基喜樹堿）、背景組（不含細(xì)胞，含羥基喜樹堿），按“2.3” 項(xiàng)下條件外部添加超聲輻照；未超聲組除不添加超聲外，其余條件相同，2 組實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3 次。分別培養(yǎng)24、48 h 后，每孔加入20 μL MTS 溶液，繼續(xù)孵育1 h 后，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測(cè)定OD 值，計(jì)算單組細(xì)胞存活率，公式為細(xì)胞存活率＝ ［（OD實(shí)驗(yàn)組-OD背景組） / （OD陰性組-OD空白組）］ ×100%。

2.6 4T1、LO2 細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的4T1、LO2 細(xì)胞，胰酶消化并離心，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104、1×105/mL，每孔100 μL 接種至96 孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后待細(xì)胞貼壁。超聲組分別給予100 μL 不同質(zhì)量濃度的羥基喜樹堿原藥、注射液及納米粒（羥基喜樹堿質(zhì)量濃度均為800、400、200、100、50、25、5、1 μg/mL），并設(shè)置陰性組（含細(xì)胞，不含羥基喜樹堿）、空白組（不含細(xì)胞，不含羥基喜樹堿），按“2.3” 項(xiàng)下條件外部添加超聲輻照； 未超聲組除不添加超聲外，其余條件相同，2 組實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3 次。分別培養(yǎng)24、48 h 后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h 后，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，輕微振搖10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測(cè)定OD 值，計(jì)算單組細(xì)胞存活率，公式為細(xì)胞存活率＝ ［（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組） /（OD陰性組-OD空白組）］ ×100%。

2.7 Bel-7402 細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的Bel-7402 細(xì)胞，胰酶消化并離心，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，每孔100 μL 接種至96 孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后待細(xì)胞貼壁。超聲組分別給予100 μL 不同質(zhì)量濃度的羥基喜樹堿原藥、注射液及納米粒（羥基喜樹堿質(zhì)量濃度均為800、400、200、100、50、25 μg/mL），其余步驟及細(xì)胞存活率的計(jì)算方法同“2.6” 項(xiàng)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 超聲輻照對(duì)細(xì)胞損傷率的影響 如圖1 所示，4 種細(xì)胞超聲24、48 h 后OD 值無明顯變化（P＞0.05），細(xì)胞損傷率均＜2%，表明超聲過程引起的細(xì)胞損傷較小。

圖1 超聲前后4 種細(xì)胞OD 值變化（±s，n＝10）

3.2 不同羥基喜樹堿制劑對(duì)H22 細(xì)胞增殖活性的影響 如圖2 所示，隨著藥物劑量的增加，不同羥基喜樹堿制劑對(duì)H22 細(xì)胞的增殖抑制作用增加。未超聲條件下納米粒組細(xì)胞存活率＞64%，且在800～25 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與羥基喜樹堿原藥組、注射液組比較，細(xì)胞存活率升高（P＜0.05），安全性較好。超聲48 h 后，在100、5、1 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與羥基喜樹堿原藥組、注射液組比較，納米粒組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算，未超聲時(shí)羥基喜樹堿原藥、注射液及納米粒的IC50值分別為（124.70±9.47） μg/mL、（94.32±9.53） μg/mL、（4.50±1.22）mg/mL； 超聲輻照24 h 后，IC50值分別為（76.08±9.81）、（60.95±3.57）、（82.98±6.09） μg/mL； 超聲輻照48 h 后，IC50值分別為（55.94±8.65）、（34.91±2.40）、（32.75±4.51） μg/mL，表明超聲后納米粒抑制H22 細(xì)胞增殖活性的作用增強(qiáng)。

圖2 超聲前后3 種羥基喜樹堿制劑對(duì)H22 細(xì)胞增殖活性的影響（±s，n＝3）

3.3 不同羥基喜樹堿制劑對(duì)4T1 細(xì)胞增殖活性的影響 如圖3 所示，隨著藥物劑量的增加，不同羥基喜樹堿制劑對(duì)4T1 細(xì)胞的增殖抑制作用增加。未超聲條件下納米粒組細(xì)胞存活率＞50%，且在800 ～5 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與羥基喜樹堿原藥組、注射液組比較，細(xì)胞存活率提升（P＜0.05），安全性較好。超聲48 h 后，在400～50 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與羥基喜樹堿原藥組、注射液組比較，納米粒組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算，未超聲時(shí)羥基喜樹堿原藥組、注射液組及納米粒組的IC50值分別為（92.33±4.04）、（34.66±2.81）、（796.88±2.14） μg/mL；超聲輻照24 h 后，IC50值分別為（29.92±4.63）、（29.09±2.14）、（29.87±0.13） μg/mL； 超聲輻照48 h 后，IC50值分別為（26.01±1.14）、（22.50±6.99）、（19.88±0.17）μg/mL，表明超聲后納米粒抑制4T1 細(xì)胞增殖活性的作用增強(qiáng)。

圖3 超聲前后3 種羥基喜樹堿制劑對(duì)4T1 細(xì)胞增殖活性的影響（±s，n＝3）

3.4 不同羥基喜樹堿制劑抗Bel-7402 細(xì)胞增殖活性的影響 如圖4 所示，隨著藥物劑量的增加，不同羥基喜樹堿制劑對(duì)Bel-7402 細(xì)胞的增殖抑制作用增加。未超聲條件下納米粒細(xì)胞存活率＞62%，安全性較好。超聲48 h 后，在100～25 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與羥基喜樹堿原藥組、注射液組比較，納米粒組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算，未超聲時(shí)羥基喜樹堿原藥組、注射液組及納米粒組的IC50值分別為（1.82±0.11） mg/mL、（192.32±10.37）μg/mL、（2.56±0.65） mg/mL； 超聲輻照24 h 后，IC50值分別為（179.78±10.48）、（116.34±2.52）、（128.50±11.49） μg/mL； 超聲輻照48 h 后，IC50值分別為（166.12±6.24）、（111.12±0.71）、（69.68±10.92） μg/mL，表明超聲后納米粒抑制Bel-7402 細(xì)胞增殖活性的作用增強(qiáng)。

圖4 超聲前后3 種羥基喜樹堿制劑對(duì)Bel-7402 細(xì)胞增殖活性的影響（±s，n＝3）

3.5 不同羥基喜樹堿制劑抗LO2 細(xì)胞增殖活性的影響 如圖5 所示，未超聲時(shí)羥基喜樹堿原藥及注射液對(duì)LO2 細(xì)胞增殖抑制作用較強(qiáng)，IC50值分別為 （253.74 ± 6.85）、（33.79±4.71） μg/mL，存在一定的肝毒性作用； 而納米粒組IC50值為（1.95±0.11） mg/mL，不同質(zhì)量濃度納米粒組細(xì)胞存活率均＞60%，且在800～5 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與羥基喜樹堿原藥組及注射液組比較，細(xì)胞存活率升高（P＜0.05），表明未超聲下納米粒對(duì)人正常肝細(xì)胞增殖抑制作用較弱。超聲輻照24 h 后，所有組的細(xì)胞存活率均有不同程度的降低，羥基喜樹堿原藥組、注射液組及納米粒組的IC50值分別為（60.77±7.73）、（19.87±2.31）、（30.07±0.51） μg/mL。超聲至48 h 后，在50 ～1 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與羥基喜樹堿原藥組及注射液組比較，納米粒組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），此時(shí)羥基喜樹堿原藥組、注射液組及納米粒組的IC50值分別為 （54.67 ± 9.65）、（19.58±0.38）、（11.94±1.18） μg/mL，表明超聲后納米粒抑制LO2 細(xì)胞增殖活性的作用增強(qiáng)。

圖5 超聲前后3 種羥基喜樹堿制劑對(duì)LO2 細(xì)胞增殖活性的影響（±s，n＝3）

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)許多抗癌藥的細(xì)胞毒性嚴(yán)重影響了臨床使用療效［10-11］。隨著醫(yī)學(xué)影像技術(shù)發(fā)展，超聲分子水平的治療逐漸成為研究熱點(diǎn)，包載PFP 的納米粒在外部添加超聲輻照下，會(huì)發(fā)生液-氣相轉(zhuǎn)變 （acoustic droplet vaporization，ADV），實(shí)現(xiàn)局部釋藥并增加組織或細(xì)胞對(duì)藥物的攝取［12-15］。

本研究使用的超聲設(shè)備具有非侵入性、安全有效的特點(diǎn)［16］。其中頻率和機(jī)械指數(shù)是影響超聲空化效應(yīng)及促使納米粒相變的主要參數(shù)［17-18］。前期研究發(fā)現(xiàn)，較高頻率和較低的機(jī)械指數(shù)能實(shí)現(xiàn)納米粒體外超聲破乳。

超聲輻照損傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本研究超聲條件具有作為體外細(xì)胞超聲來源的潛能。通過細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)中不同羥基喜樹堿制劑對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞的IC50值比較發(fā)現(xiàn)，外部未添加超聲輻照時(shí)，納米粒對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用均低于羥基喜樹堿原藥及其注射液，尤其與H22 細(xì)胞及Bel-7402 細(xì)胞孵育后，存活率＞60%，證實(shí)了納米粒對(duì)鼠源性或人源性肝癌細(xì)胞在未超聲輻照時(shí)均具有一定的安全性與可控性。此外，LO2 細(xì)胞活力的下降常預(yù)示體外肝毒性的發(fā)生［19］。在與其余肝癌細(xì)胞組比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)羥基喜樹堿制劑對(duì)LO2 細(xì)胞仍存在一定的肝毒性。在高濃度時(shí)（＞200 μg/mL），LO2 細(xì)胞存活率低于H22 細(xì)胞和Bel-7402 細(xì)胞，但在低于200 μg/mL 質(zhì)量濃度時(shí)，其細(xì)胞存活率與H22 細(xì)胞和Bel-7402 細(xì)胞接近，猜測(cè)未超聲下較高質(zhì)量濃度的納米粒可能更容易被正常肝細(xì)胞攝取。但與同組其他羥基喜樹堿制劑比較，納米粒組細(xì)胞存活率遠(yuǎn)高于其余2 種制劑組，說明羥基喜樹堿制備成納米粒后，在未超聲時(shí)安全性具有一定提升。有研究證實(shí)，超聲輻照除能引起微泡破裂外，還能提高細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)內(nèi)吞、增加細(xì)胞間隙等生物學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致靶細(xì)胞攝取藥物增加，從而增強(qiáng)藥物的治療效果［20］。當(dāng)外部添加超聲輻照24 h 后，納米粒與4組細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞增殖抑制能力得到提升，與其余2種羥基喜樹堿制劑組比較，納米粒在4 種細(xì)胞中的增殖抑制性排列順序均為羥基喜樹堿注射液＞羥基喜樹堿納米粒＞羥基喜樹堿原藥。隨著超聲時(shí)間增加至48 h，納米粒在4種細(xì)胞中增殖抑制能力變?yōu)榱u基喜樹堿納米粒＞羥基喜樹堿注射液＞羥基喜樹堿原藥，表明超聲48 h 后納米?？辜?xì)胞增殖活性能力優(yōu)于羥基喜樹堿注射液及其原藥。以上結(jié)果表明，納米粒在本實(shí)驗(yàn)超聲條件下具有緩釋作用，可以改善藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積并逐步增強(qiáng)抗腫瘤活性。

綜上所述，羥基喜樹堿納米粒未經(jīng)超聲時(shí)具有一定的生物安全性，超聲后則具有較好的治療作用，有望開發(fā)一種超聲介導(dǎo)下釋放藥物的治療模式，為后續(xù)進(jìn)一步研究體內(nèi)釋藥規(guī)律提供了一定的依據(jù)。本研究尚有一定的局限，雖證實(shí)了超聲能引起納米粒相變，從而使納米粒“爆破”釋放羥基喜樹堿發(fā)揮抗細(xì)胞增殖作用，但超聲過程中除不引起細(xì)胞死亡外是否還會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生其他不良影響還需進(jìn)一步研究。